5 курс / Психиатрия и наркология для детей и взрослых (доп.) / КЛИНИЧЕСКАЯ_ПСИХОФАРМАКОГЕНЕТИКА

Молекулярно-генетические исследования являются мощнейшим драйвером развития целого ряда научных областей, таких как биология, медицина, информатика, физика, химия, экономика, философия и т.д. Данное направление стало важной темой междисциплинарного диалога, в результате которого появились самостоятельные поддисциплины. Сложно себе представить раздел медицины, который бы не пережил своего бурного развития за последние два десятилетия благодаря применению молекулярно-генетиче- ских методов. Можно даже говорить о революционных, а не эволюционных изменениях в них. Психиатрия не стала исключением. Несомненно, со временем молекулярно-генетические методы войдут в рутинную психиатрическую практику.

Несмотря на высокие стандарты и требования, выдвигаемые медициной, интеграция моле- кулярно-генетического подхода проходит более чем успешно. Молекулярная диагностика занимает почти десятую часть рынка медицинских изделий для диагностики in vitro, является наиболее быстрорастущим сегментом, что позволяет ожидать дальнейшего развития этого направления диагностики.

Организация лаборатории для молекулярно-генетических исследований

Безусловно, работа с высокотехнологическим оборудованием, сложными методиками выдвигает особые требования к персоналу лаборатории и помещениям клинико-диагностической лаборатории. В настоящее время приказом Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (Минздравсоцразвития России) от 23 апреля 2009г. №210н «О номенклатуре специальностей специалистов с высшим и послевузовским медицинским и фармацевтическим образованием в сфере здравоохранения Российской Федерации» утверждена номенклатура специальностей специалистов с высшим и послевузовским медицинским и фармацевтическим образованием в сфере здравоохранения Российской Федерации, согласно которой специальность «Клиническая лабораторная диагностика» является основной специальностью, которую могут получить лица с высшим образованием по специальности: «Лечебное дело», «Педиатрия», «Ме-

дико-профилактическое дело», «Стоматология», «Медицинская биохимия», «Медицинская биофизика», «медицинская кибернетика». Специальность можно получить путём обучения в интернатуре или ординатуре (приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 8 октября 2015 г. № 707н «Об утверждении Квалификационных требований к медицинским и фармацевтическим работникам с высшим образованием по направлению подготовки Здравоохранение и медицинские науки»), или путем прохождения профессиональной переподготовки при наличии иных основных и требующих дополнительной подготовки специальностей (приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 3 августа 2012 г. № 66н «Об утверждении Порядка

исроков совершенствования медицинскими работниками и фармацевтическими работниками профессиональных знаний и навыков путём обучения по дополнительным профессиональным образовательным программам в образовательных

инаучных организациях»).

Также действует приказ Министерства труда и социальной защиты РФ от 14 марта 2018г. №145н «Об утверждении профессионального стандарта “Специалист в области клинической лабораторной диагностики”». В нем специалисты, работающие в клинико-диагностической лаборатории, разделены на две категории. Биологи, химики-эксперты медицинской организации, врачи-лаборанты имеют допуск к исследованиям третьей категории сложности. При этом обозначено, что биолог –это специалист с высшим образованием – специалитет или магистратура по одной из специальностей: «Биология», «Физиология», «Биохимия», «Биофизика», «Генетика», «Микробиология». Химик-эксперт медицинской организации должен иметь высшее образование – специалитет или магистратура по одной из специальностей: «Биология», «Химия», «Фармация». Врач-лаборант должен иметь высшее (немедицинское) образование для специалистов, принятых на должность до 1 октября 1999 года. Врачи клинической лабораторной диагностики имеют доступ к исследованиям четвертой категории сложности, должны иметь высшее образование – специалитет по одной из специальностей: «Лечебное дело», «Педиатрия», «Стоматология», «Медико-профилактическое дело», «Медицинская биохимия», «Фармация»

иподготовку в интернатуре и (или) ординатуре по специальности «Клиническая лабораторная диагностика» или профессиональную переподготовку по специальности «Клиническая лабораторная диагностика» при наличии подготовки в интернатуре и (или) ординатуре по одной из основных специальностей или специальности, требующей дополнительной подготовки; высшее образование – специалитет по специальности «Медицинская биохимия» для специалистов, завершивших обучение не ранее 2017 года. Также для обеих категорий сотрудников вводится особое условие допуска к работе –наличие свидетельства об аккредитации специалиста или сертификат специалиста.

