6 курс / Медицинская реабилитация, ЛФК, Спортивная медицина / Физиотерапия, лазерная терапия / Пути_практического_использования_интенсивного_теплолечения_Сувернев

В процессе отжига (ренатурации, ренативации) восстанавливается и каталитическая активность ферментов, инактивированных нагреванием. Длительный период, в течение которого происходит восстановление исходной структуры белка, необходим для того, чтобы дать возможность полипептидной цепи «перепробовать» многие возможные конформации, прежде чем будет найдена (путем проб и ошибок) наиболее стабильная (энергетически выгодная) из них. По мере того как каждый последующий аминокислотный остаток находит конформацию, соответствующую минимальной свободной энергии, стабильность уже свернувшейся части цепи и скорость ренатурации возрастают. Такое повышение стабильности и скорости ренатурации является результатом многих последовательных кооперативных взаимодействий.

Шапероны

Правильное сворачивание (фолдинг) полипептидных цепей некоторых белков в клетках эукариот обеспечивается специфическими белками, называемыми шаперонами, которые необходимы для эффективного формирования третичной структуры полипептидных цепей других белков, но не входят в состав конечной белковой структуры. Новосинтезированные белки после выхода с рибосом для правильного функционирования должны укладываться в стабильные трехмерные структуры и оставаться такими на протяжении всей функциональной жизни клетки. Таким образом, поддержание контроля качества структуры белка осуществляется этими специальными белками, катализирующими укладку полипептидов. Кроме укладки молекул шапероны способны «ремонтировать» неправильно скомпактифицированные белки, если их структура под влиянием каких-то внешних воздействий будет повреждена [Яровая, 2003].

Гидрофобные области образуются на внешней поверхности молекул белков, формируя полости активных центров и места контактов субъединиц мультимерных белков друг с другом и биологическими мембранами. Увеличение гидрофобности поверхности белков снижает их внутриклеточную стабильность, так как множество протеолитических ферментов гидролизуют с большой скоростью пептидные связи, образуемые гидрофобными аминокислотами или находящиеся вблизи от них.

В то же время в организме (in vivo) внутриклеточно возможна быстрая ренатурация. Это связано с выработкой в живом организме специфических белков, которые «узнают» исходную структуру

11

денатурированного белка, присоединяются к нему с помощью слабых типов связи и создают оптимальные условия для ренативации. Такие специфические белки, известные как «белки теплового шока» или «белки стресса», есть во всех клетках организма. Они выполняют также функцию транспорта полипептидных цепей через биологические мембраны и участвуют в формировании третичной и четвертичной структур белковых молекул. Эти функции белков стресса называются шаперонными. При различных видах стресса – при перегреве организма до 40–44 °С, при вирусных инвазиях, отравлениях и др. – происходит индукция синтеза таких белков.

Hsp70 – первый белок, названный шапероном. Еще одна функция шаперонов в клетке заключается в том, что они связываются с поврежденными полипептидами и помогают им принять нативную конформацию; шапероны также участвуют в доставке белков в определенные органеллы. Шапероны способны находить в полипепти- дах-мишенях гидрофобные участки, которые открыты у поврежденных белков или могут открываться у нормальных, зрелых клеточных белков в момент изменения их конформации. Подобные конформационные изменения происходят, например, вследствие каскадных модификаций белков в процессе передачи клеточного сигнала. Белки семейства Hsp70 являются одними из основных элементов систем контроля качества белков и участвуют в работе всех систем жизнеобеспечения клетки.

Шаперонную активность обычно связывают с защитной функцией Hsp70. To, что шаперон спасает клетки от огромного числа факторов, в том числе вызывающих апоптоз, было подтверждено в многочисленных опытах in vitro и in vivo с использованием широкого спектра модельных организмов, находящихся на разных ступенях эволюции.

