5 курс / Психиатрия и наркология для детей и взрослых (доп.) / Морфологическая_диагностика_наркотических_интоксикаций_в_судебной
.pdfотмечают, что качественные изменения внутренних органов при наркомании неспецифичны и не могут быть использованы в экс- пертной практике как доказательные, в связи с чем рекомендует- ся количественный анализ этих изменений [Пи-голкин Ю.И. и др., 1999; Хромова A.M. и др., 1999]. Приведенные соображения свидетельствуют об актуальности морфометрического исследо- вания печени при наркомании с целью разработки диагностиче- ских критериев для судебно-медицинской практики.
Кроме того, необходимы уточнение роли наркотических средств в патогенезе поражений печени и выявление особенно- стей течения вирусных гепатитов, характерных для наркотиче- ской интоксикации, а также исследование морфологических из-
менений печени при сочетанной интоксикации наркогиками и алкоголем. Такие данные могут послужить основой лдя разра- ботки дополнительных критериев дифференциальной диагно- стики этих интоксикаций.
Требования к достоверности данных судебно-медицинского исследования со стороны следственных органов постоянно рас- тут [Томилин В.В., Пиголкин Ю.И., 1997], однако социально- экономический кризис затрудняет внедрение в практику мето- дов, требующих дорогостоящего оборудования и расходных ма- териалов [Породенко В.А., Травенко Е.Н., 1999]. В частности, электронно-микроскопическое и гистохимическое исследование
тканей и органов трупа в экспертной практике применяется крайне редко, не говоря уже об иммуногис-тохимических мето- дах [Породенко В.А., Травенко Е.Н., 1999]. С этой точки зрения наиболее перспективным способом совершенствования морфо- логической диагностики является использование количественно- го анализа гистологических структур, который не требует доро- гостоящего оборудования и реактивов и доступен любому прак- тикующему судебно-медицинскому гистологу. Преимущество гистоморфометрического метода состоит также в том, что он по- зволяет объективизировать результаты и приводить их к форме, удобной для последующей математической обработки [Автанди- лов Г.Г., 1984, 1990; Толстолуцкий В.Ю., 1995; Пиголкин Ю.И. и др., 1999]. Поэтому мы сочли целесообразным применить мор- фометрические методы для изучения патологии некоторых, внутренних органов мри наркомании.
Методологической основой проведения гистоморфометриче- ского исследования послужили работы Г.Г. Автандилова (1980, 1984, 1990). Использовались его рекомендации по определению оптимального объема выборки исследуемых объектов, но мето- дике квантификации морфологических изменений и по стати- стической обработке полученных данных. Кроме того, и качест-
ве принципов рандомизации объектов морфометрии был принят многоэтапный гнездовой метод [Автандилов Г.Г.
103
и др., 1981], включающий случайный отбор единиц каждого уровня измерений (секционных наблюдений, тканевых блоков, срезов и полей зрения на срезе).
При проведении морфометрического анализа отечественные ученые обычно следуют рекомендациям Г. Г. Автандилова (1980, 1984, 1990) по методике стереометрических исследований, со- гласно которым в их основе лежит принцип Delesse, который гла- сит, что доля площади среза, приходящаяся на сечения изучаемой структуры, равна ее доле в объеме изучаемого вещества. Практи- ческое применение данной концепции состоит в том, что измеря- ется площадь среза, содержащая нужный компонент, вычисляет- ся ее отношение к общей площади препарата, а затем этот коэф- фициент умножают на объем органа и интерпретируют получен- ную величину как объем изучаемой структуры. Таким образом,
результаты двухмерных измерений просто экстраполируются на объемные показатели без какой-либо дополнительной информа- ции. Однако необходимо учитывать, что принцип Delesse перво- начально был сформулирован и доказан для минеральных объек- тов, структура которых относительно однородна. Между тем в биологических объектах могут наблюдаться значительные струк- турные различия в разных участках одной и той же ткани, осо- бенно в условиях патологии, что делает применение принципа Delesse проблематичным [Комарова Д.В., Цинзерлинг В.А., 1999]. В частности, при изучении серийных срезов печени при циррозе и последующей объемной реконструкции выяснилось,
что ложные дольки обычно не окружены соединительной тканью со всех сторон, как представляется при исследовании двухмер- ных срезов, а соединяются друг с другом [Логинов А.С., Аруин Л.И., 1985]. В такой ситуации следует ожидать, что различия
морфометрических параметров в препаратах из разных участков органа будут еще больше и, следовательно, количественный ана- лиз ограниченного числа двухмерных срезов будет еще в мень- шей степени соответствовать реальным объемным характеристи- кам структуры ткани.