Более сложным остается вопрос со специалистами по направлению подготовки «Лабораторная генетика». К сожалению, профессиональный стандарт для этой специальности так и не был разработан к настоящему времени.

Основной документ, регламентирующий штатное расписание, материально-техниче- ское обеспечение, порядок оказания медицинской помощи при психических расстройствах

ирасстройствах поведения, – приказ №566н Министерства здравоохранения Российской Федерации. Согласно штатным нормативам психоневрологического диспансера, не имеющего в своей структуре стационарного подразделения (диспансерного отделения психиатрической больницы), предусмотрена одна ставка врача-лаборанта на 400–600 коек, но не менее одной должности в больницах на 200-ти и более коек. Это, безусловно, ограничивает доступ пациентов к исследованиям 4-й категории сложности, к которым имеют допуск только врачи клинической лабораторной диагностики. В приказе разработаны рекомендуемые штатные нормативы психиатрической больницы: врач клинической лабораторной диагностики один на 400–600 коек, но не менее одной должности в больницах на 200 и более коек; медицинский технолог, фельдшер-лаборант (медицинский лабораторный техник, лаборант) один на 150 коек. Данные нормативы требуют пересмотра, если в структуру клини- ко-диагностической лаборатории психиатрических учреждений планируется ввести моле- кулярно-биологическийблок. Отдельно стоит пересмотреть рекомендуемые списки оборудования. Действующий приказ Минздрава №380 от 25.12.1997 «О состоянии и мерах по совершенствованию лабораторного обеспечения диагностики и лечения пациентов в учреждениях здравоохранения Российской Федерации» не дает актуальной информации. Наиболее полная информация, отражающая современ-

ные требования к оборудованию и помещениям, отражена в методических указаниях МУ 1.3.2569-09 Роспотребнадзора.

Полимеразная цепная реакция

Основные принципы и описание компонентов для проведения ПЦР были изложены в работе K. Kleppe и соавт. в 1971 году [1]. Однако авторы не сфокусировали внимание на возможности экспоненциального увеличения копий фрагментов исходной молекулы нуклеиновой кислоты. В 1983 году Kary Mullis предложил метод, в основе которого лежала цепная реакция полимеризации нуклеиновой кислоты, протекающая под действием повторяющихся температурных циклов. Названием данного метода стала ПЦР. Уже в 1985 году свет увидела статья, описывающая амплификацию участка гена бета-глобина[2]. Новый метод также быстро нашел применение в практической медицине: в 1989 году компанией Perkin Elmer (США) был разработан первый ПЦР-ам- плификатор и выпущен на рынок набор для амплификации GeneAmp PCR Reagent Kit. А в 1993 году открытие удостоили Нобелевской премии. В том же году исследователи предложили детектировать накопление целевых фрагментов в реальном времени. Данная модификация получила широкое распространение и стала известна как ПЦР в реальном времени. В дальнейшем возникло множество иных модификаций ПЦР: ПЦР с обратной транскрипцией, мультиплексная ПЦР, гнездовая ПЦРи др. В данном разделе будут кратко изложены основные механизмы, лежащие в основе ПЦР и ее модификаций.

ПЦР является методом ферментативной наработки in vitro определенных, относительно коротких фрагментов (размах длины от нескольких десятков до нескольких тысяч пар нуклеотидов) нуклеиновой кислоты. Данный метод, по сути, является повторением основных шагов, происходящих in vivo в ядре клетки, и имеющих название «репликация». В ходе нее также происходит ферментативная наработка новой копии исходной целой молекулы нуклеиновой кислоты. Как видно из определения, фермент и матричная нуклеиновая кислота являются ключевыми в данном процессе. Разберем строение нуклеиновой кислоты на примере ДНК. ДНК представляет собой двухцепочечную молекулу – биополимер, каждая цепь которой состоит из мономеров – нуклеотидов (рис.1) [9]. Нуклеотиды также имеют сложную структуру (рис. 2).

