5.8. Ретровирусы типа D (SRV)

В. А. Морозов, К. В. Ильин

Ретровирусы типа D, или, как их теперь называют, "ретровирусы обезь­ ян" (simian retroviruses — SRV), отно­ сятся к онкогенным вирусам, хотя онкогенными являются лишь два представителя этого рода. Название SRV, на наш взгляд, не совсем удачно, так как, с одной стороны, среди этих ви­ русов встречаются не только вирусы обезьян, а с другой — известны ретровирусы обезьян, не имеющие отноше­ ния к роду D.

У обезьян SRV встречаются доста­ точно широко и могут вызывать им­ мунодефицит, напоминающий СПИД . До сих пор нет строгих доказательств того, что эти вирусы распространены в человеческой популяции и ассоции­ руются с каким-либо заболеванием. В связи с этим, учитывая то, что описа­ ны лишь отдельные случаи заражения людей SRV, а также тот факт, что эти вирусы способны легко заражать раз­ личные клеточные культуры человека in vitro, их, так же как и ряд других ретровирусов обезьян, можно отнести к группе ретровирусов, которые по­ тенциально могут циркулировать у людей. Особняком в этой группе сто­ ят относительно недавно охарактери­ зованные онкогенные ретровирусы овец и коз. Эти вирусы вызывают у животных опухоли дыхательных пу­ тей, в частности контагиозный аденоматоз легкого, бронхоальвеолярную карциному и опухоль внутренней по­ лости носа. Ретровирусы с морфоло­ гией частиц типа D выделены в от­ дельный род подсемейства Oncovirinae (РНК-содержащие опухолеродные ви­ русы) семейства Retroviridae, в состав которого входят как экзогенные, так и эндогенные вирусы, имеющие общую морфологию.

Для морфогенеза SRV характерно образование в цитоплазме клеток то­ роидальных Α-частиц (не зрелых ядер), которые являются предшест­

венниками зрелых ядер вирионов ти­ па D. Созревание частиц, т. е. форми­ рование оптически плотного зрелого ядра, происходит спустя 2—3 ч после почкования вириона от плазматиче­ ской мембраны клетки. У ретровиру­ сов процесс формирования зрелого ядра состоит в нарезании белка-пред­ шественника — продукта трансляции гена gag на отдельные структурные белки — матриксный (МА), капсидный (СА) и нуклеокапсидный (NC). В целом морфогенез SRV напоминает таковой у MMTV.

Род D включает группу из 5 экзо­ генных ретровирусов обезьян (SRV 1—5), выделенных от азиатских ма­ как, и два онкогенных вируса, недав­ но выделенных от овец и коз (JSRV и ENTV).

Прототипом рода D является вирус Mason-Pfizer обезьян (MPMV), или, по современной терминологии, SRV-3. Вирус был выделен в 1970 г. из клеток карциномы молочной железы макакирезуса. Последующие за этим много­ численные попытки выделить вирус от других обезьян с опухолями молоч­ ных желез не дали результатов. Вто­ рым выделенным SRV был вирус HEp-2V, изолированный из стабиль­ ной клеточной линии карциномы гор­ тани человека НЕр-2 (1972). В настоя­ щее время установлено, что HEp-2V представляет собой вариант SRV-1. В течение последующих лет SRV были выделены из нескольких клеточных линий человека, однако позднее было показано, что значительная часть этих культур была контаминирована клет­ ками HeLa, в частности субклоном, контаминированным SRV.

От павианов (Papio cynocephalus)

был выделен и охарактеризован един­ ственный пока вариант африканского SRV - SRV-Pc (близкий SRV-2). Этот

Первый был выделен от очкового лангура (Presbytis opscuris) и получил на­ звание Langur Virus (LV), или РО-1-

Lu. Этот вирус по многим параметрам близок к SRV-3. Другой эндогенный вирус выделен от беличьей обезьяны, распространенной в Новом Свете. Ви­ рус был назван Squirrel Monkey Retro­ virus (SMRV); он заметно отличается от других представителей рода D.

