Постановка задачи
"Подобно тому, как существует область молекулярной химии, основанной на ковалентных связях, существует и область супрамолекулярной химии – химии молекулярных ансамблей и межмолекулярных связей"
Лауреат Нобелевской премии по химии за 1987 Ж.-М. Лен
НАПРАВЛЕНИЕ:
Конструирование белков, способных самоассоциироваться на олиго- или полинуклеотидной платформе с образованием адресованных супрамолекулярных транспортных комплексов. Исследования процессов и закономерностей их формирования и функционирования в биологических системах для разработки новых генотерапевтических лекарственных средств.
Постановка задачи
"Подобно тому, как существует область молекулярной химии, основанной на ковалентных связях, существует и область супрамолекулярной химии – химии молекулярных ансамблей и межмолекулярных связей"
Лауреат Нобелевской премии по химии за 1987 Ж.-М. Лен
Основные требования, которые мы старались учесть при разработке структуры вектора.
Ø Не усложнять, а максимально упростить конструкцию за счет многофункциональности доменов.
Ø Вносить минимальные изменения в природные последовательности. При необходимых заменах стараться предусмотреть возможность внутриклеточного расщепления с образованием нетоксичных метаболитов.
Ø Использовать минимальные по размерам и максимально охарактеризованные домены.
Ø Предусмотреть технологические параметры наработки, хранения, применения.
Ø Обеспечить универсальность по отношению к природе, структуре и длине генетического материала.
Структура вектора PGEk
Адресующий домен
Эпидермальный фактор роста человека (EGF) - перспективный адресующий домен.
Способен к рецептор- опосредованному эндоцитозу.
Мишени – клетки, несущие EGF-рецепторы (R-EGF).
Небольшие размеры
молекулы |
(~6 кД). |
Низкая иммуногенность
Растворимость в воде
Стабильность
Структура вектора PGEk Позиция модификации ЭФР
Синтез ковалентных EGFh-олигонуклеотидных конъюгатов
NaIO4 (H2N-)EGFh R-U(CHOH) R(CHO) RHC=N-EGF
Структура вектора PGEk
Получение PGEk
Экспрессионный вектор, штамм-продуцент
• Штамм Escherichia coli
(депонирован:В-8389 ВКПМ) продуцирует замещенный, слитый с остатком модифицированного тиоредоксина полипептид, ферментативное расщепление которого приводит к образованию PGEk.
Получение PGEk
Электрофорез в 15% Трицин-ПААГ 1. PGEk
2. Гибрид тиоредоксин/ PGEk после гидролиза EKL
3. Гибрид тиоредоксин/ PGEk
4. Контроль: EGFh
5. Контроль: Гибрид тиоредоксин /EGFh после гидролиза EKL
Спектры возбуждения и флуоресценции белка PGEk Длина волны возбуждения λ возб =284 нм, λ фл. = 340 нм.
Изучение свойств PGEk
In vitro
•Генетический материал:
Плазмидная ДНК (pEGFP N1, pEGFP С)
Фосфодиэфирные олигодезоксирибонуклеотиды-антисенсы
Фосфотиоатные олигодезоксирибонуклеотиды-антисенсы
Олигонуклеотиды- антисенсы, содержащие метки и модификации
Наименование |
Последовательность |
Антисенс к гену |
||
SAG |
5'-TCT CCC AGC GTG CGC CAT |
Bcl-2 (Genta) |
||
2009 |
5'-AAT CCT CCC CCA GTT CAC CC |
Bcl-2 |
||
AS1 |
5'-AAC GTT GAG GGG CAT |
C-myc |
||
BB59 |
5'-AAG GCA TCC AGC CTC CGT T |
Bcl-2+ Bcl-Xl |
||
Mdr1 |
5'-AGG TTC TCT TCA AAC TCC AT |
Mdr1 |
||
TMO |
5'-(TTAGGG)4 |
TELO |
|
|
TelP5 |
5'-CCC TTC TCA GTT AGG GTT AG |
TELO |
||
N15T |
5'-NNNNNNNNNNNNNNNT |
Контроль |
||
•Клеточные линии:
HeLa (клетки карциномы шейки матки человека)
MCF-7 (клетки аденокарциномы молочной железы человека)
А431 (клетки эпидермоидной карциномы вульвы человека)
КВ (клетки человеческой карциномы ротовой полости)
B-клеточная лимфома Namalva
SCOV3 (клетки человеческой карциномы яичников)
К562 (клетки миелобластной лейкемии человека) - отрицательный контроль
Как положительный контроль рассматривали результаты доставки тех же генетических конструкций в клетки липофекцией
Изучение свойств PGEk
In vitro
Универсальность и селективность
Митотические свойства
Контроль: клетки A-431 + плазмида |
Клетки A-431+плазмида pEGFP-N1: PGE-k, |
pEGFP-N1 |
1:25 |
|
|
|
|
•Влияние вектора PGEk на доставку репортерной плазмиды pEGFP-N1 в опухолевые клетки.
