но одной молекуле алкилирующего метаболита связаться ковалентно с ДНК, чтобы возникла опухоль. В про­ тивоположность этому перечисленные выше механизмы действия негеноток­ сичных канцерогенов (клеточная про­ лиферация, оксидативный стресс, на­ рушения межклеточных взаимодейст­ вий и др.) имеют порог, что было экс­ периментально доказано в отноше­ нии, например, клеточной пролифе­ рации, вызываемой негенотоксичным канцерогеном — р-дихлорбензолом в печени мышей, где этот канцероген вызывает опухоли.

Принципиально различен подход к оценке риска злокачественных опухо­ лей от действия генотоксичных и не­ генотоксичных канцерогенов. Опреде­ ление предельно допустимой дозы ге­ нотоксичных канцерогенов произво­ дится на основе линейной (беспорого­ вой) концепции путем математиче­ ской экстраполяции из области высо­ ких доз, использованных в экспери­ менте, в область очень малых реаль­ ных доз. ПДК негенотоксичных кан­ церогенов рассчитывают на основе экспериментально найденной макси­ мальной недействующей дозы с ис­ пользованием коэффициента запаса.

Рекомендуемая литература

Вопр. онкол. — 1997. — Т. 43, № 3. — С. 299-303.

Турусов В. С, Томатис Л. Трансплацентар­ ный и трансгенерационный канцероге­ нез // Αρχ. патол. — 1997. — Т. 59, № 5. - С. 7-12.

Franks L. Μ., Teich Ν. Μ. (eds.). Cellular and molecular biology of cancer. Third Edi­ tion. Oxford University Press. Oxford. — N. Y. - Tokyo. - P. 1-458.

IARC. Scientific Publication, № 116: Mecha­ nisms of carcinogenesis in risk identifica­ tion. — Lyon: IARCPress, 1992.

[ARC. Technical Report № 24: Peroxisome proliferation and its role in carcinogene­ sis. - Lyon: IARCPress, 1995.

Sanner T. et al. Potency grading in carcinogen classification // Molec. carcinogenesis. — 1997. - Vol. 20. - P. 280-287.

U.S. Environmental Protection Agency (EPA). Proposed guidelines for carcinogen risk as­ sessment // Fed. Regist. — 1996. — Vol. 61. - P. 17 059-18 901.

Williams G. M. Chemicals with carcinogenic activity in the rodent liver; mechanistic evaluation of human risk // Cancer Let­ ters. - 1997. - Vol. 117. - P. 175-188.

Yamasaki H., Ashby J., Bignami M. et al. Nongenotoxic carcinogens: development of de­ tection methods based on mechanisms: a European project // Mutat. Res. — 1996. - Vol. 353. - P. 47-56.

4.2. Выявление и мониторинг химических канцерогенов

Г. А. Белицкий, В. С. Турусов

них развились злокачественные опу­ холи печени, почек, легких и других органов. При этом в ткани опухолей обнаруживались радиоактивные ком­ плексы торотраста, частицы которого были в свое время захвачены и депо­ нированы клетками ретикулоэндотелия. Таким образом, своевременное распознавание потенциального канце­ рогена предотвратило возникновение целой категории злокачественных опухолей. Но противоположных при­ меров значительно больше. К ним от­ носятся все профессиональные раки, вызванные агентами, о канцерогенно­ сти которых стало известно из ретро­ спективных эпидемиологических ис­ следований.

Быстрое распознавание канцероге­ нов давно стало насущной необходи­ мостью, так как технический прогресс привел к использованию большого количества химических соединений с не всегда известной биологической активностью. Часть из них применяют в быту, часть — в виде загрязнителей попадает в воду, воздух и пищу и с ними поступает в организм человека. Среди таких соединений находятся агенты, способные вызывать злокаче­ ственные новообразования. Физикохимические характеристики некото­ рых из них известны, что позволяет следить за их динамикой в окружаю­ щей среде с помощью методов, о ко­ торых будет сказано ниже. Определе­ ние же канцерогенных свойств новых химических соединений представляет собой значительно более сложную и не до конца решенную задачу. Тради­ ционные методы испытания в хрони­ ческих экспериментах на животных не позволяют охватить весь поток соеди­ нений, выпускаемых различными ви­ дами промышленности, поскольку они дороги и длительны.

Существует ряд подходов к реше­ нию этой проблемы. Одни предпола­ гают распознавание потенциальных канцерогенов по структуре молекулы, другие основываются на выявлении наиболее ранних событий в цепи кан­ церогенеза, третьи направлены на соз­

дание моделей in vivo с максимально коротким латентным периодом воз­ никновения опухолей.

4.2.7.Скрининг канцерогенов

по химическому строению

До конца 60-х годов XX в. это на­ правление носило чисто эмпириче­ ский характер, поскольку в то время не были известны многие звенья в це­ пи химического канцерогенеза. Счи­ талось, что химические канцерогены разных классов вызывают опухоли различным путем. В дальнейшем Дж.

иЭ. Миллер нашли общий момент действия всех генотоксичных канце­ рогенов — их превращение в процессе внутриклеточного метаболизма в электрофильные производные, спо­ собные образовывать аддукты с ДНК

идругими макромолекулами.

Внеэкспериментальный прогноз канцерогенных свойств химических соединений до настоящего времени остается в высшей степени сложной задачей, решение которой стало воз­ можным лишь в последние годы на основе компьютерного анализа боль­ ших баз данных, содержащих сведе­ ния о канцерогенности, мутагенности, токсичности и других биологических свойствах тысяч химических агентов различных классов.

Прогноз опасности новых химиче­ ских соединений по элементам сход­ ства с известными генотоксичными канцерогенами производится с учетом наличия у них электрофильных групп, являющихся структурными сигналами этой опасности. Например, наличие нитро- и аминогрупп в параположении производных бифенила и некото­ рых других соединений определяет их высокую генотоксичную (мутагенную) активность. В общем виде это корре­ лирует с величиной энергии низшей незанятой орбитали молекулы, харак­ теризующей ее электрофильность, т. е. способность ковалентно реагиро­ вать с нуклеофильными мишенями клеточных макромолекул. Среди дру­ гих квантовых характеристик молеку-

лы существенное значение имеют на­ личие зарядов на различных атомах, показатели электронной плотности, величина энергии высшей занятой орбитали и др. Учитываются также то­ пологические характеристики молеку­ лы, описывающие ее форму и индек­ сы молекулярных связей. Прогнози­ руемый эффект существенно прибли­ жается к фактическому при учете так называемых модулирующих факторов, к которым относятся реактивность, распределение в системе октанол—во­ да (липофильность) и наличие мета­ болических сайтов, которые определя­ ют возможные пути превращения со­ единения в клетке. Совокупность ме­ тодов, с помощью которых можно с достаточной степенью надежности ко­ личественно оценивать соотношение структура—функция, для прогноза канцерогенности обозначается аббре­ виатурой QSAR (Quantitative Structure Activity Relationship) и предполагает использование данных сравнительно­ го компьютерного анализа больших однородных баз данных, полученных

агентов, обладающих генотоксической активностью, поскольку пока не су­ ществует представительных баз дан­ ных и критериев количественной оценки взаимосвязи структура—функ­ ция для промоторов и других негено­ токсичных канцерогенов.

4.2.2. Биологические методы скрининга

4.2.2.1. Хронические эксперименты на животных

До последнего времени наиболее распространенным методом выявле­ ния канцерогенов были хронические эксперименты на животных. К поло­ жительным сторонам данного метода испытаний, делающего его в ряде слу­ чаев незаменимым, относится то, что у животных в результате действия агента развивается опухоль — такой же патологический процесс, как и у человека. При этом выявляются кан­ церогены, действующие на уровне ор­ ганизма, например через изменения в

При этом анализ должен произво­ диться на основе уравнений QSAR с использованием обучаемых программ типа CASE (Computer Automated Structure Evaluation) или MultiCASE в сочетании с программами типа МЕТА для учета вероятных метаболических превращений испытуемого соедине­ ния, в результате которых первона­ чально нейтральное соединение (проканцероген) может превращаться в активный электрофильный метаболит. Предсказательная способность мето­ да QSAR может приближаться к уров­ ню биологического эксперимента, ес­ ли в его уравнения закладываются точные физико-химические характе­ ристики соединения и адекватные данные о предполагаемом механизме действия, а обучающая выборка, со­ держащая данные о канцерогенности его аналогов, достаточно велика и од­ нородна. Следует отметить, что внеэкспериментальный прогноз канцеро­ генности пока возможен только для

В 70-е годы XX в. было узаконено проведение испытаний на канцеро­ генность на двух видах животных — мышах и крысах. После того как ре­ зультаты индукции опухолей у крыс позволили со значительной степенью вероятности предсказывать канцеро­ генность агента для мышей и наобо­ рот, появилось основание думать, что агент, вызывающий опухоли у двух видов животных, может быть актив­ ным как у других животных, так и у человека. В последующие десятилетия в хронических экспериментах на гры­ зунах были испытаны тысячи соеди­ нений.

Вскоре выяснилось, что хрониче­ ские эксперименты на животных об­ ладают абсолютной предсказательной силой лишь в очень узком диапазоне условий. Они воспроизводятся полно­ стью только на животных того же ви­ да, иногда только той же линии. Экст­ раполяция результатов на другой, да­ же близкий вид всегда носит вероят-

ностный характер. В частности, афлатоксин В, — сильнейший канцероген для крыс, но он слабо активен у мы­ шей.