На основании изложенного представляется возможным поста- вить вопрос о целесообразности применения принципа Delesse в гистостереометрии. По-видимому, для проведения фундамен- тальных стереологических исследований необходимо анализиро-
вать серийные срезы и гистотопограммы или хотя бы фрагменты из разных отделов изучаемого органа. Для практических диагно- стических целей такой метод слишком трудоемок, поэтому мож- но рекомендовать отказаться от использования принципа Delesse и операций с объемными величинами и ограничиться результа- тами измерений на плоскости, на основе которых и следует раз- рабатывать диагностические критерии.
В заключение следует отметить, что данный подход был ис-
пользован в судебной медицине для разработки способов
104
определения возраста человека и давности наступления смерти по морфометрическим параметрам гистологических препаратов тканей, а также в патологии для оценки активности воспалитель- ного процесса [Пиголкин Ю.И. и др., 2000; Коровин А.А., 2001; Ben Ari Z. et al., 1995]. Опыт успешного применения двухмерных измерений позволяет рекомендовать их для дальнейших морфо- метрических исследований.
Авторами были использованы рекомендации Г. Г. Автанди- лова (1996) по технике измерений с применением компьютерных технологий. Метод морфометрического исследования с помо-
щью компьютерной техники в настоящий период времени все шире внедряется как в научно-исследовательский и учебный процесс, так и в повседневную работу судебно-медицинского эксперта [Автандилов Г.Г., 2000; Алябьев Ф.В. и др., 2001; Пи- голкин Ю.И. и др., 2001; Хромова A.M., 2001]. В основе метода
лежит возможность получения изображения непосредственно с исследуемого объекта (живого лица, трупа, гистологического препарата и т.д.), перекодирования его в цифровой формат, хра- нения, сортировки и анализа с использованием специального программного обеспечения.
Данное направление позволяет перейти от субъективных ха- рактеристик к объективным, что повышает достоверность интер- претации полученных данных [Автандилов Г.Г., 1990, 1996], а также обеспечивает удобство их хранения и возможность быст- рого доступа к информации, т.е. сокращает время проведения исследования. Это также позволяет использовать дополнитель- ные диагностические признаки, а также способствует разработке новых направлений в судебной медицине, например установле- нию биологического возраста человека по данным микроостео- метрического исследования костной ткани с целью идентифика- ции личности [Пиголкин Ю.И. и др., 2001].
В настоящее время зарубежной промышленностью налажен выпуск систем, в комплект которых входят оборудование и про- граммное обеспечение для всех перечисленных действий. Стои- мость их колеблется в пределах 50—100 тыс. долл. Следователь- но, для многих российских БСМЭ реализация такого подхода в исследовательском и диагностическом процессе недоступна. Тем не менее создание собственных денсито-морфометрических ус- тановок возможно с меньшими затратами — порядка 3—5 тыс. долл. Наиболее простой схемой в данном случае может явиться следующая: в состав системы должны входить микроскоп с на- садкой для фотоаппарата, цифровая видеокамера или цифровой фотоаппарат с объективом, подходящим для указанной выше насадки, и персональный компьютер, оборудованный специаль- ным и/или неадаптированным программным обеспечением.
Ведущими поставщиками микроскопов являются всемирно известные фирмы «Leica», «Nikon», «Olympus», «Zeiss» и фирма
«ЛОМО». Все они производят микроскопы, адаптирован-
105
ные под фотоаппараты, которые могут быть использованы для подключения цифрового фотоаппарата или видеокамеры. На российском рынке представлен широкий выбор цифровых ви-
деокамер: «Kodak», «Texas Instruments EEV», «Sony» и т.д. Неко-
торые из них могут использоваться в морфометрии и ден- ситометрии. Большинство современных персональных компью- теров также подходит для морфо- и денситометрических иссле- дований.
Наиболее сложными в организации телеморфометрии явля- ются стандартизация оборудования и подбор подходящего про- граммного обеспечения. Правильное подключение, надежная фиксация узлов, создание стабильного напряжения в сети, а так- же предпочтрггельное использование первого этажа для разме-
щения компьютерной морфометрической лаборатории в БСМЭ позволяют получить более точные результаты и продлить срок эксплуатации аппаратуры.