51

Молекулы состоят из линейно чередующихся в определенной последовательности 4-х типов нуклеотидов. Каждый нуклеотид состоит из азотистого основания (Аденин (А), Гуанин (Г, G), Цитозин (Ц, C), Тимин (Т) в составе ДНК; А, Г, Ц и Урацил (У, U) — в составе РНК), молекулы углевода (для РНК — это рибоза, для ДНК — дезоксирибоза), остатка фосфорной кислоты — трифосфата. Нуклеотиды соединены между собой фосфодиэфирной связью между молекулами циклических углеводов [9]

Рис.2. Структура нуклеотида молекулы ДНК

Нуклеотиды имеют в своем составе моносахарид пентозу – дезоксирибозу, фосфатную группу, присоединенную к углероду моносахарида в 5’ положении. Заключительным компонентом нуклеотида является одно из четырех азотистых оснований (аденин, тимин, цитозин, гуанин), образующих гликозидную связь с 1’ углеродом дезоксирибозы. Нуклеотиды формируют каждую из цепей путем присоединения фосфатной группы к 3’ атому углерода моносахарида. Кроме того, азотистые основания нуклеотидов способны формировать относи-

тельно слабые водородные связи между собой, причем однозначно: две связи между собой образуют аденин и тимин, три связи — цитозин и гуанин. С помощью этих связей две цепочки ДНК удерживаются относительно друг друга. Очевидно, что, имея лишь одну цепочку нуклеиновой кислоты, можно восстановить по ней строение второй цепи: аденину одной цепи должен соответствовать тимин, цитозину — гуанин, и наоборот. Данный подход является принципом комплементарности. Следовательно, каждая цепь будет являться основой для двух новых копий ДНК, идентичных родительской. В ходе репликации целый комплекс ферментов разрушает водородные связи между двумя цепочками, стабилизирует и удерживает их от повторного соединения.

Повторение данного процесса in vitro с помощью всего комплекса ферментов чрезвычайно сложно и дорого. В связи с этим было предложено элегантное решение – разрушать водородные связи путем нагрева. Это позволяло не только получить отдельные цепочки, но и предотвратить самопроизвольное восстановление водородных связей. Но это приводило к новой проблеме: большая часть ферментов, синтезирующих новую цепь ДНК-полимераз, не могла работать, присоединять нуклеотиды и формировать растущую цепь при высокой температуре. Решение нашли в 1975 году Т.Брок и Х.Фриз, они открыли Thermus aquaticus – грамотрицательную палочковидную экстремально термофильную бактерию, а в 1976 году из нее была впервые выделена Taq-полимераза. Преимуществом

данного фермента была способность стабильно работать при повышенных температурах (оптимум 72–80 °C). Исторически это один из первых ферментов, используемых для постановки ПЦР. Используя различные ДНК-по- лимеразы или даже их комбинации, можно получить различные варианты ПЦР.

ДНК-полимеразы – ферменты, которые катализируют реакцию полимеризации цепи ДНК из мономеров при участии энергии АТФ. Выделяют три типа полимераз: ДНК-зависимая ДНК-по- лимераза (требует наличия матричной цепи ДНК и участка-затравки), РНК-зависимая ДНК-по- лимераза, или обратная транскриптаза (требует наличия матричной цепи РНК и участка-затрав- ки) и матрично-независимая ДНК-полимераза. Основные критерии, которыми должна обладать полимераза, – высокая процессивность (способность быстро формировать длинный участок растущей цепи) и высокая точность. В настоящее время в ПЦР применяются полимеразы, полученные из эукариот, прокариот, а также синтетические ферменты.

Taq-полимераза – фермент, представляющий собой полипептидную цепь с молекулярной массой около 95 кДа. Это высокопроцессивный фермент при оптимальной температуре реакции в 75–80 градусов Цельсия, скорость синтеза составляет около 150 пар нуклеотидов

всекунду. Taq-полимераза обладает 5’-3’-эк- зонуклеазной (замещающей) активностью, но при этом у нее отсутствует 3’-5’-экзонуклеаз- ная (корректирующая) активность. Синтезируемые с помощью Taq-полимеразы фрагменты ДНК содержат 3’-концевой выступающий нуклеотид (как правило, аденозин). Это свойство нашло применение в биоинженерных технологиях: клонирование продуктов ПЦР

вспециально подготовленные линеаризованные векторы с 3’-выступающим тимидином. Taq-полимераза по праву заслужила звание молекулы года по версии журнала Science 1989 года.