Пара-диметиламиноазобензол го­ раздо эффективнее вызывает опухоли печени у крыс, чем у мышей, а близ­ кий к нему по структуре о-аминоазо- толуол обладает противоположной ви­ довой тропностью. Данные наиболее авторитетных международных про­ грамм, в которых на мышах и крысах были параллельно исследованы сотни веществ, показали, что совпадение ре­ зультатов для обоих видов не превы­ шает 70-75 %.

Едва ли можно утверждать, что по своей чувствительности к канцероге­ нам человек ближе к крысе или мы­ ши, чем эти два вида друг к другу. Это положение также хорошо иллюстри­ руется данными МАИР, подытожив­ шего результаты исследований, в ко­ торых на грызунах испытывали из­ вестные и предполагаемые канцероге­ ны человека (группы 1 и 2А). Три­ дцать соединений такого рода были испытаны в хронических эксперимен­ тах на животных. Группа экспертов МАИР, рассмотревшая все эти дан­ ные, сочла, что на основании хрони­ ческих экспериментов на мышах и крысах из 30 канцерогенов человека достоверно выявлены только 23 (76,6 %).

Относительно канцерогенности двух веществ (мышьяк и конъюгированные эстрогены) были получены ложноотрицательные результаты. Дан­ ные испытания 5 других соединений не позволили сделать никаких опреде­ ленных выводов.

Положительные результаты для не­ которых соединений были получены с большим трудом. Например, с помо­ щью бензола, который приводит к развитию лейкозов у человека, у мы­ шей удалось индуцировать лимфомы лишь после интенсивной ингаляцион­ ной затравки, но только у одной ли­ нии и только у самцов. У крыс бензол вызывал опухоли цымбаловой железы

— органа, которого нет у человека.

Второй классический канцероген че­ ловека — 2-нафтиламин — практиче­ ски неканцерогенен для крыс, а у мы­ шей вызывает небольшое повышение числа гепатом. Для воспроизведения в эксперименте опухолей мочевого пу­ зыря, которые он вызывает у челове­ ка, наиболее адекватной моделью ока­ зались только собаки. С большим тру­ дом, на грани достоверности удалось показать принципиальную возмож­ ность получения опухолей у грызунов с помощью канцерогенных для чело­ века соединений, содержащих мышь­ як и др.

Кроме того, спектр опухолей у экс­ периментальных животных значитель­ но отличался от такового у человека. Особенно большие проблемы возник­ ли с высокой частотой гепатом у мы­ шей B6C3F1, которые часто использо­ вались для тестирования на канцерогенность. Как известно, у европейцев такие опухоли наблюдаются крайне редко, и в конце концов эта модель была оставлена.

Выводы, которые сделаны на осно­ вании хронических экспериментов, базируются только на различиях в возникновении опухолей у контроль­ ных и подопытных животных безот­ носительно механизма их возникнове­ ния. В настоящее время это считается недостаточным, так как ряд опухолей у грызунов возникает с помощью ме­ ханизмов, отсутствующих у человека. Например, определяющим для канце­ рогенного действия d-лимонена на почки самцов крыс является наличие в их моче специфического белка (α2μ- глобулина). Такого белка нет не толь­ ко у человека, но и у животных.

Далее в хроническом эксперименте были использованы субтоксичные до­ зы веществ, вызывающие эффекты, никогда не встречающиеся при ис­ пользовании низких доз. Например, огромные дозы сахарина, вводимого крысам, кристаллизовались в их моче­ вом пузыре и вызывали там опухоли путем механического повреждения эпителия. Количество сахарина, по­ требляемого человеком, на порядки

меньше, и в его моче этот заменитель сахара находится только в растворен­ ном состоянии.

К существенным недостаткам тра­ диционного метода выявления канце­ рогенов относится и то, что с его по­ мощью не удается выявлять слабые канцерогены, поскольку в экспери­ ментальных группах обычно не бывает более 50 животных. Если мы имеем дело с агентом, который вызывает опухоли у 0,5—1 % особей, то он лег­ ко может выпасть из поля зрения экс­ периментатора.

Хронические эксперименты на жи­ вотных, выполняемые по классиче­ ской схеме (два вида животных обоего пола, две дозы и контроль — всего по 300 мышей и 300 крыс на вещество), не могут служить скрининговым тес­ том еще и потому, что они обходятся чрезвычайно дорого и длятся обычно до 3 лет. Их малая "пропускная спо­ собность" не в состоянии обеспечить контроль за тысячами новых соедине­ ний, ежегодно выпускаемых химиче­ ской промышленностью.

4.2.2.1.1.Перспективы

совершенствования

4.2.2.1.2.Среднесрочные испытания in vivo — выявление органотропности канцерогенов

Данный вариант является компро­ миссным, имеющим целью сократить длительность испытаний, сохранив в качестве объекта экспериментальных животных. Показателем эффекта при этом служат не только опухоли, но и предопухолевые изменения. Исполь­ зуют две основные системы — пече­ ночную модель и мультиорганную мо­ дель. Обе они, как и многие другие, базируются на гипотезе двухстадийного канцерогенеза. Считается, что эти модели могут не только обеспечить относительно быструю оценку канце­ рогенности на сравнительно неболь­ шом количестве животных, но и дать информацию об ожидаемой органо­ тропности испытуемых соединений.

4.2.2.1.2.1.Печеночная модель

В основе метода лежат следующие факты:

•доказательство двухстадийного развития индуцированных опу­ холей печени у крыс, получен­ ное воздействием генотоксичного инициатора и негенотоксичного промотора;

•стимулирующее действие на канцерогенез усиленной проли­ ферации гепатоцитов, вызван­ ной частичной гепатэктомией.

Оптимальным оказался метод, при котором инициация вызывается одно­ кратным внутрибрюшинным введени­ ем Ν-нитрозодиэтиламина (НДЭА). Испытуемое вещество вводят в течение 6 нед после инъекции НДЭА. Частич­ ную гепатэктомию выполняют на фоне введения испытуемого вещества — на 3-й неделе после инъекции НДЭА. Тестирование заканчивают через 8 нед после начала опыта. Показателями эф­ фективности являются среднее количе­ ство гиперпластических очажков и узелков в печени и их размер. Было ус­ тановлено, что примерно 2 % их пере­ ходит в гепатоцеллюлярный рак.

В течение определенного времени маркером предопухолевых изменений в печени считался фермент γ-глута- милтранспептидаза (ГГТ), активность которого в гиперпластических очаж­ ках и узелках была значительно выше, чем в окружающей паренхиме печени. В последующем в качестве такого маркера стали применять плацентар­

ную форму гамма-глутатион-S-трансфера- зы (ГСТ-П), активность которой так­ же выше в предопухолевых узелках и которая легко определяется иммуногистохимически. Эта модель позволя­ ет удовлетворительно предсказывать канцерогенность агентов, органоммишенью для которых является пе­ чень. В ряде случаев, однако, увеличе­ ние количества очажков, дающих по­ ложительную реакцию на ГСТ-П, на­ блюдалось и под действием канцеро­ генов с иной органотропностью.

4.2.2.1.2.2. Мультиорганные модели

Данные модели включают или на­ чальную инициацию N-метил-N- нитрозомочевиной (НММ), или ини­ циацию несколькими канцерогена­ ми с последующим — в обоих случа­ ях — введением испытуемого вещест­ ва в течение 12—20 нед. Эта модель позволяет идентифицировать канце­ рогены с различным органотропизмом.

Инициация N-мemun-N-Humpoзомо-

чевиной (НММ). НММ — канцероген прямого действия, способный вызы­ вать опухоли или инициировать их во многих органах — нервной системе, кроветворной ткани и др. Инициация вызывается 8-кратным (по 2 раза в не­ делю) внутрибрюшинным введением НММ, после чего испытуемое веще­ ство вводят в течение 20 нед. Показа­ телями канцерогенности являются возникновение доброкачественных и злокачественных опухолей, а также в зависимости от органа — гиперплазия, дисплазия, аберрантные крипты в кишечнике, измененные пилорические железы в желудке, измененные канальцы в почках и т. д.

Недостатком модели является ран­ няя гибель части животных от лимфом и лейкемий и недостаточно ши­ рокий спектр инициированных орга­ нов, в частности отсутствие инициа­ ции в печени.

Инициация комбинацией нескольких канцерогенов. Используют три извест­ ных канцерогена с различным спек­ тром вызываемых ими опухолей: НДЭА (гепатоканцероген), НММ (см. выше) и N-нитрозобис(2-гидрокси- пропил)амин (НБГПА), вызывающий у крыс опухоли щитовидной железы, мочевого пузыря, почек. При разра­ ботке этой модели была использована следующая схема введения канцерогенов: НДЭА однократно в/б 100 мг/кг (1-й день), 4 инъекции в/б НММ по 20 мг/кг на 3, 6, 9, 12-й дни; НБГПА с питьевой водой в концентрации 0,1 % в течение 2 нед с 15-го по 28-й день. В

последующем испытуемое вещество вводили в течение 20 нед.

Для проверки эффективности мультиорганных моделей в качестве испытуемых веществ использованы известные канцерогены. Результатом было значительное увеличение часто­ ты изменений в органах, являющихся мишенями для этих канцерогенов, по сравнению с животными, которые по­ лучали эти вещества без предвари­ тельной инициации.