В начале 80-х годов в Региональ­ ных центрах приматов С Ш А в Новой Англии, Калифорнии, Орегоне, Вис­ консине, Вашингтоне, а также в На­ циональном раковом институте в Бетезде (Мериленд) были отмечены многочисленные случаи иммунодефи­ цита, не связанные с SIV. Смертность животных составляла от 35 до 60 %. От больных обезьян были выделены ретровирусы с морфологией D. Уста­ новлено, что заражение обезьян про­ исходило путем как вертикальной, так и горизонтальной передачи. Эффек­ тивность заражения SRV обычно об­ ратно пропорциональна силе иммуно­ логического ответа на инфекцию, а своевременная вакцинация обезьян успешно защищает их от инфекции.

5.8.1. Морфогенез SRV

Кратко остановимся на морфоге­ незе SRV. Напомним, что у SRV, так же как у ретровирусов типа В и виру­ сов фоами, капсид собирается в цито­

плазме. Этот капсид (называемый не­ зрелым ядром) в разрезе представляет собой тороидальную структуру разме­ ром около 50—70 нм (частицы типа А), состоящую из 2000—3000 молекул белка-предшественника Pr7880g и димера геномной (+) Р Н К . Капсиды транспортируются к плазматической мембране, где в процессе почкования "окутываются" env-кодируемыми бел­ ками оболочки — трансмембранным gp20 (ТМ) и поверхностным gp70 (SU), представленными на плазмати­ ческой мембране. Протеолитическое расщепление env-кодируемых белковпредшественников происходит в ци­ топлазме клеток при участии клеточ­ ных протеиназ. Внеклеточные незре­ лые вирионы имеют овальную форму и диаметр 100—120 нм. Вирионы по­ крыты двухконтурной оболочкой тол­ щиной 7—8 нм. В центре вириона расположен нуклеоид диаметром око­ ло 70 нм.

Процесс созревания вирионов со­ стоит в протеолитическом расщепле­ нии gag-кодируемых белков-предше­ ственников вирусной протеиназой, что приводит в конечном итоге к из­ менению морфологии ядра. Зрелые внеклеточные вирионы SRV отлича­ ются достаточно выраженным поли­ морфизмом. Диаметр вирионов ко-

леблется от 90 до 130 нм. Нуклеоид внутри вириона, как правило, локали­ зуется эксцентрично. Зрелые нуклеоиды чаще эллипсоидной, реже сфери­ ческой формы. Диаметр эллипсоид­ ных нуклеоидов 70—120 нм, сфериче­ ских — около 70 нм. Вирионы покры­ ты двухконтурной оболочкой толщи­ ной 7—8 нм, на которой расположены отростки (spicks) длиной около 6— 8 нм (рис. 5.1).

5.8.2. Геном SRV

SRV серотипов-1, -2, -3 полностью просеквенированы, a SRV-4, -5 просеквенированы лишь частично. Геном известных SRV, кроме двух LTR, име­ ет четыре ("классические" для ретровирусов с простым геномом) откры­ тые рамки считывания, кодирующие внутренние структурные белки (ген gag), протеазу (ген prt или pro), Р Н К - зависимую ДНК-полимеразу (ген pol) и гликопротеины вирусной оболочки (ген env) (схема 5.15). Таким образом, SRV относятся к ретровирусам с про­ стым геномом ввиду того, что они не

С х е м а 5.15. Структура генома ретрови-

руса типа D (SRV) (по Luciw Р. Α., Le­ ung N. J., 1992)

наружены особенности, отличающие SRV от ретровирусов типов В и С. Показано, что в результате первого этапа нарезания белка-предшествен­ ника гена gag Рг78 образуются два фрагмента — Рг37 и РгЗЗ. На втором этапе нарезаются эти фрагменты, в результате чего образуются следую­ щие белки: р10, рр18, р12, р14, р27 (СА) и р4. Для SMRV СА белком яв­ ляется р36. Ген env кодирует глико­ протеины оболочки вириона gp70 (SU) и gp22-20 (ТМ).