Вслучаях, когда в эксперименте требуется достичь высокой точности синтеза, жертвуя скоростью (направленный мутагенез, приготовление библиотек ДНК для последующего секвенирования, высокоточная амплификация фрагментов ДНК для клонирования), используют полимеразу, выделенную из Pyrococcus furiosus – Pfu-по- лимеразу. Pfu-полимераза обладает 3’–5’-эк- зонуклеазной (корректирующей) активностью. Сравнение точности полимераз показало, что Pfu-полимераза в 11–12 раз точнее, чем Taq-по- лимераза.

Классическая ПЦР позволяет дать ответ, присутствует ли определенный фрагмент ДНК

вобразце пробы, а также охарактеризовать его количество в ней. Однако это не позволяет сделать множество чрезвычайно важных выводов, например, как активно экспрессируется ген, участок которого мы детектируем. Также в ходе эволюции часть организмов (вирусы) закрепила в качестве основного носителя наследственной информации РНК, и классическая ПЦР не может с ней работать. Вновь благодаря замене фермента удалось решить эти проблемы. РНК-зависимая ДНК-полимераза (обратная траскриптаза) осуществляет перевод РНК

вкодирующую ДНК. Обратная транскриптаза (reverse transcriptase – RT) была открыта в 1970 году [3]. Её температурный оптимум работы на 40–50 градусов Цельсия ниже, чем у Taq-поли- меразы. Кроме того, она обладает РНКазной активностью – способностью разрезать РНК, что не позволяло получить длинные фрагменты. Исторически одной из первых обратных траскриптаз стал фермент AMV RT. Данный фермент был получен из ретровирусов, впоследствии оказалось, что многие их ревертазы допускают большой процент ошибок присоединения: примерно одна ошибка на 600 оснований[4]. Однако уже в 1989 году получен фермент M-MLV RT, в котором была удалена активность РНКазы Н [5]. Это значительно увеличило точность присоединения. Производители рекомендуют использовать AMV RT для одностадийной и двустадийной ПЦР-РВ, количественной ПЦР-РВ, для обратной транскрипции фрагментов до 5 тыс. п. н. M-MLV H-RT рекомендуют использовать для приготовления библиотек ДНК обратной транскрипцией длинных молекул РНК.

Следующими обязательными компонентами для проведения полимеразной цепной реакции являются ионы Mg2+ и дезоксерибонуклеозидтрифосфаты (dNTP). Ионы Mg2+ и dNTP формируют растворимые комплексы и являются субстратом для ДНК-полимераз.

Заключительным компонентом ПЦР являются праймеры (рис. 3)[9]. Праймеры – это искусственно синтезированные олигонуклеотиды, имеющие, как правило, размер от 15 до 30 нуклеотидов, идентичные соответствующим участкам ДНК-мишени. Они играют роль начала вновь синтезируемого фрагмента. Узнавая специфический участок матричной цепи, праймер присоединяется (отжигается) к нему, а в дальнейшем к праймеру достраивается новый фрагмент в направлении 5’–3’.

53

Определившись с составом реакционной смеси, можно проводить ПЦР. Исходная молекула ДНК разделяется на две матричные цепи и по завершении 1-го цикла к каждой цепи ДНК-поли- мераза достраивает синтезированный фрагмент. Затем уже обе молекулы ДНК разделяются, каждая на две цепи, и достраиваются до 4 молекул. Такой процесс накопления описывается формулой Nn =No(1+E)n , где Nn – конечное число молекул ДНК; No – начальное число копий ДНК; n – количество циклов; Е – эффективность. Эффективность изменяется в диапазоне от 0 до 1. Так, при максимальной эффективности число копий фрагментов ДНК будет удваиваться с каждым циклом, при минимальной эффективности — оставаться неизменным (рис. 4).

