- •Биологические методы контроля
- •31. Биологические испытания инсулина
- •Общая часть
- •Раздел 1. Определение чувствительности животных к инсулину
- •Методика определения чувствительности кроликов к инсулину
- •Методика определения чувствительности мышей к инсулину
- •Раздел 2. Биологическая активность
- •Интерпретация результатов
- •Раздел 3. Биоидентичность
- •Интерпретация результатов
- •Раздел 4. Пролонгированное (удлиненное) действие лекарственных препаратов инсулина
- •Интерпретация результатов
- •Раздел 5. Инсулин в растворе
- •Раздел 6. Определение концентрации глюкозы
Раздел 2. Биологическая активность
Биологическую активность субстанций инсулина, его лекарственных форм и аналогов определяют одним из трех методов:
– по снижению концентрации глюкозы в крови кроликов;
– по снижению концентрации глюкозы в крови мышей;
– по судорожной реакции у мышей.
Метод определения биологической активности инсулина по снижению
концентрации глюкозы в крови кроликов (метод А)
Условия подготовки животных описаны в разделе 1 «Методика определения чувствительности кроликов к инсулину».
В опыт берут не менее 24 кроликов, которых распределяют на 4 равные группы способом случайного отбора.
Непосредственно перед экспериментом из основного раствора СО, содержащего 100 МЕ/мл инсулина соответствующей видовой специфичности, готовят два рабочих раствора СО, используя в качестве растворителя раствор № 2 (примечание 3 к общей части). Рекомендуемые концентрации рабочих растворов СО – 1,5 и 3,0 МЕ/мл. Из основного раствора ИП, учитывая его ожидаемую активность, аналогичным образом готовят рабочие растворы тех же концентраций.
Первой и второй группе животных подкожно вводят рабочие растворы СО в объеме 0,2 мл/кг (малая и большая доза СО – s1 и s2 соответственно), а третьей и четвертой – такой же объем рабочих растворов ИП (малая и большая доза ИП – u1 и u2 соответственно). Взятие крови из краевой вены уха проводят дважды: через 1 и 2,5 часа после инъекции, как описано в разделе 1. Вторую постановку (перекрест) проводят через неделю после первой. Каждая группа животных получает рабочие растворы СО и ИП в порядке, предусмотренном схемой двойного перекреста (табл. 31.1).
Таблица 31.1
Схема двойного перекреста
|
ГРУППА 1 |
ГРУППА 2 |
ГРУППА 3 |
ГРУППА 4 |
I ПОСТАНОВКА (день I) |
s1 |
s2 |
u1 |
u2 |
II ПОСТАНОВКА (день II) |
u2 |
u1 |
s2 |
s1 |
Результаты опыта обрабатывают согласно подразделу «Обработка результатов двойного перекреста (биологическая активность инсулина методом А и В)» общей фармакопейной статьи «Статистическая обработка результатов определения специфической фармакологической активности лекарственных средств биологическими методами».
Метод определения биологической активности инсулина по снижению
концентрации глюкозы в крови мышей (метод B)
В опыт берут не менее 40 мышей. Животных распределяют на 4 равные группы способом случайного отбора. Условия проведения опыта такие же, как при определении чувствительности (раздел 1). Введение рабочих растворов СО и ИП проводят по схеме двойного перекреста (табл. 31.1).
Непосредственно перед экспериментом из основного раствора СО, содержащего 100 МЕ/мл инсулина соответствующей видовой специфичности, готовят два рабочих раствора, используя в качестве растворителя раствор № 2 (примечание 3 к общей части). Малую и большую дозу инсулина выбирают в соответствии с предварительно определенной чувствительностью животных, как описано в разделе 1.
Аналогичным образом готовят рабочие растворы ИП, исходя из его ожидаемой активности.
Рекомендуемый диапазон концентраций рабочих растворов СО и ИП находится в пределах 0,06–0,35 МЕ/мл.
Согласно схеме двойного перекреста (табл. 31.1), первой и второй группе мышей подкожно вводят рабочие растворы СО, а третьей и четвертой – такие же объемы рабочих растворов ИП. Взятие крови проводят согласно разделу 1. Вторую постановку (перекрест) проводят через 24 ч после первой.
Результаты опыта обрабатывают согласно подразделу «Обработка результатов двойного перекреста (биологическая активность инсулина методом А и В)» общей фармакопейной статьи «Статистическая обработка результатов определения специфической фармакологической активности лекарственных средств биологическими методами».
Метод определения биологической активности инсулина по
судорожной реакции у мышей (метод С)
В опыт берут 96 мышей. Животных лишают корма за 18–20 часов до начала опыта и распределяют на 4 равные группы способом случайного отбора.
Непосредственно перед экспериментом готовят два рабочих раствора ИП и два рабочих раствора СО соответствующей видовой специфичности, используя в качестве растворителя раствор № 2. Рекомендуемые концентрации рабочих растворов – 0,04 и 0,08 МЕ/мл (0,8 и 1,6 МЕ/кг).
Первой и второй группе мышей подкожно вводят рабочие растворы СО в объеме 0,2 мл/10 г, а третьей и четвертой – такие же объемы рабочих растворов ИП. Животных сразу после инъекции помещают в термостатируемую камеру с температурой 33–37 С и принудительной вентиляцией. Через 30, 60 и 90 мин проводят учет:
– погибших мышей;
– мышей, у которых наблюдалась судорожная реакция (животные в этом состоянии не держатся на наклонной сетке камеры или, будучи перевернутыми на спину, не могут повернуться и встать на лапы в течение 2–3 секунд).
Результаты опыта обрабатывают согласно подразделу «Обработка результатов упрощенным пробит-методом (определение биологической активности инсулина методом С)» общей фармакопейной статьи «Статистическая обработка результатов определения специфической фармакологической активности лекарственных средств биологическими методами».