4.2.2.1.2.3. Модели опухолей отдельных органов

Кожа мышей. Это классический орган для изучения двухили много­ стадийного канцерогенеза. Она была использована для определения ини­ циирующей или промоторной актив­ ности многих соединений. В первом случае испытуемое вещество наноси­ ли на кожу несколько раз в качестве инициатора, вслед за чем производи­ ли многократное нанесение известно­ го промотора (ТФА). Для определения промоторной активности на кожу од­ нократно наносили субканцерогенную дозу ДМБА, после чего начинали по­ вторное нанесение испытуемого ве­ щества. В обоих случаях имеется по­ ложительный контроль — субканцеро­ генная доза ДМБА в сочетании с по­ вторным нанесением ТФА. Недоста­ ток этой модели состоит в том, что многие канцерогены (например, нитрозамины, ароматические амины) не проявляют своей активности в коже мышей.

Легкие мышей линии А. Мыши этой линии, а также, хотя и в меньшей сте­ пени, линии BALB/c характеризуются высокой спонтанной частотой опухо­ лей легких, которые быстро и в боль­ шом проценте случаев возникают под действием некоторых классов химиче­ ских канцерогенов (ПАУ, нитрозамины, карбаматы, гидразины). Эта мо­ дель была использована для тестиро­ вания нескольких сот химических со­ единений. Поскольку многие из из­ вестных химических канцерогенов на

этой модели дали ложноотрицательные результаты, отрицательные ре­ зультаты, полученные на этой модели, не должны приниматься во внимание.

Молочные железы крыс Sprague— Dowley. Опухоли молочных желез (ОМЖ) у крыс данной линии легко индуцируются ПАУ (MX, БП, но осо­ бенно ДМБА) и НММ, которые и мо­ гут быть использованы в качестве инициаторов двухстадийного канце­ рогенеза. Применение этой модели не было широким.

Мочевой пузырь крыс. В качестве инициатора используют Ν-нитрозобу- тил(4-гидроксибутил)амин в концен­ трации 0,01 или 0,05 % в питьевой во­ де в течение 4 нед, после чего в тече­ ние 32 нед дают испытуемое вещест­ во. Эффект оценивают или по предопухолевым изменениям (сосочковая или узелковая гиперплазия), или по опухолям (папилломы и рак). Чувст­ вительность модели может быть уве­ личена, а латентный период сокращен до 24 нед путем добавления урацила или односторонней перевязки моче­ точника, усиливающих пролиферацию эпителия.

Желудок крыс. М-метил-М-нитро- Ν-нитрозогуанидин (МННГ), извест­ ный как сильный канцероген желези­ стого желудка у крыс, используется в качестве инициатора. Его вводят внутрижелудочно в дозе 160 мг/кг, после чего дают испытуемое вещество в те­ чение 14 нед в сочетании с 4-кратным внутрижелудочным введением насы­ щенного раствора поваренной соли, повреждающей слизистую оболочку желудка и делающей ее более чувстви­ тельной к канцерогену. Все испыта­ ние занимает менее 40 нед.

Поджелудочная железа крыс. N- нитрозобис(2-оксопропил)амин, вво­ димый подкожно, — инициатор кан­ церогенеза поджелудочной железы у самок сирийских хомячков и у крыс. У последних в качестве инициатора могут быть использованы также азасерин и 4-гидроксиаминохинолин 1-ок­ сид. Промоторная активность испы­ туемого вещества определяется его

введением в течение длительного сро­ к а — д о 18 мес. У хомячков холиндефицитная диета и добавление L-ме- тионина делают модель более чувст­ вительной.

Щитовидная железа крыс. В каче­ стве инициатора используют Ν-нит- робис(2-гидроксипопил)амин, вводи­ мый внутрибрюшинно, подкожно или с питьевой водой. Перед началом тес­ тирования рекомендуется определять в сыворотке уровень йода, Т4 и тиреотропного гормона гипофиза.

4.2.2.1.3. Трансплацентарный и неонатальный канцерогенез

Хорошо известна высокая чувстви­ тельность плодов и новорожденных к определенным канцерогенам. При трансплацентарном воздействии необ­ ходимо учитывать период беременно­ сти, в течение которого плод наиболее чувствителен к канцерогенам. Нужно также иметь в виду, что канцерогены, нуждающиеся в метаболической акти­ вации этими методами, обнаружива­ ются с трудом из-за неразвитости у плодов и новорожденных печеночной системы метаболизма ксенобиотиков.

4.2.2.1.4.Нокаутные

итрансгенные животные

Использование животных со спе­ цифически измененным генотипом в перспективе позволяет не только со­ кратить латентный период возникно­ вения опухолей и снизить число под­ опытных животных, но и более при­ ближенно моделировать механизм канцерогенеза у человека.

Линии трансгенных животных, предназначенные для скрининга кан­ церогенов, создаются на основе зна­ ний о механизмах химического бластомогенеза. В частности, ряд линий был создан на основе модели рака толстой кишки. Согласно этой модели на ранних стадиях атипичной проли­ ферации эпителия активируется онко­ ген ras, а на стадии злокачественной опухоли инактивируется супрессор

р53. Активация онкогена моделирует­ ся на мышах двух линий. Линия TgAC несет в 11 -й хромосоме мутантный эндогенный v-Ha-ras под эм­ бриональным глобиновым промото­ ром. Трансген экспрессируется в кератоцитах базального слоя эпидерми­ са только при действии канцерогенов, что приводит к возникновению па­ пиллом и карцином. Он может быть активирован также и в преджелудке грызунов. Линия TG.ras-h2 несет мутантный Ha-ras человека. Инактива­ ция супрессора опухолевого роста мо­ делируется на линии, гетерозиготной по р53 (TG.p53+/-).

Верификация указанных трансген­ ных моделей продемонстрировала их способность выявлять многие генотоксичные и негенотоксичные канце­ рогены человека менее чем за 6 мес против 24 в классическом хрониче­ ском эксперименте. При этом бензол, вызывающий у человека лейкозы, ин­

дуцировал у мышей Tg.AC опухоли кожи и кроветворной системы, у TG.p53+/— — опухоли кроветворной системы, а у TG.ras-h2 — опухоли лег­ ких и преджелудка. В экспериментах с негенотоксичным циклоспорином А опухоли возникли у мышей Tg.AC и TG.ras-h2, но не у TG.p53+/-. В то же время в последние годы появились данные о том, что мыши TG.AC не­ чувствительны к таким канцерогенам человека, как фенацетин, и слабо чув­ ствительны к мелфалану и циклофосфамиду.

Один из вариантов тактики ис­ пользования трансгенных животных, разрабатываемый в США Food and' Drug Administration (FDA), представ­ лен на схеме 4.4.

На этапе предварительных испыта­ ний изучают физико-химические свойства молекулы испытуемого ве­ щества, проводят поиск канцероген­ ных аналогов и испытания на гено-

токсичность в краткосрочных тестах. Если соединение генотоксично и ре­ зультат этот несомненен, его относят к потенциальным канцерогенам либо предлагают испытать в хроническом эксперименте. Последнее вызвано тем, что примерно '/3 соединений, му­ тагенных в системах in vitro, не дает опухолей у животных и, наоборот, ряд канцерогенов обладает негенотоксичлным механизмом действия in vivo.

В случае, если результаты тестов на генотоксичность неоднозначны, вы­ полняют исследование на мышах TG.p53+/—, которые высокочувстви­ тельны к генотоксичным канцероге­ нам. Положительный ответ дает осно­ вание считать агент канцерогеном ли­ бо испытать его в хроническом экспе­ рименте. Отрицательный результат должен быть подтвержден опытами на TG.AC или отвергнут. В последнем случае соединение относят к канцеро­ генам или предлагают испытать в хро­ ническом эксперименте.

Некоторые исследователи использу­ ют мышей Ras Н2 вместо TG.p53+/—.

Соединения, изначально не обна­ ружившие генотоксичных свойств, изучают на новорожденных мышах или мышах TG.AC, чувствительных к канцерогенам обоих типов. Отрица­ тельный результат дает основание считать агент небластомогенным при условии, что он не вызывает патоло­ гических эффектов, связанных с дру­ гими негенотоксичными механизмами канцерогенеза. К ним относят способ­ ность изменять гормональный баланс или экспрессию ростстимулирующих факторов, усиливать пролиферацию через цитотоксичность, ингибировать апоптоз, нарушать клеточное взаимо­ действие, индуцировать цитохром Р450, изменять уровень метилирова­ ния и т. д. Положительный же резуль­ тат позволяет отнести соединение к негенотоксичным канцерогенам, если выяснен механизм его действия. В противном случае предлагается иссле­ дование в хроническом эксперименте.

Некоторые авторы считают, что при наличии достаточных данных о

химической природе класса соедине­ ний, к которому относится испытуе­ мый агент, для окончательного выво­ да может быть достаточным испыта­ ние только на трансгенных животных. Другое предложение состоит в том, чтобы в хроническом эксперименте на двух видах животных заменить обыч­ ных мышей трансгенными либо про­ изводить тестирование на канцерогенность только на трансгенных мышах.

Изучается также много других ли­ ний, моделирующих факторы пред­ расположенности к возникновению опухолей. Например, нарушенный процесс репарации моделируется ли­ нией ХРА, дефектной по генам эксцизионной репарации. Эта линия оказа­ лась не только жизнеспособной, но и низкораковой в плане возникновения спонтанных опухолей. В то же время мыши этой линии обладают высокой чувствительностью к ряду канцероге­ нов. УФ-излучение и 7,12-диметил- бенз(а)антрацен интенсивно вызыва­ ют у них папилломы и карциномы ко­ жи. Другие генотоксичные канцероге­ ны индуцируют лимфомы, опухоли печени, мочевого пузыря и кишечни­ ка. Примером двухкомпонентной сис­ темы со сверхвысокой чувствительно­ стью к канцерогенному действию ультрафиолетового излучения могут служить гибриды мышей, дефектных по р53 и группе генов эксцизионной репарации. У таких животных возни­ кает гораздо больше дедифференцированных карцином кожи даже по сравнению с ХРА. Путем скрещива­ ния такого рода мышей с мутантами, дефектными по репарации метилгуаниновых аддуктов ДНК, предполага­ ется получить линию с высокой чув­ ствительностью к любым алкилирующим соединениям.