Несмотря на огромное число исследований, посвященных различным аспектам функционирования Hsp70, нерешенным остается множество вопросов, имеющих принципиальное значение. Хотя Hsp70 и считается индуцибельным, что означает резкое возрастание его экспрессии в ответ на стресс, в клетках человека его синтез, пусть на невысоком уровне, происходит и в нормальных условиях. Надо отметить, что в разных тканях и клетках организма степень экспрессии Hsp70 различается. Например, она очень высока в тканях сердца и крайне низка (и не запускается в ответ на стресс) в некоторых типах нейронов головного мозга. Уровень экспрессии Hsp70 высок в опухолях, особенно злокачественных. В связи с этим возникает ряд вопросов. Каковы последствия высокого

12

уровня экспрессии Hsp70 в опухолевых клетках? Не ясно, каким образом нервные клетки защищаются от неблагоприятных факторов, к примеру, от формирования нерастворимых белковых агрегатов в нервных клетках головного мозга при некоторых наследственных нейродегенеративных заболеваниях, а также в клетках мозга пожилых людей.

Убиквитины

Белок выполняет закрепленную за ним функцию, а затем, в определенный момент, клетке необходимо от него избавиться. Последнее обусловлено рядом причин: например, дальнейшая активность белка может навредить клетке – нужно синтезировать новые белки, а перегрузка цитоплазмы полипептидами является источником апоптоза. Перестав быть необходимыми, белки подвергаются протеолитической деградации.

Внутриклеточную деградацию белков долгое время считали неспецифическим случайным процессом. Настоящим прорывом в данной области послужило открытие убиквитинового сигнального пути. В рамках этого пути деградации белка, которая осуществляется крупным белковым комплексом – протеасомой, предшествует присоединение к нему «цепочки» молекул небольшого пептида убиквитина. Полиубиквитиновая цепочка навешивается в строго определенный момент и является сигналом, свидетельствующим о том, что данный белок подлежит деградации [Яровая, 2003]. Теперь ясно, что процесс внутриклеточного протеолиза жестко регулируется и чрезвычайно важен для основных клеточных функций.

Среди субстратов специфического протеолиза – регуляторы клеточного цикла, компоненты различных сигнальных путей, а также мутантные и поврежденные белки.

Система внутриклеточного протеолиза вовлечена в такие процессы, как пролиферация клеток, развитие и дифференцировка, реакция на стресс и патогены, репарация ДНК. Нарушение этой сложной системы является причиной многих заболеваний.

Итак, деградация белка по убиквитиновому пути включает ковалентное присоединение к подлежащему деградации белку полиубиквитиновой цепи и деградацию белка 26S-протеасомой. Белки класса Е3 представляют собой убиквитин-лигазы, способные специфически связываться с подлежащими деградации белковыми субстратами напрямую или посредством вспомогательного белка. Е3 «узнают» в составе субстрата определенный мотив, называемый дегроном, который на уровне Е3 обеспечивает специфичность протео-

13

лиза. В связи с тем, что специфическому протеолизу подвергается огромное количество белков, вариантов Е3 в клетке особенно много. Присутствие мотива, узнаваемого Е3 (дегрона в структуре белка), говорит о том, что при его презентации этот белок обязан деградировать. Обычно дегрон бывает спрятан соответствующей нативной структурой.

Деградация белков по убиквитиновому пути представлена на рис. 6 и включает следующие этапы: (1) активация УБ УБ-активи- рующим ферментом Е1; (2) связывание активированного УБ с УБнесущим ферментом Е2; (3) образование специфического комплекса между УБ-белок-лигазой Е3 и белком; (4) перенос активированного УБ на белок без участия Е3; (5) связывание УБ с белком и формирование множественных УБ-цепей с освобождением свободного Е2; (6) деградация убиквитинированного белка 26S-протеасо-

Рис. 6. Убиквитиновый и убиквитин-протеасомный пути деградации белков, по: [Яровая, 2003].

14

мой; (7) удаление УБ из «ошибочно» убиквитинированных белков изопептидазой; (8) освобождение УБ из деградированных белков.

