7.2. Распластывание и локомоция нормальных клеток

В группу гликозаминогликанов матрикса входят гиалуронат, хондроитинсульфат, гепарансульфат и др. Пе­ реплетенные цепи гликозаминоглика­ нов образуют сильно гидратированный гель (основное вещество), в кото­ рый погружены коллагеновые, эласти­ ческие и фибронектиновые волокна. Этот гель создает тургор (упругость), противодействующий сжатию мат­ рикса.

Компоненты матрикса секретируются клетками не только в организме, но и в условиях культивирования. На­ пример, фибробласты, эндотелиоциты и многие типы эпителиальных клеток в культурах секретируют фибронектин (см. рис. 7.4), многие типы клеток — коллагены, а эпителиоциты — ламинин. Эти белки, а также секретируемые протеогликаны, сорбируясь на дне культурального флакона или иной искусственной подложки, образуют тонкий промежуточный слой, кото­ рый фактически выполняет роль твер­ дого субстрата для клеток. Таким об­ разом, и в условиях организма, и при культивировании клетки вступают в контактные взаимодействия с поверх­ ностью сформированного ими вне­ клеточного матрикса.

7.2.2. Морфология процесса распластывания клеток

Контактное взаимодействие кле­ ток с твердым субстратом начинается

смомента, когда клетка, взвешенная

вжидкой среде, оседает на адгезив­ ную (липкую) для нее поверхность субстрата. Во взвеси большинство клеток имеет почти сферическую форму, которую клетки сохраняют в течение нескольких минут после со­ прикосновения с субстратом, но за­ тем начинается процесс распластыва­ ния, в течение которого клетка по­ степенно приобретает все более уп­ лощенную форму. В процессе рас­ пластывания клетка прикрепляется к субстрату в множественных дискрет­ ных участках ее базальной поверхно­ сти, в которых формируются специа-

Рис. 7.6. Начальная стадия распластыва­ ния фибробласта мыши на твердом суб­ страте: сферическая клетка с филоподиями в основании. СЭМ. Ув. 5000. (Препарат Ю. А. Ровенского.)

лизированные адгезионные структу­ ры — фокальные контакты.

Распластывание клетки осуществ­ ляется посредством ее псевдоподиальной активности — формирования раз­ ной формы выростов (псевдоподий), способных прикрепляться к поверхно­ сти субстрата. Источником механиче­ ской силы, осуществляющей протрузию (выпячивание) псевдоподии, яв­ ляется скорее всего полимеризация актиновых микрофиламентов (из мо­ номерного актина) (см. раздел 7.2.5).

На I стадии распластывания в ос­ новании сферической клетки возни­ кают нитевидные псевдоподии — фи - лоподии различной длины (рис. 7.6). Своими концами они прикрепляются к поверхности субстрата, формируя дискретные участки прочной адгезии — фокальные контакты (см. раздел 7.2.3). Вскоре филоподии сменяются псевдоподиями в виде тонких пла­ стин — ламеллоподий, которые, сли­ ваясь, образуют сплошную циркуляр­ ную пластинку — ламеллярную цито-

Рис. 7.7. Стадия радиального распластыва­ ния фибробласта мыши на твердом суб­ страте: клетка с выпуклой центральной ча­ стью и широким кольцом ламеллярной цитоплазмы на периферии. СЭМ. Ув. 1700. (Препарат Ю. А. Ровенского.)

плазму. Последняя довольно быстро распространяется радиально от осно­ вания клетки — стадия радиального распластывания (рис. 7.7). Сразу по­ сле своего возникновения филопо - дии и ламеллоподии не содержат миозина, он диффундирует в них не­ много позже. Взаимодействие миози­ на II с актиновыми микрофиламен­ тами приводит к сокращению псев­ доподий. Если они своими концами не успели прикрепиться к субстрату, то ретрактируют (втягиваются); со­ кращение прикрепившихся псевдо­ подий генерирует их центростреми­ тельное натяжение. Это натяжение приводит к постепенному уплоще­ нию клетки, которая в конце этой стадии распластывания приобретает форму диска, по всему краю которо­ го непрерывно образуются псевдопо­ дии (такой клеточный край называют активным) (рис. 7.8).

У эпителиальных клеток стадия ра­ диального распластывания является

завершающей, и клетка в дальнейшем сохраняет характерную для эпителиоцитов дисковидную форму; фибробластоподобные клетки переходят в сле­ дующую, последнюю стадию распла­ стывания, называемую стадией поля­ ризации, по окончании которой они приобретают полигональную или вы­ тянутую форму, характерную для кле­ ток этого типа (рис. 7.9).

Дисковидная форма фибробласта на стадии поляризации изменяется в результате перераспределения псевдоподиальной активности: на некоторых участках клеточного края псевдопо­ дии перестают возникать. На других участках образование псевдоподий со­ храняется, в том же направлении про­ исходит растягивание тела клетки. Перераспределение псевдоподиальной активности контролируется не только актиновым цитоскелетом, участвую­ щим в формировании псевдоподий, их прикреплении и натяжении, но и системой микротрубочек. Нарушения в этой системе, вызванные действием колцемида или таксола, в уже поляри­ зовавшемся фибробласте приводят к утрате поляризации: псевдоподии

Рис. 7.8. Окончание стадии радиального распластывания фибробласта мыши: клет­ ка уплощенной дисковидной формы. СЭМ. Ув. 800. (Препарат Ю. А. Ровен­ ского.)