Немаловажную роль в данном случае играет калибровка сис- темы. Следует отметить, что широко используемая единица из- мерения современного цифрового изображения — пиксель — это минимальная информация, приходящаяся на одну точку изобра- жения и содержащая определенное число бит. В соответствии с этим файловые рисунки могут содержать от 2 (черно-белый ри- сунок) до 64 бит, что определяется параметрами операционной системы, графическими редакторами, используемыми в процессе работы, а также требованиями, предъявляемыми к измеряемым объектам. Самыми распространенными цифровыми изображе- ниями являются черно-белые 8-битные и цветные 24-битные. Следовательно, для оценки полученных при морфометрии ре- зультатов нужно определять, сколько точек приходится на иссле- дуемое цифровое изображение (например, высота 640 точек на дюйм, ширина 802 точки на дюйм). Некоторые морфометриче-
ские программы определяют минимальные размеры цифровых слайдов как 640x480. Как правило, такие файлы удобны для ра- бот, в которых важны наружные размеры объектов, но не имеют значения правильность их формы и распределение интенсивно- сти цвета. В гистоморфометрических исследованиях рекоменду- ют использовать размер файла как минимум 800x600 пикселей [Автандилов Г.Г., 1996]. Это связано с тем, что на данной площа-
ди при соответствующем увеличении можно достаточно точно определить размеры объекта, оценить его форму, провести ден- ситометрические измерения. Кроме этого, данный размер позво-
ляет использовать изображение для печати с достаточно высокой разрешающей способностью.
При работе с изображением важно и то, что функция «при- близить/удалить изображение», встроенная в измерительную программу/графический редактор, не влияет на число
106
точек, приходящихся на исследуемую единицу измерения, а лишь повышает точность исследования. В своих работах мы час- то используем полугора-двукратное приближение, например, с помощью инструмента «Масштаб» в программе «Adobe Photoshop». Согласно нашему опыту, это повышает качество измере- ния и снижает напряжение глазных мышц в процессе работы. Поэтому мы рекомендуем исследователям и практическим экс- пертам, проводящим морфометрический анализ, использовать 150—200% приближение.
При настройке необходимо перевести систему измерения в пиксельный режим: это облегчает дальнейшую работу и повы- шает точность. Однако использование пикселей в качестве еди- ницы измерения не дает права как-либо интерпретировать ре- зультаты, поскольку возможны варианты разрешающей способ- ности аппаратуры: с одного объекта можно получить как 481 600
точек (800x600), так и 1 250 000 (1250x1000), и результаты будут различны. Поэтому необходима калибровка мор-фометрической техники — определение коэффициентов для перевода данных из пикселей в микрометры.
Для калибровки в программах «Adobe Photoshop» версии 5.0 и
выше, Optimas 6.1, Scion Image, UTHSCSA Image Tool нами ис-
пользуется инструмент «Линейка» или подобные инструменты
(Distats, Measure Tool и т.д.). При использовании «Adobe Photoshop» версии 4.0 в качестве их заменителя можно использовать инструменты «Карандаш» или «Линия» в режиме «Быстрая мас- ка» или «Draw Mode». Аналогичная процедура может быть про- изведена и при использовании других программ, предназначен- ных для морфометрии.
Серьезную проблему калибровки представляет собой сло- жившаяся в настоящее время ситуация, когда объект- микрометры, которыми располагают современные экспертные учреждения, как правило, выпущены несколько десятилетий на- зад, т.е. формально имеют истекший срок годности. Для прове- дения калибровки нами использовались три объект-микрометра проходящего света с ценой деления 0,01 мм («ЛОМО», 1980 г. и 1972 г. выпуска). Для повышения точности измерения можно рекомендовать также применение нескольких объект- микрометров разных фирм. В нашем случае данные, полученные с трех объект-микрометров, совпали — это дает нам право ут- верждать, что официальная продолжительность срока их экс- плуатации сильно занижена.
Для получения калибровочных значений авторами выполня- лись следующие процедуры: объект-микрометр помещался в по- ле зрения микроскопа, входящего в состав системы анализа изо- бражений так, чтобы при захвате изображения на экране мони- тора шкала располагалась строго горизонтально. Производился захват изображения, проводилась серия калиб-
107
ровочных линий (соединяющих соседние деления шкалы), изме- рялась их длина в пикселях, и на основании полученных резуль-
татов с помощью программ математического анализа данных (MS Excel 7, SPSS 10) строился калибровочный график.
Схема измерения в графическом редакторе «Adobe Photoshop»:
1.Выбрать инструмент «Карандаш» с диаметром кисти 1 пик-
сель.
