Сиволоб. Молекулярна біологія

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

Реплікон

Реплікація ДНК починається з невеликої ділянки – ориджина (origin), де здійснюється ініціація процесу, головним моментом якої є розходження ланцюгів ДНК. Далі по ходу реплікації такий реплікативний міхур (рис. 9.1) розростається у двох протилежних напрямках. На кожному боці міхура існує так звана реплікативна вилка, у основі якої й відбувається синтез ДНК. Ділянку ДНК, де здійснюється реплікація, що розпочинається з однієї точки, називають репліконом. Бактеріальна хромосома, і зокрема в E. coli, часто містить тільки один ориджин, являє собою єдиний реплікон. У деяких бактерій може бути два реплікони на хромосому. Еукаріотична хромосома є полірепліконом – вона містить велику кількість точок ініціації.

Ланцюг, що запізнюється – фрагменти Оказакі

Рис. 9.1. Реплікативний міхур – дві реплікативні вилки, що переміщуються у протилежних напрямках

(ланцюги, які синтезуються, показано тільки для однієї з них)

У кожній реплікативній вилці працюють дві молекули ДНК-поліме- рази, що здійснюють синтез двох полінуклеотидних ланцюгів. Оскільки два ланцюги є антипаралельними (див. розділ 3), і синтез відбувається тільки в напрямку від 5'- до 3'-кінця, синтез тільки одного з ланцюгів може відбуватися (і відбувається) безперервно, починаючись від ориджина (рис. 9.1). Цей ланцюг називають лідируючим (leading strand), його 3'-кінець розташований поблизу від основи реплікативної вилки.

276

Розділ 9. Реплікація ДНК

Синтез іншого ланцюга розпочинається від реплікативної вилки: синтезуються окремі фрагменти – так звані фрагменти Оказакі (Reiji Okazaki), які пізніше з'єднуються між собою (див. нижче). Довжина фрагмента Оказакі при реплікації у бактерій дорівнює 1–2 тис. нуклеотидів. Для синтезу кожного із фрагментів треба спочатку звільнити відповідний простір на матричному ланцюзі – пересунути реплікативну вилку вперед (рис. 9.1), відповідно, фрагментарний ланцюг нази-

вають ланцюгом, що запізнюється (lagging strand). Середня швидкість реплікації на одну реплікативну вилку становить ~750 нуклеотидів за секунду в бактерій, 60–90 нуклеотидів за секунду в еукаріотів. Синтез бактеріальної хромосоми відбувається за ~50 хвилин, повна реплікація ДНК еукаріотичної клітини – за кілька годин.

Рис. 9.2. Реплікація еукаріотичної хромосоми

У більшості репліконів реплікація здійснюється таким чином, як зображено на рис. 9.1 – в обох напрямках. Сусідні реплікони еукаріотичної хромосоми врешті-решт “зустрічаються”, і в результаті утворюються дві копії ДНК хромосоми (рис. 9.2). Циркулярна бактеріальна хромосома також реплікується у двох напрямках з утворенням ідентичних циркулярних молекул ДНК (рис. 9.3). Аналогічно реплікуються окремі автономні реплікони бактерій – циркулярні плазміди. Для деяких із них реплікація відбувається тільки в одному напрямку: в ориджині формується лише одна реплікативна вилка, яка рухається навколо кільця до вихідної точки.

Особливий випадок – реплікація циркулярних ДНК за механізмом кільця, що котиться (rolling circle), який реалізується для ДНК бактеріофагів та деяких плазмід. Один із варіантів такого механізму (для бактеріофага λ) показано на рис. 9.4. В одному з ланцюгів циркулярної ДНК індукується одноланцюговий розріз, 3'-кінець, що утворився, добудовується з використанням інтактного циркулярного ланцюга як матриці. Продовження цього процесу створює довгий одноланцюго-

277

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

вий 5'-кінцевий хвіст, що складається з тандемних повторів – копій кільцевої молекули. Кожен із цих повторів використовується як матриця для синтезу іншого ланцюга. Після цього лінійні дволанцюгові фрагменти вирізаються та упаковуються до частинок бактеріофага.