Первый убиквитинактивирующий фермент Е1 активирует С- терминальный остаток глицина в убиквитине перед его связыванием с белком (1). Затем еще два фермента требуются для связывания убиквитина с белком: белок-носитель убиквитина Е2, который акцептирует активированный убиквитин с Е1 путем трансацилирования (2) и затем переносит его на белковый субстрат в реакции, катализируемой убиквитин-белок-лигазой Е3 (3). Перенос убиквитина на некоторые белки, в частности гистоны, может осуществляться и без участия Е3 (4). Е3 связывает соответствующие белковые субстраты, что приводит к переносу убиквитина с Е2 на остатки аминогрупп субстрата (5). Одним из сигналов в белковых субстратах, узнаваемых Е3, является остаток N-терминальной аминокислоты. Е3 имеет два различных связующих центра для основных и гидрофобных N-терминальных остатков аминокислот (N- концевое правило). Однако наиболее быстро деградируемые клеточные белки не содержат N-терминальных остатков, отвечающих N-концевому правилу. Некоторые из них могут быть деградированы, например, с участием особого вида Е3 (Е3β) – фермента, который узнает N-концевые остатки серина, треонина и аланина. Повидимому, большинство клеточных белков, выявляемых для деградации, преимущественно связываются с убиквитином с помощью еще не идентифицированных видов Е3, которые узнают другие структурные сигналы в белках.

Изопептидная связь убиквитина с мультиубиквитинированным белком ((Уб)n-CO-ε-NH-Lys-Уб-CO-ε-NH-Lys-белок) образует полиубиквитиновую структуру, присоединенную к белку, которая и служит сигналом для протеолитической атаки. Белки, связанные с множеством молекул убиквитина, в особенности с полиубиквитиновыми цепями, эффективно деградируются большим (26S) АТФзависимым протеиназным комплексом (6). Комплекс формируется ансамблем из трех компонентов. Один из них, известный как «поликаталитический» 20S протеиназный комплекс или 20S-протеасо- ма, содержит по крайней мере три типа протеолитической активности и имеет также АТФ-азную активность.

Последний этап убиквитин-протеолитического пути – это регенерация свободного для дальнейшего использования убиквитина; осуществляется убиквитин-C-терминальными гидролазами или изопептидазами. Их главная функция – разрушение полиубиквитиновой цепи на предназначенном для протеолиза белке, связан-

15

ном с 26S-протеасомой (7). При этом освобождение свободного убиквитина осуществляется только в присутствии АТФ (8) [Яровая, 2003].

Таким образом, если белок правильно свернут и функционально востребован, дегрон будет пространственно недоступен, Е3 не сможет с ним связаться и деградация не произойдет. Возможно, при температурном разворачивании белка дегрон может стать доступным, что приведет к деградации макромолекулы.

Процесс убиквитинзависимой деградации белков в клетке лежит в основе сложной системы регуляции жизнедеятельности эукариотической клетки, так как позволяет в определенный момент подвергать специфическому протеолизу огромное количество разнообразных белков, а также отменять деградацию, если белок все еще нужен клетке.

Время существования внутриклеточных белков может различаться на несколько порядков. Структурные и конститутивно экспрессирующиеся белки обычно обладают большой продолжительностью жизни, в то время как регуляторные белки распадаются быстро. Протеолитический гидролиз регуляторных белков позволяет быстро переключаться с одной функциональной программы на другую.

Большинство внутриклеточных белков заканчивают существование в результате протеолитического гидролиза, превращаясь в небольшие пептиды и свободные аминокислоты, которые могут использоваться в синтезе новых белков.

Многие протеолитические ферменты используют в качестве субстратов индивидуальные белки. Система протеолитической деградации внутриклеточных белков с участием протеасом и убиквитина, обладая широкой субстратной специфичностью, безопасна для нативных белков и реагирует на регуляторные и стрессорные воздействия. В то же время имеется множество протеиназ широкой субстратной специфичности, чья «неразборчивость» в субстратах приводит к гидролизу любых белков, после их презентации. Наиболее ярким представителем этой «неразборчивости» является трипсин.

1.6. Значение сериновых протеиназ трипсиназного типа за пределами клетки

Для различных белков сыворотки крови и устойчивость к денатурации, и скорость ренатурации различны. Для некоторых белков, например, для трипсина, характерна способность к быстрой ренату-

16

рации после нагревания [Ленинджер, 1985]. Подобно растянутой пружине или «застежке-молнии», эти белки мгновенно возвращают свою нативную конформацию. Их аминокислотная последовательность такова, что цепь легко может найти положение, соответствующее минимальной свободной энергии.