2.Выбрать режим «Быстрая маска».
3.Держа нажатой клавишу «Shift», провести «Карандашом» горизонтальную линию, соединяющую 10 малых делений шка- лы.
4.Выбрать «Стандартный режим».
5.Выбрать команды «Выделение» - «Инверсия».
6.Выбрать команды «Изображение» — «Гистограмма».
Вдиалоговом окне получается количество пикселей, соответ- ствующее длине 10 малых делений шкалы, т.е. 100 мкм.
Различие калибровочных графиков может возникнуть даже
при захвате изображения с одного объект-микрометра, что свя- зано с разным углом поворота линейки по отношению к видео- камере. При невозможности устранения угла поворота на столи- ке микроскопа графические редакторы типа «Adobe Photoshop» позволяют изменить это путем разворота основной шкалы объ- ект-микрометра в горизонтальное положение относительно экра- на монитора. Ошибки при расположении объект-микрометра под углом к горизонтальной оси могут достигать до 5—10 пикселей с 100 мкм (с изображения 300 точек на дюйм), что связано с ис- пользованием дополнительных битов информации на выравни- вание угла наклона калибровочной прямой.
При достаточно большом числе измерений прямолинейных калибровочных размеров можно вычислить площадь, занимае- мую 0,01 мм2 путем возведения величины пикселей, полученных с 100 мкм, в квадрат. Проверка данной величины проводится следующим образом: создается дополнительный слой изображе- ния в графическом редакторе типа «Adobe Photoshop», произво- дятся обрисовка параллельных линий, поворот изображения, об- рисовка перпендикулярных линий (параллельных главной оси линейки объект-микрометра) и построение квадрата либо по- строение квадрата с помощью дополнительных функций измери- тельных программ (например, в «Adobe Photoshop» — инстру- мент «Область»). При калибровке и дальнейшей работе исполь- зовались графические файлы размером 800x600 пикселей.
Важно отметить, что некоторые графические редакторы по-
зволяют сохранить изображение с различным числом точек на дюйм для горизонтали по отношению к вертикали. Необ-
108
ходимо использовать одинаковый формат для всех цифровых изображений. Кроме того, не рекомендуется менять размер изо- бражения до завершения всех измерений: растягивать/сужать графический файл, менять число точек на дюйм, использовать файлы с разными холстами (размерами как точек в изображении, так и длины изображения), что может вызвать неправильность оценки полученных данных. В противном случае необходимо заново калибровать систему (поскольку меняется число точек на дюйм), а данные, полученные с файлов, имеющих разный размер изображения или холста, нужно сортировать в соответствии с их числом пикселей или использовать разные калибровочные кри- вые для желаемых размеров (их можно получить заранее, опре- делив желаемый размер изображения). Кроме этого, работа с
разным линейным размером файлов создает дополнительные трудности при хранении и анализе информации, так как в этом
случае необходимо будет создавать несколько баз данных или же одну, содержащую в себе несколько подгрупп.
Следует учесть, что данные, полученные в результате прове- дения калибровки, могут использоваться для измерений доста- точно долго. Если части цифровой измерительной аппаратуры подверглись замене, необходимо заново провести калибровку системы. Кроме того, мы рекомендуем калибровать систему не реже одного раза в год.
Мы не рекомендуем переносить данные, полученные на од- ном увеличении, на другие путем их умножения на соответст- вующее число (например, получать результат для *200, умножив результат для *100 на 2). Это ведет к искажению результатов,
которое связано с недостаточной точностью калибровки самих объективов, а также с апертурой объектива, которая может иметь различное значение и, следовательно, влиять на определяемый размер (табл. 2.1). К тому же более низкие увеличения имеют большую погрешность, которая при перенесении полученных данных на большие увеличения возрастает.
Таким образом, ошибка калибровки в виде переноса значений
с одного увеличения на другое без проверки может вызывать систематическую ошибку в пределах 2—2,5% (на 2— 2,5 мкм с 100 мкм) — для линейных размеров и до 4—5% (до 400—500 мкм2 с 10 000 мкм2) — для поверхностных (площадных) разме- ров. Поэтому для каждого увеличения микроскопа калибровку следует проводить отдельно, начиная ее с наименьшего увеличе- ния и переходя к большему.
Более предпочтительно использование программ, специально разработанных для морфометрического анализа изображения, например «Optimas 6.1». Однако допустимо также использова- ние профессиональных издательских графических редак-
109
торов, не адаптированных для морфометрии, но позволяющих выстраивать гистограммы, имеющих встроенные линейки, вы- числяющих площадь, очерченную произвольной линией и т.д.,
типа «Adobe Photoshop».