Сравнительный анализ экзогенных SRV показал, что по аминокислотно­

и З'-конец гена env SRV-1 и SRV-3 со­ ответственно различаются на 5—15 %. LTR SRV-1 и SRV-3 имеют 88 % го­ мологии. LTR SRV-2 в свою очередь гомологична SRV-1 и SRV-3 лишь на 70 %. Белки оболочки SRV-1 и SRV-2 различаются на 40 %. Таким образом, SRV-2 — наиболее "удаленный" вари­ ант из экзогенных SRV. Весьма выра­ жено антигенное сходство gp70 (SU) SRV с SU гликопротеинами эндоген­ ных ретровирусов типа С павианов (BaEV) и типа С кошек (RD-114). Вы­ явлена значительная гомология генов gag и pol SRV-3 и ΜMTV . Все это ука­ зывает на вероятное происхождение SRV путем рекомбинации между ретровирусами типов В и С.

Следует остановиться на особенно­ стях регуляторных механизмов. У SRV существует специальная система, вы­ полняющая регуляторную функцию. У SRV-3 на З'-концевом участке генома между геном env и З'-LTR (частично перекрывая эту область) нуклеотиды 8022 и 8240 имеется особая область, называемая constitutive transport ele­ ment (СТЕ). Регуляторные свойства СТЕ у SRV были обнаружены при изучении регуляции экспрессии гено­ ма вируса HIV. Транспорт несплайсированных или частично сплайсированных Р Н К HIV из ядра в цитоплаз­ му осуществляет белок Rev. Для того чтобы это произошло, Rev-белку не­ обходимо связаться с регуляторным

возможность передачи иммунодефи­ цита введением крови или тканевого гомогената от больной обезьяны здо­ ровой.

Все обезьяны после введения вируссодержащего материала оказались инфицированы. Часть из них погибла от острой инфекции. У погибших жи­ вотных не были обнаружены антитела к SRV. У животных, погибших от вя­ лотекущей инфекции, обнаруживали антитела к главному внутреннему бел­ ку вирусов группы SRV — р27 (СА), обычно в невысоком титре. У осталь­ ных синтезировались антитела не только к р27 (СА), но и к другим ви­ русным белкам, в том числе к gp70 (SU). Такие животные обычно выздо­ равливали.

Продемонстрировать роль MPMV (SRV-3) в развитии иммунодефицита удалось прямым способом. Из храня­ щихся в жидком азоте образцов опу­ холи молочной железы обезьяны, из которой был впервые выделен SRV-3, был повторно изолирован вирус. При его введении обезьянам у них развил­ ся иммунодефицит.

SRV-1, составляет 0,1—1 %. Вирусы группы SRV хорошо культивируются в стабильных клеточных линиях Т-лим- фоцитов человека (Jurkat, HUT-78) и в EBV-трансформированных В-лим- фоцитах человека (Raji). SRV хорошо размножаются также в фибробластах человека, EBV-трансформированных клетках макаки резуса, фибробластах обезьяны, эпителиальных клетках обезьяны, в клетках почек кролика, в стабильных клеточных линиях остеосаркомы человека (НОС) и рабдомиосаркомы (RD).

SRV не обладают выраженным цитолитическим и трансформирующим действием на клетки.

5.8.7. Эпидемиология иммунодефицита обезьян

Как отмечалось выше, SRV явля­ ются этиологическим фактором имму­ нодефицита обезьян. Этому заболева­ нию подвержены по крайней мере 8 видов азиатских обезьян, содержа­ щихся в центрах приматов США.

Долгое время и без достаточных

SRV-индуцированным иммунодефи­ цитом убедительно продемонстриро­ вали корреляцию между уровнем син­ теза антител к вирусным белкам и ус­ тойчивостью организма животного к заболеванию.

5.8.6. Распространение вируса в организме обезьян

У SRV-инфицированных животных наблюдается уменьшение лимфоцитов

пространены среди африканских обезьян. В начале 90-х годов антитела к белкам SRV были обнаружены у аф­ риканских приматов. В частности, ме­ тодом иммуноблоттинга были обнару­ жены антитела к SRV у телапонов

(Miopithecus sp.) и у павианов (Papio sp.). Позднее было показано, что аф­ риканские зеленые мартышки, оби­ тающие в Кении и Танзании, имеют нуклеотидные последовательности и антитела к белкам SRV. Таким обра­

частицы обнаруживаются в клетках лимфатических узлов, в мононуклеарных клетках периферической крови, плазме, сыворотке, моче, цереброспи­ нальной жидкости, вагинальных сек­ ретах животных с клиническими про­ явлениями заболевания и у вирусоносителей. Вирионы обнаруживаются в В- и Т-лимфоцитах, но не выявляют­ ся в нейтрофилах и тромбоцитах. Ко­ личество лимфоцитов, содержащих

обезьян могут встречаться SRV. В свя­ зи с этим нельзя исключить возмож­ ность контаминации отдельных пар­ тий препаратов полиовакцины SRV, поскольку клетки почки зеленых мар­ тышек широко использовались и ис­ пользуются для приготовления полиомиелитной вакцины.

