6 курс / Медицинская реабилитация, ЛФК, Спортивная медицина / Физиотерапия, лазерная терапия / Пути_практического_использования_интенсивного_теплолечения_Сувернев

массы тела. Однако эффект лечения на уровни РНК ВИЧ и CD4+ был скоропроходящим. Две последовательные процедуры гипертермии были также применены у четырех пациентов, получавших ингибиторы протеазы, – тритерапию. У этих пациентов отмечено улучшение показателей РНК ВИЧ и CD4+ и нормализация общего состояния.

Данные исследований свидетельствуют о том, что клиническое применение гипертермии может снижать уровень вирусной нагрузки, однако доступный температурный диапазон 41–42 °С недостаточен для выраженного эффекта на уровень виремии, а сложность и побочные эффекты экстракорпоральных методик еще более ограничивают применение ОГ у ВИЧ-инфицированных.

Похожие исследования в разное время проводились и при исследовании ретровирусов мышей, коров, обезьян и кошек. Например, исследование Moore et al. [1996], направленное на изучение лактогенного пути передачи вируса иммунодефицита коров, показало, что 30-минутная экспозиция ВИК-инфицированных клеток в культуре и в молоке при 47 °С приводит к невозможности данных клеток инициировать инфекцию in vitro. Свободный внеклеточный вирус также быстро инактивировался при данной температуре. Авторы отмечают, что хотя температуры менее 47 °С и экспозиции менее 30 мин не исследовались, есть предпосылки для того, чтобы утверждать, что вирус иммунодефицита коров инактивируется и в более мягких температурных условиях.

3.4. Результаты собственных исследований теплового воздействия на ВИЧ-инфекцию

В АНО СибНИИГ с целью протокольного изучения влияния теплолечения на ВИЧ-инфекцию было проведено 150 процедур пиковой гипертермии у 30 добровольцев, страдающих ВИЧ-ин- фекцией стадий III и IVА (по классификации В. Покровского).

Стадия III диагностирована у 87% пациентов (26 человек), стадия IVА – у 13% (4 человека). Процедуры проводились по схеме: три процедуры с периодичностью одна процедура раз в 4–7 дней; четвертая процедура через 2 месяца после третьей; пятая процедура через 6 месяцев после четвертой процедуры.

Оценка эффективности метода пиковой гипертермии в лечении ВИЧ

Всем участникам биомедицинского исследования перед началом лечения было проведено исследование иммунитета (измерялся уровень CD4+ лимфоцитов) и вирусной нагрузки.

81

Определение РНК ВИЧ-1 (канд. биол. наук Гашникова Н.М). Одним из наиболее чувствительных методов определения провирусной ДНК и РНК ВИЧ-1 является полимеразная цепная реак-

ция (ПЦР).

Выделение суммарной клеточной ДНК. Концентрированные отмытые периферические мононуклеарные клетки крови ресуспендируются в лизисном буфере, содержащем протеиназу K. Лизис клеток проводится при температуре 56 °С в течение 3 ч либо при 37 °С в течение ночи. Затем лизат инкубируется 15 мин. При 90 °С для инактивации протеиназы K проводится очистка ДНК фенолом, смесью фенол–хлороформ с последующим переосаждением ДНК этанолом.

РНК для РНК-GWH выделяется по методу Chromczynski (Chromczynski, Sacchi, 1987). К исследуемому образцу добавляется 5V GuSCN/фенольного буфера для экстракции tРНК, тщательно перемешивается. Разделение фаз производится после добавления хлороформа центрифугированием при 13 000 prm в течение 10 мин. РНК осаждается из верхней фазы с помощью изопропанола и растворяется в воде, обработанной диэтилпирокарбонатом.

При выделении нуклеиновых кислот из клинических образцов параллельно проводится выделение ДНК и РНК из образцов с известной концентрацией нуклеиновых кислот (внутренний контроль процедуры выделения).

Для оценки содержания нуклеиновых кислот в исследуемых образцах используются стандартные пары праймеров, их структура указана в табл. 5.