Рис. 9.3. Реплікація циркулярної бактеріальної хромосоми

3'

5'

5'

3'

5'

Рис. 9.4. Реплікація циркулярної ДНК бактеріофага λ

278

Розділ 9. Реплікація ДНК

ДНК-полімераза

У клітині E. coli працюють ДНК-полімерази трьох основних типів. Усі вони мають дві ферментативні активності: власне полімеразну, за рахунок якої до 3'-кінця ланцюга, що синтезується, приєднуються нуклеотиди, і 3'-екзонуклеазну, яка використовується для редагування помилок – відщеплення помилкових нуклеотидів, щойно приєднаних до 3'-кінця.

•ДНК-полімераза І (або полімераза Корнберга (Arthur Kornberg)) – мономерний білок із мультидоменною структурою. На відміну від інших ДНК-полімераз вона має також додаткову 5'-екзо- нуклеазну активність. ДНК-полімераза І використовується як допоміжна полімераза при реплікації (див. нижче) та інших процесах синтезу ДНК.

•ДНК-полімераза ІІ залучена до певних репараційних процесів.

•ДНК-полімераза ІІІ – основна реплікативна полімераза, дві копії якої працюють у реплікативній вилці. Складається з трьох субодиниць: субодиниця α відповідає за полімеразну активність, ε – за 3'-екзонуклеазну, θ – виконує структурну роль.

Структура ДНК-полімерази й полімеразна реакція

Структуру основної частини ДНК-полімерази І – так званий фрагмент Кленова (Hans Klenow) – показано на рис. 9.5 (додатковий домен полімерази відповідає за 5'-екзонуклеазну активність). Подібну структуру мають більшість інших прота еукаріотичних ДНК-полімераз. Полімеразний активний центр розташований у межах долоні (palm) – щілини, яка оточена двома характерними структурними доменами: рухли-

вими пальцями (fingers) і великим пальцем (thumb). Великий палець взаємодіє з маленьким жолобком подвійної спіралі, утвореної матричним ланцюгом і таким, що синтезується. Пальці взаємодіють із матричним ланцюгом, який при цьому трохи вигинається навкруг пальців, експонуючи чергову азотисту основу для взаємодії з NTP. Сайт зв'язування NTP утворюється пальцями, залишками активного центру, нуклеотидом матричного ланцюга та 3'-кінцем ланцюга, що синтезується. Рухливість пальців дозволяє їм існувати у двох конформаціях:

279

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

•Відкрита передбачає рух полімерази вздовж ДНК і швидкий перебір NTP.

•Закрита, коли пальці переміщуються в напрямку до великого пальця, жорстко фіксуючи NTP у активному центрі та забезпечуючи каталіз полімеразної реакції.

3'-екзонуклеазний домен

Рис. 9.5. Комплекс фрагмента Кленова ДНК-полімерази І із ДНК у полімеразному активному центрі (1L3T)

Полімеразна реакція (рис. 9.6) передбачає, що ДНК-полімераза має розташувати 3'-кінцеву ОН-групу зростаючого ланцюга в активному центрі, зв'язати NTP, за умови його комплементарності до нуклеотиду матричного ланцюга здійснити каталіз синтезу фосфодіефірного зв'язку з одночасним відщепленням пірофосфату.