Свойство ферментов, состоящих из одной полипептидной цепи (пепсин, трипсин, папаин, карбоксипептидаза, лизоцим, амилаза, рибонуклеаза), быстро восстанавливать свою ферментативную активность представляет не только академический интерес, но, благодаря их гидролитической функции, имеет большое общепатологическое значение. Например, если подвергнуть нагреванию смешанный раствор сывороточного альбумина и трипсина, то после нормализации температуры альбумин еще долгое время (часы) будет в «развернутом» состоянии, а трипсин, быстро (за минуты) восстановив свою протеолитическую активность, неуправляемо и произвольно «нарежет» из разобщенных полипептидных цепей альбумина олигопептиды различной средней молекулярной массы. А известно, что среднемолекулярные олигопептиды весьма токсичны для организма и составляют существо таких понятий, как эндотоксикоз и эндотоксемия. Вот почему борьба с последствиями теплового шока при злокачественной гипертермии составляет труднейшую проблему патофизиологии и реаниматологии.

1.7. Биологические аспекты действия гипертермии

Гипертермия не является новым методом лечения. Тепло использовалось для лечения заболеваний на протяжении многих веков. В Индии еще за 3000 лет до н.э. система Аюрведы предполагала месячный курс с использованием диеты, слабительных средств и согревания тела с помощью паровых ванн. Примерно 3200 лет спустя, во втором веке н.э., Руфус из Эфеса отмечал, что появление лихорадки способствует разрешению многих заболеваний. Более того, он заявлял: «…Я думаю, невозможно найти лекарство, которое обладало бы большей силой, чем лихорадка… и если бы нашелся такой врач, который был бы достаточно искусным, чтобы вызывать лихорадку, то не было бы нужды искать другие лекарства против болезней…»

Поскольку методы теплового воздействия хорошо известны и применялись веками у тысяч людей тысячами врачей, такой способ лечения не представляет никакой этической проблемы, равно как и не может идти речи о новом методе лечения или новой технологии, никогда ранее не применявшейся на людях.

17

Гипертермия рассматривается многими исследователями как один из перспективных методов профилактики и терапии ряда заболеваний. Однако пребывание организма в условиях теплового воздействия может приводить к метаболическим и функциональным изменениям.

Использование благоприятного влияния температуры на течение различных заболеваний, а также изыскание эффективных способов защиты организма от неблагоприятного воздействия высокой внешней температуры возможно лишь при условии раскрытия механизмов и лечебного, и повреждающего действия теплового фактора, а также механизмов адаптации организма к высокой внешней температуре [Козлов, 1990].

Уровень предельной гипертермии для разных животных неодинаков и зависит от их нормальной температуры тела. По некоторым сведениям, верхняя температурная граница, которую организм не может превышать, составляет 43–44 °C, а точнее, это 6 °С, разделяющих нормотермию и гибель организма от перегревания.

Анализ экспериментальных данных свидетельствует о фазности изменений функционального состояния организма при гипертермии. Известно, что в процессе общего перегревания развиваются последовательно одна за другой несколько стадий: двигательное возбуждение, поиск температурного комфорта, тепловой удар, предагония и агония (Пугачев М.К., 1971). Стадия двигательного возбуждения характеризуется повышением ректальной температуры до 39,5–41 °С, а стадия теплового удара – до 42,5–43,5 °С (Бондарев Д.П., 1986). Эти значения несколько отличаются от полученных С.К. Кобяковым (1988), который определяет повышение ректальной температуры на 1,6–2,0 и на 3,0–3,5 °С соответственно указанным стадиям гипертермии.

Тем не менее четко определен уровень умеренной гипертермии, составляющий 41,5–42,5 °С (Multhoff G., 1977; Heydari A.R. et al., 1993; Orlandi L. et al., 1996), тогда как критической для тканей является температура свыше 43 °С (Delannoy J. et al., 1990).

Рассматривая действие тепла на гомойотермный организм, следует иметь в виду два возможных пути развития последующих изменений: во-первых, повышение температуры различных органов и тканей и, таким образом, непосредственное влияние температурного фактора на их структуру и обмен веществ в них, на их функцию, на структуру отдельных клеток и макромолекул [Александров, 1975]; а во-вторых, включение различных механизмов адаптации с последующим влиянием на организм тех сдвигов, которые

18

происходят вследствие борьбы организма за постоянство температуры тела. Оба указанных пути могут реализовываться как при непосредственном влиянии тепла на соответствующие органы или ткани, так и при раздражении терморецепторов [Козлов, 1990].