У линий животных, создаваемых для скрининга канцерогенов, предпо­ лагается модифицировать и другие механизмы клеточного и тканевого гомеостаза, связанные, в частности, с передачей межклеточных сигналов, системами поддержания нормальной экспрессии генов и генетической ста-

мах. Ряд повреждений генетического аппарата клетки, вызываемых канце­ рогенами, носит более грубый харак­ тер и может распознаваться цитогенетическими методами. Очевидно, что следующие поколения КСТ будут включать тесты, позволяющие выяв­ лять канцерогены и с иными механиз­ мами действия.

Промоторы в биологически актив­ ных концентрациях не повреждают ДНК. Они оказывают плейотропное действие на клетки: в частности, из меняют структуру и функции клеточ ных мембран, нарушают проницае­ мость межклеточных контактов. Соот­ ветственно КСТ для промоторов на­ правлены на выявление этих особен­ ностей.

Интегральным показателем канце­ рогенной активности химического агента может служить его способность трансформировать клетки в культуре что также используется в ряде КСТ.

4.2.2.2.1. Мутагенез и канцерогенез

Предложенная в начале XX в. Т. Бовери мутационная теория происхо­ ждения злокачественного роста исхо­ дила из существования наследуемых форм опухолей, имеющих сходную локализацию и гистологическое строение, и наличия наследственных болезней, при которых высокая часто­ та мутирования соматических клеток коррелирует с возникновением опухо­ лей различной локализации и строе­ ния. В настоящее время к этому при­ бавились данные о моноклональном происхождении опухолей, инициации канцерогенеза путем трансфекции клеток мутантными онкогенными по­ следовательностями ДНК, активации онкогенов или инактивации супрессоров в результате единичной точковой мутации и др.

шения ее первичной структуры, за­ крепление которых в последующей репликации приводит к возникнове­ нию популяции клеток с мутантными молекулами.

Рассматривая связь мутагенеза и канцерогенеза на уровне скрининговых тестов, следует иметь в виду, что понятия "мутаген" и "канцероген" полностью совпадают только в том случае, если показано, что агент спо­ собен индуцировать мутации в той ткани-мишени, где впоследствии об­ разуется опухоль. В то же время агент, мутагенность которого показана на иных моделях, в силу ряда причин (неадекватный метаболизм, особенно­ сти проницаемости ткани и др.) мо­ жет оказаться немутагенным для этой мишени и, следовательно, неканцеро­ генным. Четкое понимание этого ог­ раничения необходимо для экстрапо­ ляции данных с простых систем на сложные и для оценки ложноположительных и ложноотрицательных ре­ зультатов тестирования.

Разрабатывают подходы, позволяющие регистрировать мутагенный эффект непосредственно в тканях ор­ ганизма. Это стало возможным путем включения в геном конструкций, ко­ торые визуализируют мутации путем синтеза окрашенного белка. Транс­ генные мыши Big Blue® содержат ген lad, являющийся мишенью для мута­ генов. Эта модель позволяет регистри­ ровать и количественно учитывать точковые мутации, небольшие делеции или инсерции, возникающие в любых тканях животного как спонтанно, так и при действии мутагенов При этом стало возможным не только определять органы-мишени, но и ко­ личественно сравнивать уровень мута­ генеза в тканях, различающихся по характеру метаболизма испытуемого агента и соответственно эффективно­ сти канцерогенеза.

ляют ДНК и вектором инфицируют бактериальную культуру. Если репрессор инактивирован мутацией, это вид­ но по экспрессии β-галактозидазы — продукта гена lacZ. Эффект можно на­ блюдать на культуре Е. coli SCS-8, растущей на среде с хромогенным субстратом (5-бром-4-хлор-3-индо- лил-бета-D-галактопиранозид). Коло­ нии, пораженные мутантным фагом, растут в виде голубых пятен. Отноше­ ние количества окрашенных колоний к неокрашенным является показате­ лем мутагенной активности испытуе­ мого агента.

В большинстве случаев частота му­ таций в lacZ, возникающих в ответ на введение генотоксичного агента тако­ го рода животным, соответствует тка­ невой и органной специфичности его канцерогенного действия.

4.2.2.2.2. Метаболическая

активация проканцерогенов в системе скрининговых тестов

Большинство классов химических канцерогенов существует в виде инертных соединений, обозначаемых как проканцерогены. В активные электрофильные формы их превраща­ ют ферменты клетки, преимуществен­ но монооксигеназы системы цитохрома Р450. У млекопитающих эта систе­ ма экспрессируется в большинстве тканей, но более всего в печени.

Для детекции генотоксичных эф­ фектов химических канцерогенов ис­ пользуют бактерии или длительно культивируемые линии клеток млеко­ питающих, которые в большинстве своем либо вовсе не имеют системы метаболической активации проканце­ рогенов, либо ее активность не адек­ ватна таковой у млекопитающих. В связи с этим в скрининговых тестах используют экзогенную активацию с помощью очищенных в различной степени монооксигеназ из фракции эндоплазматического ретикулума пе­ чени грызунов, чаще всего крыс. Из других приемов активации, применяе­ мых в экспресс-тестах, следует упомя­

нуть культуры метаболически компе­ тентных клеток ("кормилка") и акти­ вацию in vivo в организме животногопосредника. Использование каждого из них имеет свои преимущества и не­ достатки.

Субклеточные фракции. Наиболее широкое распространение в экспресстестах получило использование постмитохондриальной фракции S-9 или S-15, получаемой путем центрифуги­ рования при 9000 или 15 000 g гомогената печени животных. Постмитохондриальная фракция содержит как фер­ менты эндоплазматического ретикулу­ ма, так и ферменты цитозоля. Недос­ татком данной системы является при­ сутствие нуклеофильных акцепторов в самой системе активации, что приво­ дит к связыванию активных канцеро­ генов и неполному их выявлению. Кроме того, постмитохондриальные фракции, особенно S-9, токсичны для клеток-мишеней, однако доступность метода, легкость его применения (предынкубация проканцерогена с фракциями S-9 или S-15) привели к широкому использованию данной системы активации практически во всех экспресс-тестах системы рутин­ ного скрининга канцерогенов. Токси­ ческий эффект активирующей смеси может быть снижен, если работать с выделенными из микросомной фрак­ ции ферментами эндоплазматического ретикулума. Очищенную фракцию мембран получают ультрацентрифуги­ рованием ранее полученных фракций S-9 или S-15 при 105 ООО g в течение 1 ч. Активация в такой системе дает представление о путях метаболизма конкретных проканцерогенов в систе­ ме микросомных монооксигеназ, од­ нако отсутствие ферментов, локализо­ ванных в цитозоле клетки, является ее существенным недостатком.

Базальный уровень активности микросомных монооксигеназ, когда они метаболизируют только эндоген­ ные субстраты (стероидные гормоны, холестерин), невысок, поэтому при­ нято повышать ее активность путем предобработки животных сильным

индуктором этой системы — арохлором 1254 или его аналогом соволом. В отдельных случаях для этой цели ис­ пользуют индукторы типа фенобарби­ тала или 20-метилхолантрена.

В последние годы появились штаммы бактерий, обладающие соб­ ственной системой активации про­ канцерогенов. В геном таких бакте­ рий встроены локусы цитохрома Р450 под промотором генов теплового шока.

Культуры клеток. Существует дос­ таточно данных о том, что спектры метаболитов проканцерогенов, акти­ вируемых субклеточными фракция­ ми, не идентичны тем, которые полу­ чаются при метаболизме этих агентов в клетке. Искажение картины мета­ болизма при использовании фракции S-9 происходит, в частности, из-за нарушения пространственной взаи­ мосвязи различных ферментов, уча­ ствующих в метаболизме, снижения концентрации кофакторов, наруше­ ния соотношения концентрации фер­ мента и субстрата и т. д. В связи с этим для активации проканцерогенов широко используют культуры мета­ болически активных клеток, в основ­ ном гепатоцитов, которые служат "кормилкой" для клеток-мишеней прокариотического или эукариотического происхождения. В других тес­ тах, например в тесте на индукцию репаративного синтеза ДНК, исполь­ зуют переживающие культуры гепа­ тоцитов взрослых крыс, которые ак­ тивируют проканцероген и одновре­ менно являются мишенями для дей­ ствия его метаболитов. К недостат­ кам данного приема метаболической активации относятся усложнение процедуры тестирования и трудно­ сти, связанные с получением и под­ держанием метаболически активных клеток.

Активация in vivo. Иногда в качест­ ве активатора проканцерогенов ис­ пользуют организм в целом. При этом методе можно получить информацию не только о путях метаболизма проканцерогена, но и о его динамике в

организме. В качестве мишеней обыч­ но служат клетки самого животного — лимфоциты, клетки костного мозга или половые клетки. Иногда живот­ ному вводят внутрибрюшинно чуже­ родные клетки тесторных штаммов или микроорганизмы в сочетании с введением канцерогена. Практическое использование последнего приема на­ ряду с понятными преимуществами создает значительные трудности вследствие реакции организма на это введение.