Параметры калибровки системы анализа изображения и ско- рость дальнейшей работы зависят от следующих факторов:
•числа человек, работающих на приборе, наличия четкого графика их работы и контроля за соблюдением техники экс- плуатации прибора — неорганизованность ведет к сущест- венным потерям времени;
•вида микроскопа и степени его изношенности — по нашему опыту, микроскопы фирмы «Zeiss», требующие сложной на- стройки, неудобны в работе;
•системы ввода изображения — современные видеокамеры обладают высокой разрешающей способностью, однако не следует забывать, что при этом возрастает и размер памяти, занимаемой файлом;
•системы передачи изображения — здесь важна скорость, с которой поступает информация с системы ввода на персо- нальный компьютер;
•операционной среды, морфометрической программы/ гра- фического редактора — чем они новее, тем больше систем- ных ресурсов они потребляют, требуя использовать персо- нальный компьютер большей мощности.
Объем необходимой оперативной памяти определяется преж- де всего размером цифрового изображения. Современные графи- ческие редакторы требуют 3—5-кратного превышения ее над размером графического файла. Некоторые редакторы выводят полный размер в строке состояния при открытии файла, другие
— нет. Для определения фактического объема оперативной па- мяти, используемого в морфометрической программе/ графиче- ском редакторе, необходимо одно из калибровочных или серий- ных изображений сохранить в формате Tiff (Tag Image File Format) без сжатия. Полученную величину (свойства файла) не- обходимо умножить на 4—5 в зависимости от числа операций, проводимых с цифровым изображением. Стандартное изображе- ние (640 на 480 пикселей) занимает объем в 1 Мб. Проведем не- сложные вычисления: 1 Мб х 5 раз + 35—50 Мб (необходимо для работы операционной системы) +15 Мб (необходимо для запуска графического редактора) = 55—70 Мб оперативной памяти.
Как правило, для одной гистоморфометрической научно- исследовательской работы требуется 500 и более файлов по 1 Мб. Показатели скорости измерения будут заметно снижаться при снижении свободной как оперативной, так и виртуальной памяти, о чем никогда не следует забывать: всегда надо ограни- чи-
111
ваться захватом не более 20 объектов с дальнейшим их сохране- нием перед возобновлением операции захвата. При захвате 30— 40 цифровых изображений часто происходит их потеря, если объем оперативной памяти оказывается недостаточен либо сво- бодное место на жестком диске не превышает 1 Гб.
Следовательно, для полноценной работы с графическими ре- дакторами и/или морфометрическими программами необходимы как минимум 64 Мб оперативной памяти и размер жесткого дис- ка более 2 Гб, поскольку меньший объем приводит к сбоям в ра- боте системы и несохранению полученного материала. Кроме того, полученные при измерениях данные удобно сразу вносить в электронные таблицы, что дает возможность их хранения и ана- лиза. Поэтому программное обеспечение системы анализа изо- бражений должно включать табличный редактор типа MS Excel, систему управления базами данных типа MS Access, текстовый редактор типа MS Word для качественных описаний и примеча- ний, а также программу для статистических расчетов типа Statistica, SPSS или Био-стат. Объем оперативной памяти должен до- пускать их одновременную работу с программой для морфомет- рии.
Формат сохранения цифровых файлов зависит от программы дальнейших работ. Если предполагается работать с данными файлами, не изменяя их, рекомендуется использовать формат
*jpeg (Joint Photography Experts Group) в режиме «максимальное качество» для более экономного использования места на жестком диске. В случае, если эти файлы будут многократно изменяться, рекомендуемым будет формат *.tiff. К его недостаткам можно
отнести больший объем физической памяти по сравнению с *.jpeg, к преимуществам — возможность многократной коррек- ции изображения без потери качества, а также предпочтение ра- боты с ним большинства издательских коллегий.
Таким образом, при организации телеморфометрических ис- следований в БСМЭ необходимо учитывать следующее:
•размещение лаборатории;
•оборудование и программное обеспечение для телемор- фометрии;
•обеспечение возможности калибровки оборудования;
•обеспечение возможности хранения изображений, описаний и баз данных (средства архивации);
•обеспечение возможности распечатки графических файлов, результатов измерений и т.д.
Рациональное решение этих вопросов повышает точность те- леморфометрических исследований, что позволяет проводить
научные исследования и практические экспертизы на высоком методическом уровне.
112