Распространение SRV-2 в органах зараженных обезьян зависит от путей заражения и тяжести заболевания.

JSRV и ENTV были полностью просеквенированы, и оказалось, что они относятся к ретровирусам с про­ стым геномом и не имеют ни онкоге­ нов, ни транс-активаторов. Гомоло­ гия между геномами JSRV и ENTV со­ ставляет около 89 %.

У зараженных животных JSRV ло­ кализуется преимущественно в альве­ олярном эпителии легкого (клетки II типа) и бронхиолярных клетках, но практически отсутствует в лимфоци­ тах периферической крови, что ос­ ложняет проведение традиционной диагностики. Присутствие вируса в крови в незначительном количестве наблюдают лишь в преклинической стадии развития заболевания. Клеточ­ ным рецептором для JSRV является гиалуронидаза 2.

В настоящее время известно два варианта JSRV — Южно-Африкан­ ский и Северо-Американский (или Шотландский). Гомология между пер­ вым и вторым вариантом не превыша­ ет 93 %.

Культивирование in vitro опухоле­ вых клеток животных, зараженных ви­ русом, представляет необычайно сложную задачу, поэтому для зараже­ ния клеточных культур обычно ис­ пользуют инфекционный клон вируса.

Получены прямые доказательства участия JSRV в канцерогенезе. В част­ ности, у животных, которым вводили бесклеточный фильтрат опухоли лег­ кого в трахею, возникали опухоли. Образование характерных опухолей отмечено и у новорожденных ягнят при введении инфекционного клона вируса. Клетки мышей линии N I H 3ТЗ также легко трансформируются вирусом. Долгое время не было по­ нятно, каким образом реализуется онкогенный потенциал JSRV. Одно вре­ мя считали, что дополнительная от­ крытая рамка считывания (orf χ), рас­ положенная в области гена pol, может представлять собой онкоген вируса, но подтверждений этому не нашли. Попутно отметим, что роль orf χ до сих пор не ясна.

Есть основания считать, что "онко­

геном" является ТМ-область гена env, содержащая мотив Y-X-X-M. У эндо­ генных вариантов вируса такой мотив отсутствует.

Несомненный интерес представля­ ют поиски JSRV-подобных вирусов у людей с опухолями дыхательных пу­ тей, в частности с опухолями легкого. В единственной пока работе на эту те­ му [De las Heras et al., 2000] сообща­ лось об обнаружении методом иммунофлюоресценции в образцах опухо­ лей легкого отдельных больных анти­ гена, иммунологически родственного СА белку JSRV, однако других иссле­ дований, в частности молекулярнобиологических, эти авторы не прово­ дили.

Поиск возможной ассоциации SRV с онкологическими заболеваниями че­ ловека начался сразу после выделения первого SRV (SRV-3) из карциномы молочной железы обезьяны, однако вызвать рак молочной железы у обезь­ ян введением SRV-3 не удалось. В оп­ ределенной степени исследования по поиску ассоциации SRV с онкологи­ ческими заболеваниями опережали поиск SRV в человеческой популяции как таковой.

При исследовании SRV неизбежно сталкиваешься с двумя проблемами: четко продемонстрировать SRV-цир- куляцию у людей и как следствие по­ казать возможное участие вирусов в каком-либо патологическом процессе.

Поиски маркеров SRV в разнооб­ разных опухолях человека, проведен­ ные в 70—80-е годы, в целом были безрезультатными, однако в течение последних 10 лет несколько раз сооб­ щалось о реактивности сывороток больных и отдельных групп доноров с белками SRV, что, вероятно, связано с общим ростом уровня исследований и повышенной чувствительностью ис­ пользуемых методов. Более того, у не­ которых здоровых африканцев и лю­ дей, ухаживающих за обезьянами, ме­ тодом П Ц Р были обнаружены нуклео-