В ходе каждого цикла матричная ДНК должна распасться на 2 цепочки, праймеры должны узнать на цепочках специфические участки, а затем ДНК-полимераза достроит новую цепь. Каждый

Рис.4. Схема накопления продуктов ПЦР

из этих процессов протекает в своем температурном диапазоне. Стадия разделения цепей ДНК носит название стадии денатурации и протекает при температуре 93–96°С. Затем смесь охлаждается, до температуры, при которой праймер может присоединиться (отжечься) к каждой из двух цепей. Оптимум температуры составляет 40–75 °С и зависит от свойств самого праймера. После этого наступает стадии синтеза цепи, стадия элонгации, оптимум температуры зависит от выбранной ДНК-полимеразы. Далее реакционная смесь вновь переходит в стадию денатурации (рис. 5)[9]. Следует помнить, что число циклов ограничено свойствами ДНК-полимеразы и концентрацией компонентов реакционной смеси.

Исходя из вышеперечисленного, критически важно, чтобы температура реакционной смеси точно и быстро изменялась в соответствии со стадией цикла. Реализует изменение температуры прибор под названием амплификатор. Термостатирование пробирок с реакционной смесью в амплификаторе может осуществляться потоком воздуха, потоком или погружением в жидкость, либо за счет плотного контакта с твердым веществом с хорошей теплопроводностью. Основными характеристиками амплификатора являются скорость изменения температурного режима, а также точность определения температуры внутри пробирки.

В настоящий момент наиболее часто используются следующие подходы к детекции:

• электрофорез в геле агарозы или полиакриламида;

• гибридизационно-флуоресцентная детекция;

• гибридизационно-ферментный анализ (ГИФА);

• хромато-масс-спектрометрический анализ. Выбор метода детекции продуктов амплификации определяется рядом факторов.Во-первых, конечным количеством анализируемого про-

дукта амплификации. Во-вторых, при выборе метода детекции необходимо учитывать размер амплифицируемого фрагмента (фрагментов) нуклеиновой кислоты и гетерогенность анализируемой смеси (если одновременно амплифицируемых фрагментов больше одного). В-третьих, в зависимости от решаемой задачи может потребоваться не только информация о размере фрагментов, но и более детальная информация об их первичной последовательности и, следовательно, более сложные методы анализа продуктов амплификации. Наконец, важным фактором, определяющим выбор метода детекции, является экономическая целесообразность — соответствие себестоимости метода диагностической ценности (информативности) получаемому результату.

Электрофорез в геле является одним из наиболее классических методов детекции. По окон-

чании реакции содержимое реакционных пробирок вносят в лунки, сделанные в геле. Гель, как правило, готовится из агарозы или полиакриламида, также к нему добавляется бромистый этидий, для дальнейшего просвечивания. Затем в гель опускаются электроды и подается напряжение. Поскольку ДНК является заряженной молекулой, фрагменты начинают двигаться в электрическом поле, разделяясь в зависимости от массы фрагмента. По окончании разделения гель просвечивается и наблюдается трек движения молекулы ДНК и контрольного образца заданной массы.

Гибридизационно-флуоресцентная детекция представляет собой вариант классической ПЦР, где к паре праймеров, ограничивающих амплифицируемый фрагмент, добавляется зонд с флюорисцентной меткой. При этом зонды комплементарны выявленному фрагменту. После

присоединения зонда метка под действием света определённой длины волны начинает испускать свет большей длины волны, который детектируется оптической системой амплификатора. Большим преимуществом данного метода является возможность детекции результатов в реальном времени, возможность детекции в закрытой пробирке, а также проведения мультиплексной ПЦР: к разным участкам ДНК присоединяются свои праймеры и зонды, каждый из которых работает на своей длине волны, что позволяет детектировать сразу несколько различных молекул ДНК.

Использование гибридизационно-фермент- ный анализ для детекции продуктов амплификации в настоящее время не имеет большого значения, главным образом из-за высокой трудоемкости и контаминационной опасности, большого количества требующегося расходного материала и недостаточно высокой производительности даже при использовании роботизированных комплексов [6].