Добавлено |
Соотношение, |
% флуоресцирующих клеток |
||||
|
моль/моль |
|
|
|
|
|
|
|
Культура клеток |
|
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
HeLa |
|
А431 |
|
K562 |
|
|
|
|
|
|
|
PEGFP-N1 липофектин |
|
85-90 |
|
85-95 |
|
85-90 |
|
|
|
|
|
|
|
PEGFP-N1 |
|
0 |
|
0 |
|
0 |
|
|
|
|
|
|
|
PEGFP-N1:PGE-k |
1:1 |
0 |
|
0 |
|
0 |
|
|
|
|
|
|
|
PEGFP-N1:PGE-k |
1:8 |
20 – 30 |
|
25-35 |
|
0 |
|
|
|
|
|
|
|
PEGFP-N1:PGE-k |
1:16 |
20 – 30 |
|
40-45 |
|
0 |
|
|
|
|
|
|
|
PEGFP-N1:PGE-k |
1:25 |
40 – 46 |
|
50-56 |
|
0 |
|
|
|
|
|
|
|
PEGFP-N1:PGE-k |
1:32 |
20 – 30 |
|
40-45 |
|
0 |
|
|
|
|
|
|
|
PEGFP-N1:PGE-k |
1:64 – 5000 |
0 |
|
0 |
|
0 |
|
|
|
|
|
|
|
Сравнение митотической активности производных EGFh. Включение тритиевой метки синхронизированными клетками мышиных эмбриональных фибробластов линии 3T3, которые инкубировали в присутствии фиксированного количества 3H- тимидина и EGFh, PGEk и PGEk-ДНК комплексов.
Изучение свойств PGEk
In vitro
Универсальность и селективность
1 |
2 |
•Микрофотографии (1 – флюоресцентые, 2 – инверсионные) опухолевых клеток линии A-431 через 18
Контроль |
часов инкубации с 5'- FITC-фосфотиоатным |
|
|||||
|
|
||||||
|
олигонуклеотидом 2009F и со смесью его и PGEk в |
||||||
|
молярном соотношении 1:10. |
|
|
||||
• |
Таблица . Влияние вектора PGEk на доставку тио-5’- |
||||||
2009F 200 нМ |
флюоресцеин- антисенс-олигонуклеотида 2009F в |
||||||
|
|||||||
|
клетки линии А431 и K562. |
|
|
||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Линия |
Добавлено |
Соотно- |
Интенсивность |
% |
Отношение к |
|
|
Клеток |
|
шение |
флуоресценции, |
клеток |
интенсивности |
|
|
|
|
|
у.е., среднее |
|
флуоресценци |
|
|
|
|
|
|
|
и.2009F |
|
|
|
|
|
|
|
|
PGE-k : 2009F |
|
А431 |
0 |
|
3.83 |
0.6 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
10 : 1 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
2009F |
|
17.2 |
97.1 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
PGEk:2009F |
3:1 |
47.1 |
99.8 |
3,2 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
PGEk:2009F |
5:1 |
64.4 |
99.9 |
4,5 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
PGEk:2009F |
10:1 |
73.6 |
100 |
5,2 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
K562 |
0 |
|
5.07 |
0.25 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
2009F |
|
54.4 |
96.8 |
|
|
|
|
|
|
|
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
PGEk:2009F |
10:1 |
47.9 |
95.7 |
0.87 |
|
|
|
|
|
|
|
|