Таким образом, метаболическая активация канцерогенов является су­ щественным моментом скрининга канцерогенов, поэтому ее приемы достаточно жестко регламентированы в соответствующих методических ре­ комендациях.

4.2.2.2.3. Принципы формирования батарей КСТ

В связи с тем что большинство КСТ моделирует отдельные этапы канцерогенеза, наиболее успешным является их использование в виде ба­ тарей, т. е. набора тестов. Подобные батареи должны отвечать ряду требо­ ваний. КСТ, включаемые в одну бата­ рею, должны быть взаимодополняю­ щими, т. е. отличаться или по конеч­ ному эффекту (повреждение ДНК, генные мутации, хромосомные абер­ рации, неопластическая трансформа­ ция, нарушение метаболической коо­ перации и др.), или по уровню орга­ низации объекта исследования (про­ кариоты, эукариоты; системы in vitro или in vivo). При этом последователь­ ность испытаний предполагает движе­ ние от простых экспериментов к сложным и от кратких к более дли­ тельным.

Для выявления одних и тех же эф­ фектов существует ряд равноценных тестов. В зависимости от особенно­ стей тестируемого препарата одним методам следует отдавать предпочте­ ние перед другими. В этом смысле ба­ тарея КСТ не является жестко фикси­ рованной.

КСТ

Принятые в настоящее время ме­ тодические рекомендации по скри­ нингу химических канцерогенов пре­ дусматривают следующий минимальный набор тестов.

Тесты на генные мутации. Тест Эймса с использованием экзогенной метаболической активации фракцией S-9 печени крыс. Аналогичными яв­ ляются индукция соматических мута­ ций или рецессивных сцепленных с полом леталей у дрозофилы, а также индукция мутаций в культуре клеток млекопитающих (с экзогенной мета­ болической активацией).

Цитогенетические тесты. Индук­ ция хромосомных перестроек в клет­ ках костного мозга мышей или индук­ ция микроядер с введением препарата in vivo.

Тесты на повреждения ДНК. Recтест на Е. coli или индукция внепла­

Д Н К методом щелочной элюции или индукция SOS-ответа бактериальной клетки (SOS-хромотест).

В определенных ситуациях (см. ни­ же) в батареи должны быть включены тесты на промоторную активность и прямые экспресс-тесты, где опухоли индуцируются ускоренно. Из этих тестов весьма важны и информативны трансформация клеток в культуре и индукция опухолей у гидробионтов. Оба метода более длительны, чем приведенные выше КСТ, однако и они в 4—6 раз короче хронических опытов по индукции опухолей у крыс

и мышей.

Среди методов выявления промоторов наиболее верифицированы тест на нарушение метаболической кооперации в смешанной культуре ГФРТ+ и ГФРТ- соматических клеток млекопитающих и тест на нарушение перетекания флюоресцирующего красителя при микроинъекции его в отдельные клетки культуры ткани.

ных генотоксичных тестов на канце­ рогенных соединениях человека пока­ зала, что по чувствительности и спе­ цифичности ее данные не уступают результатам тестирования в хроническом эксперименте на двух видах гры­ зунов (табл. 4.2).

4.2.2.2.4. Индивидуальные

скрининговые тесты

4.2.2.2.4.1. Определение мутагенности с помощью бактериальных тест-систем

Несомненным достоинством бактериальных тест-систем является их высокая чувствительность. В результа­ те быстрого размножения бактериаль­ ных клеток можно выявлять мутации, которые в обычных условиях в от­ дельном локусе происходят с частотой порядка 1 · 10-6. Созданы штаммы, об­ ладающие сверхвысокой чувствитель­ ностью к мутагенам различных клас­ сов. Они несут ряд мутаций, повы­ шающих проницаемость их стенок для крупных гидрофобных молекул, нару­ шающих процесс репарации ДНК и др.

Показателем генотоксичности ча­ ще всего являются мутации (прямые или обратные) или гибель клеток штаммов, не способных репарировать ДНК . Наибольшее распространение получил тест, основанный на индук­ ции обратных мутаций у штаммов Sal­ monella typhimurium, дефектных по способности синтезировать гистидин (his-). В этом тесте на чашках с селек­ тивной средой регистрируется появле­ ние колоний вследствие мутирования

от ауксотрофности к прототрофности (his- - his+).

Ввиду того что у бактерий отсутст­ вуют ферментные системы, активи­ рующие проканцерогены у млекопи­ тающих, метаболические превраще­ ния изучаемого агента осуществляют­ ся добавляемой к инкубационной смеси постмитохондриальной фрак­ цией (фракция S-9) из печени млеко-

питающих. В связи с этим данный тест обозначается как тест Salmonella/ microsome, или, по автору, как тест Эймса. В данном тесте изучены тыся­ чи соединений, причем в отдельных группах генотоксичных агентов корре­ ляция с канцерогенностью достигала 94 %, в то время как у соединений, не обладающих электрофильностью и не приобретающих ее в ходе метаболиз­ ма, она была минимальной. Приме­ ром канцерогенов человека, не инду­ цирующих мутаций в тесте Эймса, яв­ ляются асбест, никель, мышьяк, син­ тетические эстрогены и подобные им соединения.

Следует отметить, что никакой корреляции между величиной мута­ генной активности вещества в мик­ робном тесте и степенью его канцеро­ генности для животных не наблюдает­ ся. Сильный микробный мутаген мо­ жет быть слабым канцерогеном и на­ оборот. Кроме того, в микробном тес­ те на мутагенность не всегда проявля­ ют активность канцерогены, вызы­ вающие хромосомные аберрации.

В целом, несмотря на эти ограни­ чения, бактериальные тест-системы оказались чрезвычайно информатив­ ным инструментом для первого этапа скрининга. В развитии данного мето­ да перспективными представляются пути повышения специфичности этих тестов. Создаются штаммы нового по­ коления, с помощью которых можно охарактеризовать мутагенный спектр неизвестного агента и тип мутаций, которые он вызывает. Некоторые из таких штаммов чувствительны к очень узкому спектру мутагенов, например к агентам, вызывающим только один из шести возможных вариантов замены пар оснований. Например, на таких штаммах 5-азацитидин вызывает толь­ ко трансверсивную реверсию типа CG—GC; Ν-4-аминоцитидин — толь­ ко AT—GC, а нитрозогуанидин — ТА—GC и GC—ТА. Супермутаген метилметансульфонат индуцирует зна­ чительно более широкий спектр мута­ ций. Это открывает возможность изу­ чения корреляции между мутагенным

эффектом агентов в прокариотических системах с особенностями их действия на эукариот.

4.2.2.2.4.2. Определение мутагенности на дрозофиле

Индукция рецессивных летальных мутаций, сцепленных с полом. Метод Миллер-5 или CIB позволяет оценить способность испытуемого агента и продуктов его метаболизма вызывать генные мутации в половых клетках дрозофилы. Рекомендуемые методы основаны на индукции исследуемыми препаратами в Х-хромосоме самцов дикого типа рецессивных летальных мутаций, которые через дочерей пере­ даются самцам второго поколения, не доживающим до стадии имаго.

Индукция соматического мозаицизма.

Метод заключается в интегральном вы­ явлении рекомбинационных и других мутационных событий, индуцируемых в соматических клетках личинок дро­ зофилы. В основе метода лежит учет мозаичных пятен, возникающих в ре­ зультате всего комплекса нарушений генотипа: митотической рекомбина­ ции, потери хромосом или фрагментов хромосом, транслокаций, делеций и генных мутаций. В качестве маркеров возможно использование любых из следующих тестерных линий: генов системы у и sn3 в транс-положении, wco/w компаунда, расположенных в X- хромосоме, а также аутосомных марке­ ров mwh. fir, находившихся в транс-по­ ложении. При использовании марке­ ров, локализованных в Х-хромосоме, оценку генетической активности про­ изводят раздельно для самцов и самок. На самках дифференциально оценива­ ют уровень хромосомных потерь, круп­ ных хромосомных перестроек, рекомбиногенной активности и частоту му­ таций разных типов; на самцах регист­ рируют уровень генных мутаций и внутрилокусных микроделеций по ис­ следуемому гену.

Одним из перспективных направ­ лений является изучение эффекта супрессоров опухолевого роста дрозо-

ции в генах, контролирующих различ­ ные этапы процессов репарации в бактериальной клетке (мутации pol А и RecA). При наличии ДНК-повреж- дающего эффекта исследуемого веще­ ства рост мутантных бактерий не ре­ гистрируется, тогда как бактерии ди­ кого типа при данных концентрациях агента растут нормально.

Бактериальный SOS-хромотест.

Основой тест-системы является штамм E.coli, несущий плазмиду, сконструированную посредством объ­ единения гена lacZ c SOS-индуцирую­ щим промотором плазмиды ColEl. В результате этого объединения синтез белка гена lacZ β-галактозидазы пол­ ностью зависит от промотора плазми­ ды ColEl, работа которого в свою оче­ редь индуцируется повреждениями ДНК. Таким образом, количество продуцируемой β-галактозидазы свя­ зано со степенью повреждения ДНК.

Определение репаративного синтеза ДНК в культуре клеток млекопитаю­ щих. В ответ на повреждение ДНК генотоксичными ксенобиотиками акти­ вируются системы восстановления ДНК, в частности эксцизионная репа­ рация. Одним из ее этапов является репаративный синтез, который доста­ точно просто зарегистрировать по включению меченого тимидина в ДНК клеток, находящихся вне S- фазы.