Применение хромато-масс-спектрометрии для анализа продуктов амплификации для целей рутинной молекулярной диагностики экономически неоправданно вследствие высокой стоимости оборудования и его обслуживания [7]. Однако данный метод с успехом применяется при анализе различных метагеномов и даже при подборе специфических препаратов для лечения опухолей.

В настоящее временя, в психиатрической практике наиболее важным применением ПЦР является определение однонуклеотидных замен, а также оценка экспрессии определенных генов. В тоже время необходимо подчеркнуть, что данные методики не являются золотым стандартом диагностики в фармакогенетике, а результаты таких анализов рекомендуется подтверждать методом секвенирования.

Секвенирование по Сенгеру

Секвенирование объединяет в себе группу методов, основанных на понуклеотидном определении состава участка нуклеиновой кислоты.

В1977 году Фредерик Сенгер усовершенствовал метод «плюс-минус секвенирование», создав метод дидезоксисеквенирования, или «метод терминаторов», более известный как метод Сенгера.

В1980 году Фредерик Сенгер был удостоен Нобелевской премии по химии.

Воснове метода лежит использование «модифицированных нуклеотидов» – дидезоксинуклеозидтрифосфатов. Данные нуклеотиды являются субстратом ДНК-полимераз, однако вследствие отсутствия в 3` положении -ОН группы они ограничивают дальнейший рост

цепи. Также каждый из 4 видов дидезоксинуклеозидтрифосфатов несет свой флуоресцентный краситель. Технически реакция полностью повторяет ПЦР, однако в каждом цикле реакции образуются молекулы ДНК, где синтез комплементарной цепи остановлен включением модифицированного нуклеотида. К концу ПЦР исследователь получает полный набор неполных продуктов реакции, где каждая синтезируемая цепь ограничена модифицированным нуклеотидом. Данная смесь разделяется методом электрофореза в геле. Каждый фрагмент имеет массу, различную ровно в один нуклеотид, при этом в электрическом поле фрагменты выстраиваются в отсортированном порядке. Детектируя сигналы, можно понуклеотидно восстановить исследуемую последовательность.

Секвенирование нового поколения

Определение последовательности нуклеиновых кислот методом высокопроизводительного секвенирования представляет собой параллельное прочтение огромного числа коротких фрагментов исходной ДНК. Общий процесс можно представить в виде следующих стадий: разрушение длинной молекулы ДНК с получением множества фрагментов определённой длины; присоединение к каждому фрагменту известных последовательностей – адаптеров; амплификация каждого фрагмента; определение последовательности фрагментов; биоинформатический анализ данных, позволяющий собрать из прочтений коротких фрагментов длинную последовательность.

Фрагментировать ДНК можно физическими или энзиматическими методами (рис. 6)[9]. Физические методы обладают большей воспроизводимостью.В качестве физических методов используют соникацию (разрушение ультразвуком), небулизацию (пропускание через микроотверстие), гидроширинг (гидродинамическое воздействие). Энзиматические методы предполагают использование ферментов – эндонуклеаз, разрезающих молекулу ДНК в определённых участках.

Качество «разрезки» зависит от качества исходного материала, количества используемых эндонуклеаз и температурного режима реакций. Следует отметить, что длина получаемых фрагментов в обоих подходах – величина случайная, имеющая нормальное распределение. В связи с этим, перед дальнейшей работой следует разделить фрагменты на гель-электро- форезе, чтобы оставить фрагменты желаемой длины.

После получения фрагментов нужной длины проводится лигирование адаптеров, с которых начнется амплификация и секвенирование. Ключевым этапом является одновременная наработка множества разных по составу фрагментов ДНК так, чтобы получаемые пулы ампликонов были локализованы в одной точке. Для этого используется мостиковая или эмульсионная ПЦР. Принцип мостиковой ПЦР заключен в проведении реакции с праймерами, закрепленными на подложке. После этапа денатурации фрагмент снова взаимодействует с праймером на подложке, образуя дугу между двумя точками на подложке. Эмульсионная ПЦР позволяет амплифицировать ДНК на покрытых праймерами микросферах так, что каждая микросфера оказывается «облеплена» только одним типом фрагментов.