Впатогенезе гипертермии существенное значение имеет изменение структуры и функции белков, нуклеиновых кислот, липидов, а также скорости ферментативных реакций. Установлено, что высокая температура в основном влияет на структурную организацию молекул белков, а именно на «слабые» химические связи – водородные, ионные связи, силы Ван-дер-Ваальса, гидрофобные взаимодействия.

Вработе П. Хочачка и Дж. Сомеро [1977] приводится следующий перечень биохимических структур и процессов, зависящих от слабых химических связей:

– высшие уровни структуры белков (вторичная, третичная, четвертичная);

– структура мембран;

– комплексы ферментов с лигандами;

– взаимодействие между цепями нуклеиновых кислот;

– структура воды;

– взаимодействие между липидами;

– взаимодействие между нуклеиновыми кислотами и белками;

– связывание гормонов белками-рецепторами.

Вряде работ показано, что перегревание организма животных сопровождается изменением структуры и функции белков в различных тканях, в том числе и в мозге: в белках различных отделов мозга изменялось содержание амидных, аминных и сульфгидрильных групп; варьировала выявляемость тирозина и триптофана; отмечалось также изменение характера УФ-спектров поглощения растворов белков мозга. Данные нарушения могут быть обусловлены не только высокой температурой, но и изменениями параметров внутренней среды, возникающими при перегревании (изменением pH и активности ферментов, нарушением водно-солевого обмена и др.).

Имеются сведения об изменении в процессе гипертермии структуры и функций нуклеиновых кислот. Отмечено снижение количества РНК в тканях мозга, печени, сердечной мышце, содержания ДНК в печени, уменьшение скорости включения Р32 в состав нуклеиновых кислот сердечной и скелетных мышц.

Впоследнее время большое внимание уделяется исследованию специфических белков, которые синтезируются в клетке в ответ на действие высокой температуры среды. Кратковременное повыше-

19

ние температуры среды индуцирует синтез и РНК, и белков, тогда как образование большинства белков клетки резко подавляется. Белки «теплового шока» выявляются в составе ядра, а также изолированного ядерного матрикса (Акопов С.Б., 1985), что представляет особый интерес. Автор высказал предположение о тождественности механизмов ингибирования белкового синтеза при гипертермии в клетках печени крыс и тепловом шоке в клеточных культурах. Эти выводы согласуются с данными, полученными в опытах на кроликах (Insai, Brown, 1982) и свидетельствующими о том, что при повышении температуры тела происходит накопление белка теплового шока с молекулярной массой 74 кДа в клетках микроваскулярной системы мозга.

Представляется интересной мысль о роли некоторых белков теплового шока в неспецифической стабилизации внутриклеточных структур (Minton et al., 1982).

Физико-химическое состояние липидов в полной мере зависит от температуры окружающей среды. Для каждого вида липида характерна своя точка плавления, зависящая главным образом от его жирнокислотного состава. Изменение фазового состояния липидов (от твердого к жидкому и наоборот) происходит в определенном диапазоне температур [Ленинджер, 1985].

Текучесть мембран прежде всего зависит от состава жирных кислот и содержания холестерина. В мембранном бислое цепи жирных кислот молекулы липидов могут находиться в строго упорядоченном (жестком) либо относительно дезорганизованном (жидком) состоянии. Переход от твердого к жидкому состоянию происходит при повышении температуры выше точки плавления (Bretcher, Raff, 1975).

Важным регулятором текучести мембран является холестерин. Находясь между отдельными цепями, холестерин препятствует их кристаллизации. В сущности, из-за этого может исчезать фазовый переход. В то же время холестерин блокирует сильное перемещение ацильных цепей и тем самым снижает текучесть мембран. Благодаря этим эффектам холестерина текучесть мембран поддерживается на каком-то среднем уровне. Повышение температуры ведет к увеличению текучести липидов в мембране. При понижении вязкости возрастает латеральное давление липидов, так как площадь мембранного каркаса фиксированна, а липиды стремятся занять больший объем. Последнее обстоятельство способствует повышению температуры фазового перехода. Рост давления в липидном бислое защищает нормальные клетки от слишком больших колеба-

20