Рис. 7.11. Пучки актиновых микрофила­ ментов, соединенные с фокальными кон­ тактами в фибробластах человека. Лазер­ ная конфокальная микроскопия. (Препа­ рат В. Б. Дугиной.)

бранной тирозиновой протеинкиназой Src, образуя с ней комплекс и кооперируясь в фосфорилировании по тирозину паксиллина и тензина, а также в передаче сигнала на белки се­ мейства Ras, относящегося к суперсе­ мейству так называемых малых ГТФаз (см. раздел 7.2.5). Активированные сигналом, полученным от FAK, белки Ras в свою очередь стимулируют ак­ тивность цитоплазматических протеинкиназ семейства Raf и других эф­ фекторов, которые активируют каска­ ды МАР-киназ (Mitogen Activated Pro­ tein kinases). Конечные продукты МАР-киназных каскадов переходят из цитоплазмы в ядро, где они фосфорилируют и активируют транскрипцион­ ные факторы — ядерные белки, кото­ рые могут связываться с определен­ ными генами и стимулировать их экс­ прессию. Результатом проведения сиг­ нала является экспрессия специфиче­ ских генов, включая гены, побуждаю­ щие клетку к делению (см. раздел 3.1).

Рис. 7.12. Поляризованные фибробласты мыши. СЭМ. Ув. 400. (Препарат Ю. А. Ровенского.)

внутриклеточные сигналы. Одна из сигнальных цепей является митогенной: связывание рецептора ростового фактора со своим лигандом вызывает автофосфорилирование и активацию рецепторных тирозиновых протеинкиназ, которые осуществляют дальней­ шую передачу сигнала по Ras-Raf- МАР-киназному пути (см. раздел 7.2.3), приводя к экспрессии генов, побуждающих клетку к переходу из G1 в S-фазу (фазу синтеза Д Н К ) .

Другая сигнальная цепь, "включае­ мая" рядом ростовых факторов, при­ водит к изменениям в сборке-разбор­ ке актинового цитоскелета, формиро­ вании фокальных контактов и псевдо-

подий. Такие изменения существенно влияют на форму клетки и ее локомоцию. В этой сигнальной цепи ключе­ вую роль играют белки семейства Rho/Rac: RhoA, Rac1 и Cdc42 (см. раздел 7.2.5).

Среди митогенов-мотогенов осо­ бый интерес представляет "рассеиваю­ щий фактор" (SF). Это гликопротеин, являющийся сильным митогеном для гепатоцитов и участвующий в регене­ рации печени (поэтому его называют

некоторых других типов эпителиоцитов, а также клеток сосудистого эндо­ телия. Вместе с тем H G F / S F является сильным мотогеном для различных эпителиальных клеток (например, эпителия молочных желез) и эндотелиоцитов. Этот фактор обладает, кро­ ме того, морфогенным действием: в его присутствии культивируемые эпи­ телиальные или эндотелиальные клет­ ки формируют внутри объемного вне­

специфическим рецептором — транс­ мембранной тирозиновой протеинкиназой — продуктом протоонкогена С- met. Связывание вызывает в клетке сложный каскад сигналов, ведущих в конечном счете к ее пролиферации или к приобретению поляризованной фибробластоподобной формы и локо-

миграцию клеток из пласта.

7.2.5. Роль малых ГТФаз

врегуляции актинового цитоскелета,

Rho-ГТФазы (их еще называют ма­ лыми ГТФазами) действуют как моле­ кулярные "двусторонние переключа­

тели", попеременно переходя то в ак­ тивное состояние при связывании с ГТФ, то теряя активность в результате гидролиза ГТФ до ГДФ. В регуляции перехода между активной и неактив­ ной формами малых ГТФаз участвуют три группы факторов: факторы обме­ на нуклеотидов (guanine nucleotide ex­ change factors — G E F ) , катализирую­ щие замену ГДФ на ГТФ, т. е. "вклю­ чающие" активность; белки, активи­ рующие ГТФазу (GTPasa activating proteins — GAP), т. е. стимулирующие гидролиз ГТФ и этим "выключающие"

на ГТФ, т. е. поддерживающие неак­ тивное состояние.

Вактивном состоянии малые ГТФазы взаимодействуют с различны­ ми эффекторными молекулами или молекулами-мишенями, участвуя в "нисходящей" передаче специфиче­ ских внеклеточных сигналов от "за­ действованных" рецепторов клеточной поверхности: рецепторов ростовых факторов, гормонов, хемоаттрактантов, а также рецепторных молекул ад­ гезии клеток с внеклеточным матрик­ сом. Внутриклеточная передача сигна­ лов, опосредуемых малыми ГТФаза­ ми, осуществляет регуляцию широко­ го спектра процессов, прежде всего сборки и организации актинового ци­ тоскелета и таких зависимых от него важнейших клеточных функций, как формирование псевдоподий, локомо­ ция, цитокинез, фагоцитоз и пиноцитоз, а также контактные взаимодейст­ вия клеток с внеклеточным матрик­ сом и друг с другом. Помимо этого, малые ГТФазы участвуют в контроле клеточного цикла.