Пиросеквенирование

В 1996 году Мустафа Рональди и Пол Нирен опубликовали метод секвенирования ДНК, в основе которого лежит детекция пирофосфата, освобождающегося в результате присоединения нуклеотида к растущей цепи.

Первым этапом является создание иммобилизованной на твердой фазе клональной библи-

отеки одноцепочечных фрагментов ДНК. После этого реакция протекает по принципу классической ПЦР с небольшой модификацией: в реакционную среду поочередно подается один из 4 типов дНТФ. В случае если на матричной цепи следующий за праймерным участком нуклеотид комплементарен добавленному, ДНК-полимераза присоединяет его, формирует фосфодиэфирнуюсвязьсотщеплениемпирофосфата. Он активирует каскад химических реакций,

врезультате которых возникает световой сигнал, интенсивность которого пропорциональна числу нуклеотидов (если несколько нуклеотидов в цепи идут один за одним). Световой сигнал улавливается детектором, записывается в пирограмму, которая затем программно расшифровывается

впоследовательность нуклеотидов. Не вовлеченные в синтез нуклеотиды и АТФ деградируют посредством апиразы, затем добавляется следующий нуклеотид.

Полупроводниковое секвенирование

Полупроводникое секвенирование – это метод определения последовательности, основанный на детекции протонов, выделяющихся в ходе синтеза ДНК. Процесс в целом похож на

57

пиросеквенирование. Вначале любым из методов создается иммобилизованная на твердой фазе клональная библиотека одноцепочечных фрагментов ДНК. Затем реакция протекает как и пиросеквенирование, однако детектируется не пирофосфат, а протон. Выделяемый протон локально изменяет кислотность, изменение детектируется сенсором. Как и пиросеквенирование, полупроводниковое секвенирование вызывает трудности с определением гомополимерных участков (пример, ТТТТТТТТТТТТ), сигнал теряет дискретность. Одним из преимуществ данного метода является отсутствие дорогостоящей системы оптической детекции.

Биочипирование

А.Д. Мирзабеков и его научная группа проводили исследования, затрагивающие методы получения сиквенса ДНК. В седедине 1980-х годов их работы привелик открытию метода биочипирования, или гибридизации ДНК на биочипе [8]. На плоской поверхности биочипа (микроэррея) иммобилизуют короткие олигонуклеотиды известной структуры в виде индивидуальных пятен, а анализируемая проба ДНК (предварительно помеченная флуоресцирующим красителем) вно-

сится в гибридизационный раствор, находящийся непосредственно на поверхности подложки. Термодинамические характеристики образующихся дуплексов между анализируемой ДНК и олигонуклеотидами можно оценить по интенсивности флуоресценции соответствующих пятен на поверхности биочипа, что в свою очередь позволяет оценить степень гомологии отдельных участков ДНК и в конечном итоге определить последовательность всей ДНК с помощью математических (компьютерных) методов обработки данных [9].

Секвенирование синтезом

В 1988 году Ш. Баласубраманиан и Д. Кленерман разработали технологию секвенирования синтезом. В основе метода лежал циклический процесс: внесение всех типов нуклеотидов в проточный чип с ПЦР-колониями на твердой фазе, образованными с помощью «мостиковой» ПЦР (рис.7) [9]; включение меченого нуклеотида ДНК-полимеразой; детекция флуоресценции от каждой ПЦР-колонии; снятие 3` блока и флуорофора с концевого нуклеотида. Повторение этих циклов позволяет узнать последовательность в коротких фрагментах, а затем собрать из них искомую последовательность нуклеотидов ДНК.

Одномолекулярное секвенирование

длинных фрагментов

Логическим развитием секвенирования множества коротких фрагментов является секвенированиедлинных фрагментов. Такой подход сильно облегчает анализ конечных данных. Осуществлять супердлинные прочтения позволяют высокопроизводительные секвенаторы третьего поколения. К ним относятся приборы американской компании PacBio (Pacific Biosciences), а также приборы британской компании Oxford Nanopore Technologies.