фосфат

дезоксирибоза

5'

основа

Рис. 9.6. Схема ДНК-полімеразної реакції

280

Розділ 9. Реплікація ДНК

На першій стадії елонгаційного циклу відбувається зв'язування NTP (рис. 9.7). ДНК-полімераза при цьому реалізує свою відкриту конформацію, яка дозволяє швидку асоціацію / дисоціацію різних нуклеотидів. Якщо нуклеотид виявляється комплементарним матриці, з парою основ реалізуються численні взаємодії активного центру та його оточення. Це індукує конформаційну зміну в полімеразі (найповільніша лімітуюча стадія циклу) із переміщення пальців, наслідком чого є фіксація NTP у активному центрі (рис. 9.8) і нерухомість полімерази відносно ДНК. На третій стадії здійснюється каталіз реакції. Після приєднання нуклеотиду відбувається дисоціація пірофосфату й розмикання полімерази. Оскільки утворився новий продовжений 3'-кінець, який має спорідненість до активного центру, на останній стадії здійснюється транслокація – переміщення полімерази в її відкритій формі на один нуклеотид уздовж матриці.

NTP пальці

DNAP

Рис. 9.7. Елонгаційний цикл ДНК-полімерази

Рис. 9.8. Нуклеозидтрифосфат (СТР) та іон Mg2+ (фіолетовий) в активному центрі ДНК-полімерази (1LV5).

Матричний ланцюг синій, зростаючий – червоний

Принципова схема елонгаційного циклу ДНК-полімерази практично не відрізняється від такої РНК-полімерази (див. розділ 5). Механізм каталізу ДНК-полімеразної реакції також є цілком аналогічним: ключову роль у каталізі виконують два іони Mg2+, що утримуються в активному центрі трьома залишками Asp.

281

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

Редагування помилок

Упізнання комплементарної пари основ активним центром ДНК-полі- мерази перед здійсненням каталізу полімеразної реакції забезпечує частоту помилкового включення нуклеотидів на рівні ~10–5 (основне джерело помилок – таутомерія азотистих основ, див. рис. 5.11). Оскільки ДНК синтезується “раз і назавжди” перед її передачею нащадкам, такий рівень помилок не може вважатися задовільним. Відповідно, ДНК-полімерази реалізують ефективний механізм редагування, використовуючи свій 3'-екзонуклеазний активний центр (рис. 9.9).

Рис. 9.9. Редагування помилок: схематичний вид “зверху” на ДНК-полімеразу (див. рис. 9.5)

Два каталітичні центри, розташовані на відстані до 30 Å, конкурують за 3'-кінець ланцюга, що синтезується. Якщо внаслідок приєднання помилкового нуклеотиду утворилася некомплементарна (нестабільна) пара основ, її спорідненість до полімеразного центру знижується, і 3'-кінець переміщується до екзонуклеазного центру. Подвійна спіраль ДНК при цьому прокручується навколо своєї осі, зберігаючи взаємодії маленького жолобка з великим пальцем, а ДНК-полімераза залишається у відкритій конформації. Помилковий нуклеотид відщеплюється, унаслідок чого відновлюється стабільність кінцевої пари основ. За рахунок більш високої спорідненості стабільної пари до полімеразного центру, 3'-кінець повертається туди, і ДНК-полімераза здійснює нову спробу його подовження.

282

Розділ 9. Реплікація ДНК

У результаті такої осциляції полімерази з перемиканням активності між двома центрами рівень помилок знижується до ~10–8. Остаточний рівень помилок знижується до ~10–10 за рахунок активності систем репарації.

Особливості ДНК-полімерази в порівнянні з РНК-полімеразою

Незважаючи на високу подібність базових механізмів роботи двох типів полімераз, що здійснюють синтез нуклеїнових кислот, існують принципові відмінності між ними. Головна особливість полягає в тому,

що для ДНК-полімерази ДНК є одночасно й матрицею, і продуктом реакції, і це створює суттєві проблеми.