Всемействе малых ГТФаз наибо­ лее изучены белки Rho (изоформы А,

Ви С), Cdc 42, Rac (изоформы 1, 2, 3). Рассмотрим в общих чертах сиг­ нальные пути и механизмы, посредст­ вом которых эти белки контролируют

организацию актинового цитоскелета и формирование псевдоподий (схемы 7.4-7.6).

1. Rho активируется при воздейст­ вии на клетку различных специфиче­ ских лигандов: митогенов, лизофосфатидиловой кислоты, бомбезина или фетальной сыворотки, а также при интегринопосредованном контактном взаимодействии клетки с внеклеточ­ ным матриксом. Активация Rho ока­ зывает в свою очередь активирующее действие на Rho-киназы (их два вида) и белок Dia. Rho-киназы фосфорилируют три субстрата, играющих ключе­ вую роль в сборке актинмиозиновых

микрофиламентов: легкую цепь мио­ зина (MLC), фосфатазу легкой цепи миозина (MLC-фосфатазу) и Ы М - к и - назу. Результатом фосфорилирования первых двух субстратов является воз­ растание АТФазной активности мио­ зина II, что стимулирует сборку предсуществующих микрофиламентов в пучки, их контрактильность и форми­ рование фокальных контактов. Фос - форилированная LIM-киназа в свою очередь фосфорилирует и этим ингибирует активность кофилина (препят-

от кэпирующего их гельзолина, спо­ собствует полимеризации актина на этих концах. Другой мишенью Rac яв­ ляются киназы РАК 1, 2, 3, активация которых способствует полимеризации микрофиламентов. Наконец, Rac мо­ жет также прямо взаимодействовать с белком Scar, который, как и WASp, активирует комплекс Аrр 2/3, ини­ циирующий рост ответвлений новых микрофиламентов (см. схему 7.6).

Результатом активации Cdc 42 или Rac и вызванных ею перестроек акти­ нового цитоскелета является форми­ рование клеткой псевдоподий соот­ ветственно нитевидной формы (фило­ подий) или ламеллярной формы (ла­ меллоподий). Механизм их образова­ ния различен. В основе формирова­ ния филоподий лежит полимеризация нескольких актиновых микрофила­ ментов (собранных в пучок) на их оперенных концах: растущие концы филаментов генерируют толкающую силу, которая "выпячивает" плазмати­ ческую мембрану в виде очень узкого псевдоподиального выроста — фило­ подий. Ламеллоподия образуется в ре­ зультате ветвления микрофиламен­ тов: полимеризация актина на опе­ ренных концах разветвляющихся мик­ рофиламентов (их противоположные концы фиксированы в участках от­ ветвления комплексами Аrр 2/3) соз­ дает толкающую силу, которая "выпя­ чивает" относительно широкий уча­ сток плазматической мембраны, фор­ мируя ламеллоподию.

Поскольку рост оперенных концов микрофиламентов происходит не по всему краю клетки, а локально, то псевдоподии возникают в дискретных участках клеточного края. Эта дис­ кретность является необходимой предпосылкой для перемещения клетки.

Таким образом, сигналы, посту­ пающие от задействованных рецепто­ ров клеточной поверхности, активи­ руют малые ГТФазы, инициирующие внутриклеточную передачу сигналов, которые контролируют сборку контрактильных актиновых микрофила­

ментов и ассоциированных с ними контактов клетки с внеклеточным матриксом, а также формирование псевдоподий. Сочетания и смена раз­ личных форм псевдоподий при рас­ пластывании и перемещении клетки обусловлены "каскадной" активацией малых ГТФаз: Cdc 42 активирует Rac, последний может в некоторых случаях активировать Rho.

Актиновые структуры, индуцируе­ мые малыми ГТФазами, ассоциирова­ ны с адгезионными комплексами, связывающими клетку с внеклеточ­ ным матриксом, однако лишь Rho ин­ дуцирует сборку классических фо­ кальных контактов. Rac и Cdc 42 уча­ ствуют в формировании адгезионных комплексов, которые хотя и интегринзависимы и содержат многие из тех же компонентов, что и классиче­ ские фокальные контакты, но морфо­ логически отличаются от них. Роль таких контактов пока не совсем ясна. Они могут служить предшественника­ ми зрелых фокальных контактов. Воз­ можно, адгезионные комплексы могут инициировать внутриклеточные сиг­ налы, подобно тому, как это делают фокальные контакты, осуществляя контроль не только за организацией актинового цитоскелета, но и за про­ лиферацией клеток (см. раздел 7.2.3).