Секвенирование на приборах PacBio осуществляется с помощью одномолекулярного синтеза c детекцией процесса в реальном времени одной молекулы ДНК. Реакция синтеза происходит в небольших ячейках (объем измеряется пиколитрами). Если в рассмотренных ранее примерах небольшие фрагменты ДНК фиксируются на материальном носителе, а синтезирующая вторую цепь полимераза двигается вдоль неподвижной цепи ДНК, то в данной технологии, напротив, зафиксировано положение ДНК-полимеразы на дне ячейки, а продвигается находящаяся в растворе длинная молекула ДНК. К основанию ячейки подходит оптический волновод, который регистрирует сигнал флуоресценции, возникающий при включении меченого нуклеотида ферментом в растущую цепь. При встраивании нуклеотида в цепь происходит отщепление флуоресцентной метки, при этом измеряется только флуоресценция под сенсором.

История секвенирования нанопорами берет начало с 1989 года, когда Дэвид Димер создал основные принципы работы. Метод секвениро-

вания заключается в «протаскивании» интактной молекулы ДНК через нанопоры, расположенные на поверхности липидной мембраны, заключенной в реакционную камеру. Нанопоры представляют собой белок α-hemolysin. Мембрана, несущая нанопоры, разграничивает камеры, к которым подводятся электроды. Расплетенная цепь молекулы ДНК проходит через пору, при этом разные основания отрицательно заряженной цепи ДНК вызывают различные флуктуации ионного тока. Флуктуации измеряются прибором и в итоге преобразуются в информацию о последовательности нуклеотидов цепи. Ключевыми преимуществами данной технологии являются небольшой размер требуемого оборудования (прибор сопоставим по размерам с flash-носите- лем), относительная дешевизна оборудования и реагентики. К минусам стоит отнести не высокие аналитические свойства системы, которые, однако, продолжают совершенствоваться.

Таким образом, секвенирование по Сенгеру в настоящее время является золотым стандартом диагностики. В то же время секвенирование следующего поколения приближается по аналитическим и ценовым показателям к прямому секвенированию. В связи с этим следует ожидать массового внедрения в клинико-диагности- ческую практику секвенирования следующего поколения, что позволит расширить диагностические возможности медицины. В рамках психиатрии секвенирование следующего поколения поможет установить влияние отдельных групп генов и их полиморфных вариантов на развитие психических расстройств, проводить оптимальный подбор терапии.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1.Kleppe K, Ohtsuka E, Kleppe R, Molineux I, Khorana H. Studies on polynucleotides // J Mol Biol. 1971; 56(2): 341-

361.doi:10.1016/0022-2836(71)90469-4

2.Saiki R, Scharf S, Faloona F, Mullis K, Horn G, Erlich H. et. al. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia // Science. 1985; 230(4732): 1350–1354. doi:10.1126/science.2999980

3.BALTIMORE D. Viral RNA-dependent DNA Polymerase: RNA-dependent DNA Polymerase in Virions of RNA Tumour Viruses // Nature. 1970; 226(5252): 1209-1211. doi:10.1038/2261209a0.

4. Pathak V. Retroviral mutation rates and reverse transcriptase fidelity // Frontiers in Bioscience. 2003; 8(4): d117-134. doi:10.2741/957.

5.Kotewicz M, Sampson C, D’Alessio J, Gerard G. Isolation of cloned Moloney murine leukemia virus reverse

transcriptase lacking ribonuclease H activity.

6.Шипулин Г.А., Богословская Е. В., Цыганова Г. М.

идр. Отечественная ПЦР-тест-система для количественного определения РНК ВИЧ в плазме крови // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2001. №1. С. 40–43.

7.Ly N, Tokarz R, Mishra N, Sameroff S, Jain K, Rachmat A. Multiplex PCR analysis of clusters of unexplained viral respiratory tract infection in Cambodia // Virol J. 2014; 11(1). doi:10.1186/s12985-014-0224-x

8.Khrapko K, P. Lysov Y, Khorlyn A, Shick V, Florentiev V, Mirzabekov A. An oligonucleotide hybridization approach to DNA sequencing // FEBS Lett. 1989; 256(1-2): 118–122. doi:10.1016/0014-5793(89)81730-2

9.Молекулярная диагностика инфекционных заболеваний / Под редакцией В.И. Покровского, Г.А. Шипулина и др. М.: РИПОЛ-классик. 654 с. ISBN 978-5-386- 12296-6.

59