Полимеразная цепная реакция для оценки ДНК ВИЧ-1 в препарате (ДНК–ПЦР). Для оценки количественного содержания провирусной ДНК в образцах с высоким содержанием нуклеиновых кислот проводится одноступенчатая ПЦР. При этом для повышения

Таблица 5

Первичная структура олигонуклеотидных праймеров (ВИЧ-1), используемых в работе

82

достоверности результата используются пары праймеров на разные области генома вируса. Параллельно проводится ПЦР с теми же праймерами на геномную ДНК. В качестве матрицы используются 10-кратные разведения суммарной ДНК, выделенной из исследуемого образца. Количество копий ДНК в препарате оценивается по соотношению амплификаторов-фрагментов исследуемой провирусной ДНК и аналогичных фрагментов ДНК-стандартов (с известной концентрацией ДНК). Качество выделения препарата ДНК проверяется также параллельной постановкой ПЦР на область β-глобино- вого гена (геномная ДНК) при предельных разведениях матрицы. Для оценки содержания провирусной ДНК в образцах с низким содержанием вирусной ДНК проводится два раунда ПЦР с использованием коммерческих праймеров GPI–GPII, внешних, GPIII–GPIV, внутренних (фирма «Биолат», Россия). При этом в качестве матрицы для второго раунда амплификации используются разведения аликвоты амплификата, полученного после первого раунда ПЦР. Параллельно аналогичные процедуры проводят с препаратом-стан- дартом с известной концентрацией ДНК.

Для количественной оценки РНК ВИЧ-1 в исследуемых образцах после выделения РНК из сыворотки крови проводится синтез ДНК-копии с РНК, выделенной из исследуемого образца. Также проводится аналогичная процедура для РНК-стандарта с известной концентрацией. После получения ДНК-копии выполняются процедуры по количественному определению ДНК ВИЧ-1, как описано ранее (ДНК–ПЦР). И синтез ДНК-копии ВИЧ-1, и полимеразная цепная реакция проводятся с использованием набора GeneAmp RNA PCR kit фирмы Perklin Elmer, Roche (USA). Используемые генно-инженерные РНК-стандарты также входят в комплектацию данного набора.

Достоверность результата оценивается по воспроизводимости данных в трех независимых повторах экспериментов.

Методом ПЦР проводился анализ образцов периферической крови пациентов на содержание нуклеиновых кислот ВИЧ-1. Для выявления вирусной РНК и количественной оценки использовали АмплиСенс ВИЧ Монитор.

Результаты

Влияние пиковой гипертермии на показатели CD4 исследовали после трех процедур, перед 4-й процедурой и перед 5-й процедурой. Также обращали внимание на субъективные ощущения пациентов (в динамике между 3-й и 4-й процедурами). Практически все пациенты отмечали общее улучшение самочувствия, снижение утомляемости, повышение работоспособности и улучшение аппетита.

83

При объективном осмотре у 4 человек (стадия IVA) до теплового лечения наблюдалось увеличение подмышечных лимфатических узлов до 1,5 см в диаметре, после проведенных трех процедур лимфоузлы уменьшились в размерах, а через два месяца пальпаторно не определялись.

Как видно из табл. 6, в первые сутки после пиковой гипертермии количество CD4+ лимфоцитов незначительно снизилось, но

Таблица 6

Изменение количества CD4+ лимфоцитов после теплового воздействия

84

на вторые сутки после 3-й процедуры оно увеличилось на 20 % выше исходного, а после 4-й процедуры – на 45% от исходного уровня. У нескольких пациентов был отслежен уровень CD4+ лимфоцитов между 3-й и 4-й процедурами, он был на 25–30% выше исходного.

Динамика вирусной нагрузки в сыворотке крови отражена в табл. 7.

Таблица 7

Влияние пиковой гипертермии на вирусную нагрузку в крови, определяемую методом ПЦР (копий РНК ВИЧ-1 в мл сыворотки)

85

К 5-й процедуре у 29 пациентов было отмечено снижение вирусной нагрузки на 91–100%, и у одного пациента снижение составило 74% (рис. 21).

86

Глава 4

КЛИНИЧЕСКИЕ ПРИМЕРЫ ПРИМЕНЕНИЯ ОПГ ПРИ ДРУГИХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ

4.1. Инфекционные заболевания

Гепатит С

Принимая во внимание неудовлетворительные результаты лечения гепатита С с применением современных химиотерапевтических препаратов (тяжелая переносимость, возникновение лекарственной резистентности, нестабильность ответа на лечение), нами был предложен метод интенсивного теплового лечения (ИТЛ) для борьбы с вирусным гепатитом С.

Среди 41 пациента, которым в общей сложности было проведено 92 процедуры ИТЛ по поводу гепатита С, было 29 мужчин и 12 женщин. Возраст от 18 до 49 лет. Ни один из пациентов не получал противовирусную терапию. В подавляющем большинстве случаев гепатит С был сопутствующим заболеванием при вторичном иммунодефиците различного генеза, в том числе при ВИЧ-ин- фекции, хрониосепсисе.