В образовании псевдоподий и дви­ жении клетки важную роль играют как актин-миозиновые структуры, так и микротрубочки. Перемещение клет­ ки сопровождается ориентацией мик­ ротрубочек таким образом, что их растущие плюс-концы располагаются в основании ведущей ламеллы (на пе­ реднем крае движущейся клетки), а укорачивающиеся минус-концы — в теле клетки. Есть данные о прямой связи активной формы Rac с тубулином и о возможном освобождении ак­ тивного Rac в цитоплазму во время роста микротрубочек. Рост микротру­ бочек на ведущем крае движущейся клетки, возможно, локально освобож­ дает активный Rac, который вызывает полимеризацию актина и как следст­ вие протрузию псевдоподий (см. вы-

ше), обеспечивающих перемещение клетки. Предполагается, что другой член семейства малых ГТФаз — Rho — тоже связывается с микротрубочками, освобождаясь при их разборке на ми­ нус-концах в теле клетки, что способ­ ствует формированию стресс-фибрилл и возрастанию контрактильности (см. выше), обеспечивающей подтягивание "хвоста" движущейся клетки. Возмож­ но, что с микротрубочками связаны не сами Rac или Rho, а факторы, ре­ гулирующие переходы между актив­ ными и неактивными формами этих ГТФаз (например, G E F ) . Возможно также, что микротрубочки доставляют к фокальным контактам какие-то регуляторные молекулы, которые ослаб­ ляют эти контакты, что вызывает ло­ кальную ретракцию клеточного края и возрастание поляризации клетки, не­ обходимой для ее перемещения.

7.2.6.Биомеханический

Изометрическое напряжение, по­ стоянно испытываемое клеткой, рас­ пластавшейся на поверхности внекле­ точного матрикса, является важным фактором, контролирующим форму клетки (степень ее распластывания), ее функциональную активность, про­ лиферацию и локомоцию. Силы на­ пряжения оказывают модифицирую­ щее воздействие на внутриклеточную сигнализацию и экспрессию генов, инициируют реконструирование вне­ клеточного матрикса. В условиях ор­ ганизма эти механические силы влия­ ют на развитие тканей и органов, вы­ полняя формообразовательные функ­ ции в эмбриогенезе.

Изометрическое напряжение клет­ ки является результатом взаимодейст­ вия двух сил: центростремительного натяжения и адгезии клетки к внекле­ точному матриксу. Центростремитель­ ное натяжение, генерируемое стрессфибриллами, заякоренными в фокаль­ ных контактах, контролирует целость последних: ослабление натяжения

(вызванное, например, ингибированием протеинкиназы легкой цепи мио­ зина II) вызывает дезинтеграцию фо­ кальных контактов. Натяжению про­ тивостоят адгезия клетки к матриксу в фокальных контактах, а также внутри­ клеточные "амортизаторы" в виде микротрубочек: разрушение послед­ них сдвигает динамическое равнове­ сие, приводя к преобладанию силы натяжения и тем способствуя "созре­ ванию" фокальных контактов (воз­ можно, впрочем, что истинной при­ чиной "созревания" контактов являет­ ся нарушение внутриклеточного транспорта, зависимого от микротру­ бочек). Баланс контрактильных сил, действующих через трансмембранные интегриновые рецепторы, и противо­ действующих сил со стороны иммоби­ лизованных фокальных контактов и микротрубочек (а также, возможно, промежуточных филаментов) опреде­ ляет форму клетки — степень ее рас­ пластывания на поверхности внекле­ точного матрикса.

Нарушение баланса механических сил, поддерживающих состояние изо­ метрического напряжения клетки, приводит не только к изменениям ее формы, но и к функциональной ак­ тивности. Преобладание в клетке си­ лы центростремительного натяжения, вызванного разрушением микротрубо­ чек, стимулирует сборку фокальных контактов и вызывает фосфорилирование FAK и паксиллина, генерируя интегринзависимый митогенный сиг­ нал. Результатом является переход клеток в S-фазу. Искусственного ос­ лабления центростремительного натя­ жения в клетках достигают использо­ ванием культуральных субстратов с равномерно пониженной адгезивностью или с адгезивными "островками". Такие субстраты затрудняют форми­ рование фокальных контактов, поэто­ му степень распластывания клеток значительно снижается, что приводит к торможению пролиферации, а в не­ которых случаях даже к анойкису кле­ ток. Нарушаются также синтетические процессы: например, у фибробластов

снижается синтез виментина, у эпителиоцитов возрастает синтез некоторых протеаз и т. д.

Состояние изометрического напря­ жения клеток можно нарушить, под­ вергая их дополнительным механиче­ ским воздействиям извне: периодиче­ скими сгибаниями культурального субстрата или растягиваниями суб­ стратов, обладающих эластичностью (коллагеновые гели, пленки из латек­ са и т. п.). На такие воздействия раз­ ные типы клеток отвечают различны­ ми реакциями: возрастанием числа и "созреванием" фокальных контактов, стимуляцией пролиферации и синтеза ряда белков, активацией ферментных систем и трансмембранных ионных каналов. Некоторые типы клеток при механических воздействиях усиливают синтез белков внеклеточного матрик­ са. Так, например, у фибробластов усиливается синтез тенасцина С и коллагена XII типа. Синтезы этих бел­ ков рассматриваются в качестве инду­ цируемых механическим стрессом.