4.2.2.3. Прямые ускоренные методы

Под прямыми ускоренными мето­ дами выявления канцерогенности по­ нимают тесты, основанные на непо­ средственной регистрации опухолей под действием испытуемых агентов у животных, обладающих повышенной чувствительностью к канцерогенам.

4.2.2.3.1.Индукция опухолей

уаквариумных рыб

Наиболее апробированным в этом отношении тестом является метод ус­ коренной оценки канцерогенной ак­

тивности на аквариумных рыбах (гуп­ пи, данио-рерио и медака). При оцен­ ке результатов хронических опытов на рыбах используют следующие крите­ рии: время появления первой опухоли в группе, частота опухолей (процент животных с опухолями), средний ла­ тентный период развития опухолей, количество опухолевых узлов на одну рыбу, первичная множественность опухолей, процент злокачественных опухолей, частота метастазирования, гистологическая структура опухолей.

Чаще всего у рыб наблюдаются но­ вообразования печени — гепатоцеллюлярные аденомы и карциномы, холангиомы и холангиокарциномы. Опухоли могут развиваться в кишеч­ нике, щитовидной железе, жабрах, пищеводе, головном мозге, почках, гонадах, поджелудочной железе, встречаются и мезенхимальные опухо­ ли брюшной полости. Все эти новооб­ разования чрезвычайно похожи на аналогичные опухоли у грызунов.

Частота индуцированных опухо­ лей у рыб колеблется в весьма широ­ ких пределах (до 100 %). Это связано как с различиями канцерогенной ак­ тивности химических соединений, так

ис особенностями постановки экспе­ римента (температура, длительность экспозиции, доза, метод аппликации

идр).

4.2.2.3.2.Неопластическая трансформация клеток грызунов в культуре ткани

В основе метода лежит способ­ ность канцерогенных агентов in vitro трансформировать нормальные клет­ ки млекопитающих в злокачествен­ ные. Используют как культуры пер­ вичных эмбриональных клеток, так и клетки иммортализованных линий. В условиях культуры этот процесс про­ исходит значительно быстрее, чем в организме.

О трансформирующем действии испытуемого вещества судят по харак­ теру очагов роста. Колонии трансфор­ мированных клеток при достаточном

навыке легко распознают по их мно­ гослойному росту, отсутствию одно­ направленной ориентированности. Та­ кие колонии состоят из резко поляри­ зованных, перекрещивающихся, рас­ положенных в несколько слоев кле­ ток. Окраска их более интенсивна за счет многослойности. Линии, полу­ ченные из клеток таких колоний, об­ ладают пониженной чувствительно­ стью к концентрации сыворотки в культуральной среде, растут в полу­ жидком агаре, а при прививке сингенным животным вызывают появление опухолей. Показателем активности испытуемого вещества является соот­ ношение колоний трансформирован­ ных и нетрансформированных клеток.

4.2.2.4. Тесты для скрининга опухолевых промоторов

Угнетение метаболической коопера­ ции в смешанной культуре клеток. В

тесте используют клетки, чувствитель­ ные (ΤΓS) и резистентные (ТГR) к ток­ сичному аналогу пуриновых оснований 6-тиогуанину. Резистентность клеток к 6-тиогуанину обусловлена отсутствием у них фермента гипоксантин-гуанин- фосфорибозилтрансферазы (ГФРТ), превращающего 6-тиогуанин в нуклеозид, включающийся в ДНК. Выживае­ мость ТГR-клеток в смешанной культу­ ре с ТГS-клетками на среде с 6-тиогуа- нином резко снижается, так как в ТГS- клетках образуется нуклеозид 6-тиогуа- нина, который через щелевые контак­ ты поступает в ТГR-клетки. Опухоле­ вые промоторы снижают метаболиче­ скую кооперацию, что приводит к воз­ растанию выживаемости ТГк-клеток в смешанной культуре.

Ингибирование межклеточного обме­ на флюоресцентным красителем. В ос­ нове метода лежит способность опухо­ левых промоторов ингибировать пере­ текания инъецированного внутриклеточно через микроэлектрод флюорес­ центного гидрофильного красителя по щелевым контактам в соседние клетки. В тесте обычно используют краситель люциферовый желтый.

4.2.2.5. Правила продвижения исследуемых веществ по батарее КСТ

и интерпретация результатов испытаний

Результаты испытания препарата в батарее КСТ позволяют сделать за­ ключение о наличии или отсутствии у него потенциальных канцерогенных свойств. Это заключение носит веро­ ятностный характер. При оценке ре­ зультатов тестирования исходят из то­ го, что положительный эффект имеет преимущество перед отрицательным, а данные, полученные в эксперимен­ тах in vivo, более весомы, чем анало­ гичные, полученные in vitro. Согласно этому правилу интегральный положи­ тельный результат системы КСТ с го­ раздо большей степенью вероятности свидетельствует о потенциальной кан­ церогенной опасности препарата, чем общий отрицательный результат об ее полном отсутствии.

Работа по использованию КСТ де­ лится на несколько этапов. Первый из них основан на проведении систем­ ной оценки мутагенной активности испытуемого соединения. При этом могут встретиться 4 варианта сочета­ ний результатов, полученных при ис­ пользовании двух основных методов (табл. 4.3). В случае варианта 1 делают заключение о наличии канцерогенной

Таблица 4.3. Сочетания положительных

и отрицательных ответов в различных ме­ тодах при проведении испытаний мутаген­ ной активности потенциальных канцероге­ нов

Таблица 4.4. Сочетания положительных

и отрицательных ответов в трех группах тестов при прогнозировании канцерогенной активности

опасности и агент не подвергают дальнейшим испытаниям. В осталь­ ных трех случаях переходят к следую­ щему этапу работы.

Проводят уточняющие экспери­ менты: гес-тест или индукцию SOSответа у бактерий, а также регистра­ цию внепланового синтеза ДНК в культуре клеток млекопитающих или повреждений ДНК с помощью щелоч­ ного элюирования.

С учетом первого этапа испытаний могут получиться следующие вариан­ ты сочетаний ответов (табл. 4.4).

В случае вариантов 1, 3 и 6 даль­ нейшие испытания прекращают. В случаях 1 и 3 делают заключение о на­ личии, а в случае 6 — об отсутствии канцерогенной опасности. Для от­ дельных групп препаратов (например, гормонов), несмотря на отрицатель­ ные ответы во всех трех группах ис­ пользованных тестов (вариант 6), мо­ жет оказаться необходимым примене­ ние одного из прямых экспресс-тес­ тов на опухолеобразование (трансфор­ мацию клеток в культуре или индук­ цию опухолей у гидробионтов) или хронического эксперимента на млеко­ питающих. В этом случае заключение об отсутствии или наличии канцеро­ генной активности определяется соот­ ветственно отрицательным или поло­ жительным ответом, полученным в одном из этих двух тестов. Вопрос о

включении в систему испытаний од­ ного из названных тестов решается путем экспертной оценки. В случаях 2, 4 и 5 (см. табл. 4.4) переходят к сле­ дующему этапу испытаний. Стратегия работы на этом этапе связана с под­ тверждением или отрицанием способ­ ности исследуемого препарата инду­ цировать определенный тип генетиче­ ских эффектов. В случае варианта 2 проводят дополнительный учет ген­ ных мутаций с помощью альтернатив­ ного метода, способного зарегистри­ ровать этот тип эффектов. Конкрет­ ный метод, используемый в работе на этом этапе, зависит от того, какой из методов был применен в ходе мута­ генной оценки на первом этапе рабо­ ты. Если на первом этапе был исполь­ зован, например, учет генных мутаций на бактериях, на данном третьем эта­ пе работы применяют методы тести­ рования генных мутаций на дрозофи­ ле или в культуре соматических кле­ ток млекопитающих и наоборот.

В случае варианта 4 (см. табл. 4.4) эффект, полученный путем индукции перестроек хромосом или микроядер в клетках костного мозга мышей, про­ веряют на клетках костного мозга крыс. В случае варианта 5 единствен­ ный положительный результат, полу­ ченный с использованием бактерий (гес-тест или индукция SOS-ответа), проверяют на третьем этапе с помо­ щью методов учета повреждений ДНК в культуре клеток млекопитающих (индукция внепланового синтеза ДНК или обнаружения повреждений ДНК с помощью щелочного элюирования). При получении на данном этапе рабо­ ты положительного результата в вари­ антах 2, 4 и 5 делают заключение о наличии у исследуемого агента канце­ рогенной активности, связанной с ин­ дукцией определенного типа генети­ ческих повреждений. При получении отрицательного ответа в случае необ­ ходимости переходят к заключитель­ ному этапу испытаний, связанному с использованием одного из прямых экспресс-тестов определения канце­ рогенной активности. Заключение об

отсутствии или наличии канцероген­ ной активности у исследуемого веще­ ства делают на основании соответст­ венно отрицательного или положи­ тельного ответа, полученного в одном из этих методов. Испытания на промоторную активность проводят не всегда. Они обязательны лишь в слу­ чае, если препарат предназначен для контингентов, ранее экспонирован­ ных к инициирующим злокачествен­ ный рост воздействиям: ионизирую­ щей радиации, противоопухолевой генотоксической терапии, лечению пуваленом в комбинации с УФ-облуче- нием по поводу псориаза и др.