Оскільки при синтезі РНК в активному центрі РНК-полімерази тимчасово існує гібридна подвійна спіраль ДНК-РНК (див. розділи 5, 6), РНК-полімераза може легко дискримінувати гібрид від звичайної подвійної спіралі ДНК. Висока спорідненість оточення активного центру РНК-полімерази до гібрида та каналу виходу транскрипту до РНК забезпечує високу процесивність ферменту – здатність працювати без дисоціації після однократного акту ініціації транскрипції. ДНК-полі- мераза має подвійну спіраль ДНК як у оточенні свого активного центру, так і скрізь поза полімеразним комплексом. Відповідно, існує висока ймовірність її дисоціації: процесивність ДНК-полімерази є дуже низькою – вона може синтезувати до дисоціації лише ділянку довжиною 10–20 нуклеотидів. Отже, має існувати певний додатковий механізм підвищення процесивності.

Висока спорідненість РНК-полімерази до гібрида ДНК-РНК дозволяє легко руйнувати подвійну спіраль ДНК по ходу руху полімерази при елонгації транскрипції – транскрипт просто витісняє нематричний ланцюг ДНК із дуплекса. Для ДНК-полімерази такий механізм є неможливим: дуплекси ДНК у комплексі з полімеразою та попереду від неї нічим не відрізняються один від одного, тобто ДНК-полімераза потребує наявності одноланцюгової матричної ДНК, яка має бути вилучена з подвійної спіралі.

Третя проблема полягає в тому, що ДНК-полімераза здатна робити тільки одну операцію – продовжувати (редагуючи) 3'-кінець ланцюга ДНК, вона не може ініціювати синтез, створити перший фосфодіефірний зв'язок. Це означає, що певна коротка ділянка має бути створена якось інакше, щоб далі ДНК-полімераза могла продовжувати її синтез. Таку ділянку, без якої неможлива робота ДНК-полімерази, називають праймером (primer). Насправді, кор-фермент РНК-полімерази

283

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

також не здатен ініціювати синтез РНК: первинний короткий транскрипт синтезується лише за участі факторів ініціації, які допомагають додатково зафіксувати перші нуклеотиди в активному центрі (див. розділи 5, 6). При синтезі ДНК було знайдено інше еволюційне рішення: роль праймера виконує коротка ділянка РНК, що синтезується специфічною ДНК-залежною РНК-полімеразою – праймазою. Використання саме РНК у ролі праймера на початку синтезу ДНК має важливе значення для підвищення точності синтезу. Короткі первинні ділянки неможливо синтезувати з дуже високою точністю. На подальших етапах реплікації РНК-праймери можна легко відрізнити від ДНК, вилучити та заповнити прогалини між сусідніми ділянками ДНК за допомогою ДНК-полімерази.

Отже, ДНК-полімераза є хоч і головним, але не достатнім елементом системи реплікації. У реплікативній вилці працює складний мультибілковий комплекс – реплісома, до якого крім двох молекул ДНК-полімерази входять компоненти, що забезпечують розплітання ДНК, підвищення процесивності та виконують інші важливі допоміжні операції.

Реплісома та інші елементи системи реплікації

Геліказа й білки SSB

Операція розплітання подвійної спіралі (тобто утворення реплікативної вилки) здійснюється ДНК-геліказами – АТР-залежні ферменти цього типу вже згадувались у зв'язку з транскрипцією та сплайсингом (розділи 6, 7).

Основною реплікативною геліказою бактерій є білок DnaB – кільцевий комплекс шести однакових субодиниць (рис. 9.10). У каналі всередині кільця розміщується один полінуклеотидний ланцюг, уздовж якого відбувається транслокація гексамеру в напрямку 5'-3' (тобто по ланцюгу, що запізнюється – рис. 9.11), що й призводить до руйнування подвійної спіралі.

Шість субодиниць гелікази мають сайти зв'язування АТР, де відбувається його гідроліз. Структурні перебудови у відповідь на зв'я- зування та гідроліз АТР змінюють інтерфейс взаємодії з одноланцюговою ДНК, що й приводить до транслокації – на три-п’ять нуклеотидів за один акт гідролізу АТР.

284