Предполагается, что функциональ­ ные изменения в клетках, индуцируе­ мые механическими воздействиями на внеклеточный матрикс, опосредуются задействованными интегриновыми рецепторами. Последние рассматрива­ ются поэтому как трансдукторы не только биохимических, но и механи­ ческих сигналов от внеклеточного матрикса. Возможно, что деформации в матриксе, вызванные механически­ ми воздействиями, изменяют конформацию внеклеточных доменов интег­ ринов, инициируя этим внутрикле­ точную передачу сигналов. Сигналь­ ные цепи, индуцируемые механиче­ скими воздействиями на интегриновые рецепторы клеток, изучены не­ достаточно. У остеобластов механиче­ ский стресс вызывает немедленную активацию фосфолипазы С, расщеп­ ляющей РIР2, что приводит в дальней­ шем к активации протеинкиназы С и освобождению Са2+ из внутриклеточ­ ных везикул. Протеинкиназа С фосфорилирует актинсвязывающие бел­ ки — профилин и филамин, белки

фокальных контактов — винкулин и талин, а также киназу легкой цепи миозина, стимулирует формирование фокальных контактов и стресс-фиб­ рилл. Са2+ также оказывают регули­ рующее воздействие на перестройки актинового цитоскелета. И протеин­ киназа С и Са2+, по-видимому, участ­ вуют в регуляции пролиферации клеток.

Клетки в свою очередь оказывают механическое воздействие на внекле­ точный матрикс. Центростремитель­ ное натяжение клетки через фокаль­ ные контакты передается на матрикс. Проявление этой силы можно визуа­ лизировать, используя эластичные культуральные субстраты, коллагено­ вые гели, пленки из силиконовой ре­ зины и т. п.: фибробласты и некото­ рые другие типы клеток, генерируя центростремительное натяжение, вы­ зывают образование тонких складок на поверхности деформируемого суб­ страта. Сила сжатия клетками суб­ страта может быть измерена как опо­ средованно, так и с помощью специ­ альных механических датчиков (на­ пример, куриные фибробласты разви­ вают напряжение, равное 4,5 · 10-2 дин/см2). Естественно, что нарушение актинового цитоскелета (инициирую­ щего натяжение) цитохалазином резко ослабляет деформирование клетками субстрата, а нарушение системы мик­ ротрубочек (противодействующих си­ лам натяжения) усиливает механиче­ ское воздействие клеток на субстрат.

Под действием клеток внеклеточ­ ный матрикс претерпевает реоргани­ зацию. Натяжение со стороны фиб­ робластов способствует ориентации волокон в коллагеновом геле. Моле­ кулы внеклеточного матрикса, кото­ рые связаны с клеточной поверхно­ стью (например, фибронектин или ламинин), формируют фибриллы, ори­ ентированные в направлении сил на­ тяжения, генерируемых в фибробластах или эпителиоцитах. Ослабление натяжения нарушает ориентацию фибрилл внеклеточного матрикса на поверхности клеток.

Реорганизация внеклеточного мат­ рикса под влиянием натяжения, гене­ рируемого клетками, происходит при регенеративных процессах (например, при заживлении ран), при формиро­ вании костной ткани и др.

7.2.7. Реакции клеток на химическую анизотропию и топографию

внеклеточного матрикса

Вышеизложенное (см. разделы 7.2.1—7.2.4) указывает на роль хими­ ческого состава внеклеточного мат­ рикса в адгезии клеток: наличие в матриксе специальных белковых мо­ лекул, с которыми специфически свя­ зываются интегриновые рецепторы различных клеток, определяет способ­ ность этих клеток к прикреплению, перемещению и размножению. Оче­ видно, что если необходимые компо­ ненты матрикса будут распределены неравномерно — в виде "островков" или узких "дорожек", то клетки смогут прикрепляться и перемещаться лишь в границах таких адгезивных участков. Подобная картина реально наблюда­ ется в организме в условиях эмбрио­ генеза или при заживлении ран, когда клетки направленно мигрируют вдоль линейных участков на поверхности внеклеточного матрикса в соответст­ вии с наличием в этих участках белко­ вых компонентов, необходимых для адгезии клеток данного типа.

Влияние неоднородности в адге­ зивных свойствах внеклеточного мат­ рикса на прикрепление и поведение клеток можно моделировать in vitro в условиях культивирования клеток. Для этого поверхности культуральных субстратов химическим способом придают свойства, исключающие воз­ можность прикрепления клеток. На такой неадгезивной поверхности раз­ личными методами (например, по­ крытием каким-либо белком матрик­ са) наносят изолированные адгезив­ ные участки в виде узких полос или различной формы "островков". На рис. 7.13 можно видеть, как вытягива­

ются и ориентируются вдоль узких ад­ гезивных полос фибробласты. Если адгезивные участки имеют вид круг­ лых или треугольных "островков" дос­ таточно малых размеров, то прикре­ пившийся фибробласт принимает форму "островка". Размножение кле­ ток в таких "островках" резко снижа­ ется, нередко клетки даже подверга­ ются апоптозу. Происходит это пото­ му, что из-за ограниченной площади адгезивного участка клетка не может достаточно широко распластаться, по­ этому число образуемых ею фокаль­ ных контактов оказывается снижен­ ным. В результате ослабляется трансдукция внутриклеточных сигналов, регулирующих функциональную ак­ тивность клетки, включая ее способ­ ность к размножению. Возможен и другой механизм, связанный не с де­ фицитом фокальных контактов, а с ослаблением натяжения у клетки, не­ достаточно распластанной на адгезив­ ном "островке". Изометрическое натя­ жение, испытываемое клетками, пол­ ностью распластавшимися на поверх­ ности внеклеточного матрикса, слу­ жит мощным регулятором формы и функциональной активности клеток, а также оказывает влияние на организа-