Диагностика вирусного гепатита С основывалась на клинических, лабораторных данных и результатах ПЦР, которые и являлись основными при постановке диагноза.

На примере пациентки П.В. (20 лет, больна около 1,5 лет) покажем динамику вирусной нагрузки после проведенных сеансов ИТЛ.

При поступлении 03.05.04 вирусная нагрузка составляла 1,25 104 копий РНК HCV на 1 мл сыворотки.

Проведено три сеанса ИТЛ.

04.05.04 – первая процедура ИТЛ. Температура 43,5 °C, экспозиция выше 43 °С – 4 мин. Через сутки после процедуры вирусная нагрузка составила 1,1 103 копий.

06.05.04 – вторая процедура ИТЛ. Температура 43,5 °С, время экспозиции выше 43 °С – 5 мин. Вирусная нагрузка через сутки – 7,2 102.

18.07.04 – третья процедура ИТЛ. Температура 43,4 °С, время экспозиции выше 43 °С – 4 мин. Вирусная нагрузка через сутки – <200 копий/мл.

Уровень вирусной РНК в сыворотке методом ПЦР определяли у 12 пациентов. Остальным 29 пациентам уровень РНК не определяли по техническим причинам.

88

Рис. 22.

Динамика вирусной нагрузки, подобная приведенной на рис.22, имела место и у других 11 пациентов. У одного пациента (жен., Е.К., 18 лет) после трех сеансов ИТЛ (43,2–43,5 °C) вирусная нагрузка снизилась лишь незначительно.

К сожалению, большинство пациентов не соблюдают рекомендации о периодическом обследовании и выпадают из нашего поля зрения. Из 41 пациента этой группы мы имели возможность наблюдать в динамике за состоянием только 10 пациентов за период до 7 лет. У всех 10 пациентов отмечалось улучшение общего состояния, нормализация функциональных показателей печени и стабилизация на низких значениях уровня вирусной нагрузки.

Приведенные нами немногочисленные наблюдения позволяют надеяться, что дальнейшие исследования по применению ИТЛ, возможно, в комплексе с антивирусными препаратами, могут существенно улучшить результаты лечения гепатита С.

4.2. Онкология

Интересующихся историческими вопросами применения гипертермических методов лечения в различных отраслях медицины

89

отсылаем к монографиям Ф.В. Баллюзека (2001, 2004), где предельно корректно рассказано о достижениях и сложностях (в том числе не медицинского характера), с которыми столкнулись исследователи и врачи-гипертермисты как в России, так и за рубежом.

Интенсивное тепловое лечение у лиц с онкологической патологией может быть использовано:

•как противорецидивное лечение после радикального удаления опухоли;

•как циторедуктивная процедура, направленная на перевод опухоли из нерезектабельного состояния в резектабельное (это применимо лишь для опухолей небольших размеров и не всех локализаций);

•как иммуностимулирующая процедура для обеспечения возможности дальнейшего проведения химио- и лучевой терапии;

•перед применением других методов воздействия на опухоль для повышения чувствительности к ним злокачественных клеток.

Применение ИТЛ с целью предотвращения рецидивов

Подвергать пациента с большим объемом опухолевой (в том числе метастатической) ткани интенсивному тепловому лечению нельзя. Дело в том, что при распаде опухоли после такой процедуры очень высока вероятность развития эндогенной интоксикации, справиться с которой бывает весьма сложно, а подчас и невозможно. Другое дело, если пациенту была проведена радикальная или условно радикальная операция по удалению критической массы опухоли. В этом случае вероятность наличия микрометастазов, для подавления которых мы и применяем интенсивное теплолечение, остается очень высокой. Использование химиотерапии малоэффективно, и процедура весьма тяжело переносится пациентом. Проводить ИТЛ следует как можно раньше после операции. В нашей практике были случаи, когда мы проводили ИТЛ через 10–12 дней после оперативного вмешательства. Приведем клинические наблюдения.

Мужчина, М.Н., 43 лет, поступил в клинику с диагнозом рабдомиосаркома большой грудной мышцы слева, состояние после частичного удаления опухоли, проведенного в январе 2003 г. В феврале 2003 г. было проведено два сеанса ИТЛ с подъемом t тела до 43,3 и 43,4 °С. В апреле 2003 г. проведена радикальная операция – удаление большой и малой грудных мышц слева, лимфаденэктомия подмышечных лимфоузлов. При гистологическом исследовании обнаружен патоморфоз опухоли «неясного» генеза. В мае

90