4.2.3. Мониторинг канцерогенов

Помимо выявления агентов, пред­ ставляющих канцерогенную опас­ ность, важнейшей задачей превентив­ ной онкологии является изучение ди­ намики содержания этих агентов в биосфере, равно как и эффектов, ко­ торые они вызывают в организме. Ре­ шение этих задач предполагает два методических подхода — физико-хи­ мический и биологический. С помо­ щью первой группы методов изучают источники образования известных канцерогенов, динамику их поступле­ ния в окружающую среду, а также на­ копление и деградацию в тканях. Био­ логический мониторинг имеет дело с последствиями действия канцерогенов на организм, причем чаще всего с ин­ тегральным эффектом совокупности факторов как канцерогенных, так и неканцерогенных.

4.2.3.1. Физико-химический мониторинг

Мониторинг внешней экспозиции человека к канцерогенам используют для многих целей, в том числе для установления предельно допустимых доз (ПДД) и предельно допустимых концентраций (ПДК) канцерогенов на рабочих местах и в быту, для изу­ чения зависимости доза—эффект,

оценки риска возникновения опухо­ лей и др.

В настоящее время разработаны и повседневно используются многочис­ ленные методы выявления практиче­ ски всех известных канцерогенов че­ ловека, будь то канцерогенные поли­ циклические углеводороды (ПАУ), нитрополиарены, ароматические ами­ ны, микотоксины, канцерогенные ме­ таллы и др. При этом используют приборы для жидкостной и газовой хроматографии, регистрации спектров флюоресценции и люминесценции и т. д. Чувствительность и избиратель­ ность используемых методов позволя­ ет обнаруживать канцерогены в мини­ мальных концентрациях — порядка сотых и тысячных долей микрограмма в пробе.

4.2.3.2. Биологический мониторинг

Недостатком физико-химического мониторинга является то, что с его помощью можно следить за динами­ кой только известных канцерогенов. Кроме того, он не учитывает особен­ ностей поступления канцерогенов в организм, например различную сте­ пень вентиляции легких у разных ин­ дивидуумов, особенности выделения этих соединений, распределение их в тканях, характер метаболических про­ цессов и доступность молекулярных мишеней для непосредственных кан­ церогенных метаболитов. Эти вопро­ сы изучаются методами биологиче­ ского мониторинга. Показателями эф­ фекта при этом являются маркеры, которые условно обозначают как био­ химические и генетические. Послед­ ние по методам выявления подразде­ ляют на цитогенетические и собствен­ но генетические. Биохимическими методами определяют наличие аддуктов, возникающих в результате ковалентного связывания метаболитов канцерогенов с ДНК или белками. Методами цитогенетики обнаружива­ ют в клетках микроядра, хромосом­ ные аберрации и сестринские хрома-

тидные обмены (СХО). Среди генети­ ческих маркеров наиболее часто ис­ пользуют выявление инактивирующих ГФРТ мутаций в лимфоцитах перифе­ рической крови или экспрессию гликофорина в эритроцитах людей, гете­ розиготных по аллелям данного гена.

Чаще всего мониторинг этих эф­ фектов производят не в тканях, непо­ средственно подвергающихся злокаче­ ственной трансформации, а в наибо­ лее доступных клетках организма, та­ ких как форменные элементы крови, уротелий или эпителий полости рта.

Содержание аддуктов канцероге­ нов в ДНК, гемоглобине или сыворо­ точном альбумине характеризует ве­ личину биологически эффективной дозы агента, отражающей индивиду­ альные особенности организма, но этот показатель является довольно кратковременным, поскольку аддукты относительно быстро удаляются в процессе репарации. Цитогенетические и генетические маркеры более постоянны. Существенно, что марке­ ры, характерные для действия некото­ рых генотоксичных канцерогенов, об­ наруживаются не только в случае опу­ холей, связанных с агентами профес­ сионального или бытового происхож­ дения, но и при изучении так назы­ ваемых спонтанных новообразований человека, когда действующее начало не известно. Например, в ДНК пече­ ни многих онкологических больных был найден более высокий уровень 04-этилтимидина, чем у неонкологи­ ческих. Данный аддукт характерен для действия канцерогенных Ν-нитрозо- соединений. У больных раком молоч­ ной железы в здоровой ткани этого органа в некоторых случаях обнару­ живают повышенный уровень арома­ тических аддуктов ДНК. Кроме того, у онкологических больных довольно часто обнаруживают микроядра в клетках крови и мутации по локусу ГФРТ.

Обнаружение определенных марке­ ров, используемых для биологическо­ го мониторинга, позволяет предполо­ жить тип канцерогена, трансформиро­

вавшего нормальные клетки в опухо­ левые. В большинстве ангиосарком, возникающих у человека при работе с винилхлоридом, обнаруживают транс­ версию AT—ТА, относительно редко встречающуюся в других опухолях че­ ловека. Характерным маркером рака легкого курильщиков является транс­ версия GC—AT. Ее уровень коррели­ рует, кроме того, со стажем курения и его интенсивностью. Такая же транс­ версия характерна и для гепатоцеллюлярных карцином, возникающих у че­ ловека в результате действия афлатоксина В[.

4.2.3.2.1. Мониторинг отдельных генотоксических канцерогенов человека

Полициклические ароматические уг-. леводороды (ПАУ). Наиболее надеж­ ным биохимическим маркером экспо­ зиции к ПАУ является выделение с мочой 1-оксипирена, а также 1- и 2- нафтола. Показатели экскреции по-, следних двух соединений используют для мониторинга загрязнения воздуха промышленных городов или рабочих мест. В последнем случае на заводах, наиболее загазованных ПАУ (произ­ водство графитовых электродов для алюминиевой промышленности, кок­ согазовая промышленность), содержа­ ние канцерогенов в воздухе коррели­ рует с уровнем выделения их метабо­ литов с мочой, а также с содержанием соответствующих аддуктов в ДНК лимфоцитов периферической крови у рабочих. У курильщиков уровень со­ держания метаболитов ПАУ в моче также значительно повышен.

Аддукты ариламинов с гемоглоби­ ном указывают на загрязнение окру­ жающей среды или рабочих мест эти­ ми соединениями. Они появляются также при курении.

У рабочих, занятых в производстве красителей на основе бензидина, вы­ зывающего у человека рак мочевого пузыря, показана четкая корреляция между уровнем экспонированности к этому канцерогену, содержанием его

метаболитов в моче, содержанием аддуктов в ДНК лейкоцитов периферической крови и в ДНК эпителия мочевыводящих путей. Менее четко выявляются эти показатели при биоло­ гическом мониторинге моноцикличе­ ских ароматических соединений типа бензола, вызывающего у человека лейкозы, и стирена. Контакт с первым канцерогеном часто имеет следствием появление гипердиплоидности по 9-й хромосоме в лимфоцитах перифериче­ ской крови и клетках эпителия рото­ вой полости. При работе со вторым агентом наиболее регулярно обнару­ живаются аддукты в ДНК клеток пе­ риферической крови, а также мутации по локусу ГФРТ, микроядра, сестрин­ ские хроматидные обмены и хромо­ сомные аберрации.

Винилхлорид, индуцирующий у че­ ловека ангиосаркомы печени, вызыва­ ет хромосомные аберрации в клетках периферической крови, появление микроядер, сестринские хроматидные обмены, ГФРТ-мутации, но не дает аддуктов в ДНК. Точно так же не уда­ ется обнаружить аддукты в ДНК и при действии этиленоксида, хотя все остальные маркеры биологического мониторинга в этом случае регулярно появляются и их количественные по­ казатели коррелируют с интенсивно­ стью экспозиции к агенту.

При лечении онкологических боль­ ных алкилирующими цитостатиками установлено появление всех маркеров, свидетельствующих об их генотоксическом действии. Для мониторинга этих соединений существенно то, что во многих случаях наблюдается прямая зависимость между дозой цитостатика и показателями его генотоксического действия на нормальные клетки.

Биологический мониторинг куре­ ния, при котором в организм поступа­ ет сложная многокомпонентная кан­ церогенная смесь, позволил устано­ вить прямую зависимость между со­ держанием в дыме отдельных канце­ рогенов и их эффектами. Принят и используется с 1994 г. скрининг ку­ рильщиков по уровню аддуктов ак-

рилнитрила в гемоглобине, содержа­ ние в дыме этиленоксида коррелирует с показателями содержания его аддук­ тов в гемоглобине, а метилирование ДНК зависит от содержания в дыме метилирующих агентов.

4.2.3.2.2. Чувствительность биомаркерного показателя

Сравнительных исследований в этой области пока мало. Наиболее представительные из них выполнены при биомониторинге профессиональ­ ных групп, экспонированных к алкилирующим канцерогенам — этиленоксиду и ПАУ. Для первого агента чув ствительность методов биомонито­ ринга убывала в ряду: аддукды гемо­ глобина, СХО, хромосомные аберра­ ции, микроядра, ГФРТ-мутации. Для ПАУ наиболее чувствительным пока­ зателем было наличие СХО. У онко­ логических больных, получавших алкилирующие химиопрепараты, этот показатель также был наиболее чувст­ вительным. За ним следовало появле­ ние микроядер и ГФРТ-мутаций.

Стабильность биомаркеров. Для стратегии мониторинга важно знать стабильность изучаемых маркеров. В зависимости от конкретных задач одни маркеры могут быть более информа­ тивными для изучения ранних эффек­ тов, другие — более поздних. В боль­ шинстве случаев лимитирующим фак­ тором является длительность жизни клетки, несущей маркер. Большая часть популяции лимфоцитов имеет "период полужизни" от 3 до 4 мес, и только отдельные субпопуляции сохра­ няются дольше — от 1 года до 6 лет.