Рис. 7.13. Фибробласт мыши на адгезив­ ном субстрате в виде узкой полосы. Диф­ ференциальная интерференционно-кон­ трастная микроскопия. Ув. 400. (Препарат М. А. Харитоновой.)

цию самого внеклеточного матрикса (см. раздел 7.2.6).

Помимо химических свойств вне­ клеточного матрикса, на адгезию кле­ ток, их распластывание и локомоцию значительное влияние оказывает гео­ метрическая конфигурация, или топо­ графия матрикса. Это могут быть раз­ ного рода волокна, обладающие ци­ линдрической поверхностью, базальные мембраны со сложным микро­ рельефом в виде складок или канавок, наличие в матриксе прерывистостей в

фию) субстрата и реагировать на нее. Эта способность вначале была выяв­ лена в опытах с культивированием клеток на таких природных субстра­ тах, как тонкие нити фибрина или рыбья чешуя (обладающая микро­ складчатой поверхностью): фибробла­ сты на таких субстратах вытягивались и ориентировались вдоль нитей или складок, поэтому феномен был назван

вок различной глубины и периодич­ ности, цилиндрическими поверхно­ стями разной кривизны, прерывистым характером (адгезивные участки пере­ межаются с отверстиями разной фор­ мы и размеров).

Такие специальные субстраты мо­ делируют разнообразную топографию структур внеклеточного матрикса, встречающихся на путях миграции клеток в эмбриогенезе, при регенера­ ции, а также при опухолевой инвазии.

Различные морфогенетические ре­ акции клеток — изменения их формы, ориентации и направления движения, перестройки цитоскелета, а также из­ менения функциональной активно­ сти, индуцируемые геометрической конфигурацией субстрата (внеклеточ-

Рис. 7.14. Фибробласты мыши на субстра­ те с глубокими канавками треугольного профиля: клетки не распластываются в глубине канавок и сосредоточиваются на промежутках между ними. Световая мик­ роскопия. Ув. 120. (Препарат Ю. А. Ровенского.)

ного матрикса), — называются топо­ графическими реакциями. Рассмот­ рим наиболее типичные из таких ре­ акций.

При культивировании фибробластов на субстратах с глубокими (не­ сколько десятков микрон) линейными канавками треугольного профиля клетки не распластываются в глубине канавок и сосредоточиваются между ними (рис. 7.14). На значительно бо­ лее мелких канавках (глубиной от де­ сятых долей до нескольких микрон) фибробласты, эпителиоциты или нервные клетки вытягиваются и ори­ ентируются вдоль канавок. Эта реак­ ция усиливается с возрастанием глу­ бины канавок и уменьшением проме­ жутков между ними. У фибробластов, кроме того, происходят реорганизация цитоскелета, активация тирозинфосфорилирования ряда белков, а также изменения генной экспрессии, напри-

Рис. 7.15. Фибробласты мыши на субстра­ те с цилиндрической поверхностью: клет­ ки вытягиваются и ориентируются вдоль цилиндра. СЭМ. Ув. 1300. (Препарат Ю. А. Ровенского.)

мер усиление экспрессии (и секре­ ции) фибронектина. Другими слова­ ми, клетки реагируют на геометрию поверхности субстрата не только мор­ фологическими изменениями, но и серьезными сдвигами во внутрикле­ точных сигнальных путях, приводя­ щими к изменениям синтетической и функциональной активности.

На субстратах с цилиндрической поверхностью высокой степени кри­ визны (радиусом в несколько десят­ ков микрон) реакция у фибробластов

иэпителиоцитов различна. Первые

Рис. 7.16. Эпителиоцит мыши на субстра­ те с цилиндрической поверхностью: клетка сохраняет дисковидную форму и перегиба­ ется поперек цилиндра. СЭМ. Ув. 1300. (Препарат Ю. А. Ровенского.)

Рис. 7.17. Фибробласт мыши на прерыви­ стом (в виде решетки) субстрате: клетка пересекает отверстие решетки. СЭМ. Ув. 1200. (Препарат Ю. А. Ровенского.)

вытягиваются и ориентируются вдоль цилиндра, в том же направлении ори­ ентируется большинство пучков акти­ новых микрофиламентов (рис. 7.15). Эпителиоциты сохраняют дисковид­ ную форму и перегибаются поперек цилиндра, такую же поперечную ори­ ентацию приобретают пучки микро­ филаментов (рис. 7.16).

На прерывистых субстратах (в виде решеток с крупными квадратными от­ верстиями) клетки, прикрепившиеся к прутьям решетки, вскоре смещаются в ее отверстия: тело клетки почти цели­ ком оказывается "провисшим" в сво­ бодном пространстве отверстия, и лишь своими краями или концами от­ ростков клетка остается прикреплен­ ной к прутьям решетки. При этом по­ ведение фибробластов и эпителиаль­ ных клеток сильно различается: фиб­ робласт вытягивается и своим веретеновидным телом "пересекает" отвер­ стие решетки (рис. 7.17), тогда как эпителиоцит, сохраняя дисковидную форму, постепенно полностью "затя­ гивает" отверстие (рис. 7.18).

Механизмы топографических реак­ ций клеток изучены недостаточно. В основе многих из них, по-видимому, лежит изометрическое натяжение кле­ ток, создаваемое актиновым цитоске-

летом (см. раздел 7.2.6). Сила натяже­ ния пучков микрофиламентов может зависеть от их формы: прямые пучки развивают более сильное натяжение по сравнению с пучками, находящимися в условиях сгибания. Сгибанию пучков микрофиламентов препятствует также их механическая ригидность. В резуль­ тате фибробласты проявляют устойчи­ вость к сгибанию под углом выше "критического" и стремятся занять по­ ложение, исключающее такое сгибание тела клетки. По-видимому, этим мож­ но объяснить такие топографические реакции фибробластов, как их вытяги­ вание вдоль цилиндрических субстра­ тов, неспособность к распластыванию на дне канавок треугольного профиля или на двух взаимно перпендикуляр­ ных прутьях решетки. Что же касается эпителиальных клеток, для которых более характерны не линейные, а коль­ цевидные пучки микрофиламентов, то в таких клетках силы натяжения зна­ чительно слабее, чем в фибробластах, и соответственно эпителиоциты, по-ви­ димому, менее устойчивы к сгибанию и поэтому реагируют на топографию субстрата по-иному, чем фибробласты.

В последнее время выдвинуто предположение о наличии у клеток особых "рецепторов растяжения", иг­

рающих ключевую роль в топографи­ ческих реакциях. Эти рецепторы реа­ гируют на кривизну или микронеров­ ности поверхности субстрата, "вклю­ чая" цепь внутриклеточных сигналов, которые приводят к реорганизации актинового цитоскелета, изменениям формы и ориентации клеток, а также изменениям генной экспрессии. Од­ ним из вероятных кандидатов на роль рецепторов растяжения являются ион­ ные хлоридные каналы в плазматиче­ ской мембране клеток: в среде с дефи­ цитом хлоридов вытягивание фиброб­ ластов вдоль микроканавок резко ос­ лабевает. Вопрос о механизме топо­ графических реакций клеток требует дальнейших исследований.

7.3. Нарушения распластывания и локомоции клеток в результате неопластической трансформации

7.3.1. Морфологические изменения

Подвергшиеся неопластической трансформации клетки, подобно нор­ мальным, во взвешенном состоянии

Рис. 7.19. Стадия радиального распласты­ вания трансформированного фибробласта мыши: ламеллярная цитоплазма редуциро­ вана и фрагментирована. СЭМ. Ув. 2100. (Препарат Ю. А. Ровенского.)

имеют сферическую форму и после контакта с поверхностью твердого субстрата (внеклеточного матрикса) проходят процесс распластывания, однако морфология этого процесса существенно отличается от наблюдае­ мого в норме:

бластоподобную форму, однако никогда не достигают значитель­ ной степени распластывания, сравнимой с наблюдаемой у нормальных клеток. Трансфор­ мированные клетки остаются слабоуплощенными, как бы "поджатыми", ламеллярная ци­ топлазма сильно редуцирована и фрагментарна (в виде отдельных "языков"), ее общая площадь го­ раздо меньше, а толщина — зна­ чительно больше, чем у нор­ мальных фибробластов или эпи­ телиоцитов. Если у последних дорсальная клеточная поверх­ ность сглажена, то у "поджатых" трансформированных клеток она имеет сложный микрорель­ еф, состоящий из множествен­ ных микроворсинок и складок (рис. 7.20).

В связи с редуцированием и фраг­ ментацией ламеллярной цитоплазмы у трансформированных клеток, как правило, не формируется широкий ведущий край. Поэтому их перемеще­ ние в значительной мере утрачивает

•на стадии радиального распла­ стывания нарушены образова­ ние и слияние ламеллоподий, в результате чего ламеллярная ци­ топлазма формируется в виде от­ дельных "языков", а не цирку­ лярной пластинки (рис. 7.19). Уплощение клетки идет нерав­ номерно в разных ее участках, но дисковидная форма не на­ блюдается;

•на стадии поляризации у транс­ формированных фибробластов и у эпителиоцитов клеточный край разделяется на активные и стабильные участки, подобно тому, как это происходит у нор­ мальных фибробластов;

Рис. 7.20. Трансформированный фибро­ бласт мыши: слабо уплощенная клетка с

трансформированные клетки (как фибробласты, так и эпите­ лиоциты) приобретают фибро-

плазмой и сложным рельефом дорсальной поверхности. СЭМ. Ув. 1800. (Препарат Ю. А. Ровенского.)