Стабильно высокий уровень хро­ мосомных аберраций у онкологиче­ ских больных удерживается в течение полугода после окончания курса хи­ миотерапии. Значительное его сниже­ ние происходит только через 2 года. Уровень ГФРТ-мутаций при этом на­ чинает повышаться примерно через 3 мес и сохраняется не менее полутора лет. Еще более стабилен микроядер­ ный маркер — до 9 лет после оконча-

ния курса лечения химиотерапии или облучения. Повышенное содержание в крови лимфоцитов с СХО удержива­ ется несколько недель после лечения, но следы его могут обнаруживаться и через несколько месяцев. Гликофориновые мутации в эритроцитах также относительно нестабильны. Их уро­ вень возвращается к исходному в те­ чение полугода. По некоторым дан­ ным, у бросивших курить этот показа­ тель сохраняется дольше.

Показано, что у рабочих, экспони­ рованных к производственным канце­ рогенам, высокий уровень микроядер сохраняется не более 90 дней, а СХО — и через 5—10 лет после выхода на пенсию. Что касается хромосомных аберраций, то дольше всего обнару­ живаются транслокации и инсерции, сохраняющиеся в процессе деления клеток стволовой популяции. Аддукты канцерогена в гемоглобине нестабиль­ ны. Они персистируют максимум 4 мес после прекращения контакта с канцерогеном. Не все типы аддуктов ДНК имеют одинаковую стабиль­ ность. После лечения алкилирующими химиопрепаратами типа нитрозометилмочевины повышенный уровень Об-метилгуанина снижается вдвое за сутки, а N7-метилгуанина — за 60 ч. Более стабильны аддукты ПАУ, кото­ рые в ДНК лимфоцитов перифериче­ ской крови имеют период "полувыве­ дения" не менее 2—3 мес, а в ткани легких обнаруживаются в течение не­ скольких лет после экспозиции.

4.2.3.2.3. Репрезентативность тканей, используемых для целей мониторинга

Как уже упоминалось в начале это­ го раздела, биомаркеры изучаются ча­ ще всего не в тех тканях, где иссле­ дуемый канцероген может вызвать опухоль, а в других, которые более доступны и которые без особого ущерба можно брать многократно. Мониторинг канцерогенов табачного дыма показал, что существует хоро­ шая количественная корреляция меж­

ду показателями содержания аддуктов

вДНК лимфоцитов и клеток легкого.

Вслучае профессионального канцеро­ гена бензидина адекватным показате­ лем содержания аддуктов в ДНК кле­ ток мочевыводящих путей также явля­ ются периферические лимфоциты. Они же адекватно отражают уровень аддуктов в печени и легких, появляю­ щихся при воздействии на человека канцерогенных ПАУ.

Таким образом, для биологическо­ го мониторинга генотоксичных кан­ церогенов в организме человека впол­ не адекватным объектом являются пе­ риферические лимфоциты.

Связь между повышением уровня биомаркеров, индуцируемых в орга­ низме человека генотоксичными кан­ церогенами, и риском возникновения рака не вызывает сомнений. В то же время количественная оценка этого риска по данным мониторинга с ис­ пользованием биологических марке­ ров пока невозможна. Подходы к этой проблеме разрабатываются нг основе анализа наиболее известных данных об эффектах, вызываемых у человека курением или окисью этилена ("кури­ тельный эквивалент" и "эквивалент окиси этилена"). Теоретические рас­ четы, сделанные на этой основе с ис­ пользованием многочисленных упро­ щений и допущений, показали, в ча­ стности, что повышение уровня пока­ зателей различных биомаркеров по сравнению с фоном может иметь раз­ ные последствия для учащения онко­ логической заболеваемости. В частно­ сти, удвоение числа хромосомных аберраций, микроядер или СХО по

этим расчетам должно дать в 1015 раз больше дополнительных случа­ ев рака, чем удвоение уровня аддуктов в ДНК или ГФРТ-мутаций.

4.2.3.2.4. Индивидуализация мониторинга действия канцерогенов

Индивидуальная чувствительность к канцерогенным воздействиям опре­ деляется двумя основными явления-

ми — многостадийным характером процесса канцерогенеза и генетиче­ ским полиморфизмом факторов, иг­ рающих ведущую роль на каждой его стадии. Для индивидуального монито­ ринга в настоящее время наиболее су­ щественно знать особенности метабо­ лизма канцерогена у данного индиви­ дуума — его активацию, детоксикацию и показатели репаративных про­ цессов. Известно, что в человеческой популяции можно обнаружить более 1 % индивидуумов, резко различаю­ щихся по толерантности к тем или иным лекарственным препаратам. Это носители редких аллелей ферментов, метаболизирующих данные препара­ ты. Промежуточные варианты встре­ чаются значительно чаще.

Генетический полиморфизм фер­ ментов первой фазы метаболизма кан­ церогенов описан для холинэстеразы, арилэстеразы, альдегидгидрогеназы, алкогольдегидрогеназы, флавинсодержащих монооксигеназ и изоформ цитохрома Р450. Среди ферментов вто­ рой фазы — для уридиндифосфатглюкуронилтрансферазы, сульфотрансферазы, Ν-ацетилтрансферазы, глютати- oH-S-трансферазы, Ν-акрилтрансфе- разы, Ν-, О- и S-метилтрансфераз.

Среди представителей отдельных этнических групп активность фермен­

не экспрессируется у 2—30 % корен­ ных жителей Азии, а алкогольдегидрогеназа — у 85—98 %. Среди евро­ пейцев такие варианты встречаются реже — в 5—20 % случаев. В то же время потеря активности Ν-ацетил- трансферазы-2 чаще наблюдается сре­ ди европейских народов, чем среди азиатских, и т. д. Наиболее изучен­ ным с этой точки зрения является по­ лиморфизм цитохрома Р450, изоформы которого активируют целый ряд канцерогенов. Существенно, что для

страты, т. е. неканцерогенные соеди­ нения, метаболизируемые этими же

изоформами. Это дает практическую возможность для мониторинга групп повышенной чувствительности к не­ которым бытовым и промышленным канцерогенам.

Для одной из вышеупомянутых изоформ цитохрома Р450 (CYP1A1), активирующей канцерогенные углево­ дороды, была установлена корреляция между наличием мутации Val -» Ilе в 462-м кодоне 7-го экзона (в двух алле­ лях) и увеличением риска возникно­ вения рака легкого в 9 раз при куре­ нии сигарет даже в умеренном коли­ честве. Вторым условием проявления такой корреляции было отсутствие ак­ тивности фермента второй фазы мета­ болизма ксенобиотиков — GSTM1- глютатион-S-трансферазы Ml. Суще­ ствует пример и противоположного влияния. Среди субстратов, активи­ руемых изоформой CYP2D6, находит­ ся нитрозонорникотин — один из канцерогенных нитрозаминов, содер­ жащихся в дыме сигарет. В связи с этим было показано, что нуль-фено­ тип, проявляющийся у гомозигот с мутантной изоформой CYP2D6, имеет пониженную чувствительность к кан­ церогенному действию курения.

Полиморфизм детоксицирующих ферментов столь же существенен для канцерогенеза у человека, как и поли­ морфизм активирующих. По активно­ сти N-ацетилтрансферазы-2 популя­ ция может быть разделена на быстрые ацетиляторы, медленные и промежу­ точный вариант. При этом в отноше­ нии крайних форм наблюдаются большие различия по способности детоксицировать канцерогенные арома­ тические амины. Уровень ферментной активности зависит от наличия одного из трех аллелей, встречающихся в по­ пуляции с различной частотой. Гомо­ зиготы по первому аллелю являются быстрыми ацетиляторами, гомозиготы по третьему — медленными, а гетерозиготы '/2 и '/з имеют промежуточную активность. На примере рабочих, экс­ понированных к канцерогенам моче­ вого пузыря — бензидину, 4-аминоби- фенилу и 2-нафтиламину, показано,

что у медленных ацетиляторов рак мочевого пузыря возникает в 2—9 раз чаще.

Глютатион-S-трансфераза Т1 уча­ ствует в детоксикации моногалометанов. Примерно 80 % человеческой по­ пуляции обладают способностью конъюгировать эти соединения с глютатионом, у остальных она отсутству­ ет. Очевидно, что эти соединения бо­ лее чувствительны к генотоксическому действию моногалометанов.

Существование больших индиви­ дуальных различий в повреждаемости ДНК алкилирующими агентами из­ вестно из наблюдений над онкологи­ ческими больными. Количество раз­ рывов в ДНК лимфоцитов у отдель­ ных больных при идентичном курсе химиотерапии может различаться в сотни раз, что свидетельствует о боль­ шей или меньшей их предрасполо­ женности к возникновению вторич­ ных опухолей.

Такого рода предрасположенность может зависеть и от наличия первич­ ных терминальных дефектов в генах, продукты которых осуществляют по­ ложительную или отрицательную ре­ гуляцию пролиферации, а также уча­ ствуют в процессах репарации ДНК. Для таких лиц опасен даже фоновый уровень эндогенных и экзогенных канцерогенов, что следует учитывать в процессе мониторинга.

Таким образом, мониторинг инди­ видуальной чувствительности к кан­ церогенному воздействию складывает­ ся из молекулярной дозиметрии экс­

позиции и анализа факторов генети­ ческой предрасположенности.

Рекомендуемая литература

вания генотоксичности // В кн.: Мута­ гены и канцерогены в окружающей

els for identifying carcinogens. The use of short-term and medium-term tests for car­ cinogens and data on genetic defects in carcinogenic evaluation. — Lyon: IARC Press, 1999.