направленный характер, подобно на­ блюдаемому у нормальных фибробла­ стов: трансформированные клетки пе­ ремещаются, часто меняя направле­ ние движения.

Описанные морфологические осо­ бенности распластывания и локомо­ торного поведения трансформирован­ ных клеток связаны с нарушениями в формировании и функционировании псевдоподий: в их протрузии, прикре­ плении к субстрату и последующем центростремительном натяжении. Эти процессы контролируются актиновым цитоскелетом и системой микротрубо­ чек (см. разделы 7.2.2; 7.2.4), а также фокальными контактами (см. раздел 7.2.3). Неопластическая трансформа­ ция клеток вызывает серьезные нару­ шения в актиновом цитоскелете, а так­ же в формировании и функционирова­ нии фокальных контактов как адгези­ онных структур и трансдукторов внут­ риклеточных сигналов. Эти изменения играют важную роль в прогрессии опу­ холей, в частности в приобретении клетками способности к инвазии.

7.3.2. Нарушения структуры

ифункций фокальных контактов

Нарушения фокальных контактов охватывают все их компоненты: интегриновые рецепторы, цитоплазматические белки и цитоскелетные эле­ менты, связанные с фокальными кон­ тактами.

Трансформация клеток чаще всего сопровождается ослаблением экспрес­ сии и (или) снижением аффинности определенных интегриновых рецепто­ ров, а также утратой их способности к кластеробразованию. Это касается, например, рецептора α5β1 к фибронектину.

Молекулы, участвующие в форми­ ровании фокальных контактов (интегрины, FAK, винкулин, паксиллин), являются мишенями для фосфорилирования онкобелками (продуктами онкогенов), обладающими тирозино­ вой протеинкиназной активностью, в

Рис. 7.21. Редукция пучков актиновых микрофиламентов в цитоплазме трансфор­ мированного фибробласта крысы. Метод прямой иммунофлюоресценции. Ув. 500. (Препарат Л. В. Домниной.)

частности белком онкогена Src. Гиперфосфорилирование цитоплазматического домена интегрина, возможно, лежит в основе механизма снижения аффинности некоторых типов интег­ риновых рецепторов к их лигандам и утраты кластерного характера распре­ деления интегринов на клеточной по­ верхности. Гиперфосфорилирование интегрина ослабляет также его связь с талином. Гиперфосфорилирование винкулина приводит к нарушению его связей с другими белками фокального контакта. При этом резко снижается способность актиновых микрофила­ ментов к заякориванию в фокальных контактах, что в свою очередь вызы­ вает ослабление центростремительно­ го натяжения микрофиламентов и формирования стресс-фибрилл. Зна­ чительная редукция последних весьма характерна для многих типов транс­ формированных клеток (рис. 7.21). Редукция стресс-фибрилл, по-види­ мому, связана с нарушениями в цепи передачи сигналов от интегриновых рецепторов (см. ниже).

Рис. 7.22. Дефектное формирование фо­ кальных контактов трансформированных фибробластов крысы с внеклеточным мат­ риксом. МНИФ с применением антител против винкулина. Ув. 500. (Препарат Л. В. Домниной.)

Нарушенное формирование стрессфибрилл, заякоренных в фокальных контактах, и связанное с этим ослаб­ ление центростремительного натяже­ ния препятствуют "созреванию" фо­ кальных контактов и опосредованной ими трансмембранной сигнализации (см. раздел 7.2.3).

Описанные нарушения ведут к де­ фектности формирования фокальных контактов (рис. 7.22) и ослаблению адгезии трансформированных клеток к определенным компонентам внекле­ точного матрикса. Снижение адгезии усугубляется тем, что трансформиро­ ванные клетки частично или полно­ стью утрачивают способность к синте­ зу и связыванию с клеточной поверх­ ностью определенных белков матрик­ са, например фибронектина или кол­ лагена.

Ослабление адгезивных связей трансформированных клеток с вне­ клеточным матриксом приводит к возрастанию их миграционной актив­ ности (см. раздел 7.3.3).

Нарушения фокальных контактов при трансформации касаются не толь­ ко их адгезивных функций, но также функций трансдукторов внутрикле­ точных сигналов.

Все ключевые белки, участвующие

впоследовательной передаче сигналов от интегриновых рецепторов, связав­ шихся со своими лигандами во вне­ клеточном матриксе (см. раздел 7.2.3), кодируются протоонкогенами. В ре­ зультате мутационного превращения протоонкогенов в онкогены одно или несколько звеньев этой сигнальной цепи спонтанно становятся сверхак­ тивными. FAK может постоянно на­ ходиться в состоянии автофосфорилирования; постоянно активированной может быть подмембранная тирозиновая протеинкиназа Src. В результате белки семейства Ras будут подвергать­ ся непрерывному фосфорилированию и пребывать в состоянии активации. Белки Ras в свою очередь могут при­ обрести мутантные формы, которые будут конститутивно связаны с ГТФ в результате снижения ГТФазной ак­ тивности этих белков. Таким образом, белки Ras будут постоянно находиться

вактивированном состоянии, переда­ вая сигналы дальше. Мутации гена ras

втрансформированных клетках встре­ чаются достаточно часто, они выявля­ ются более чем в 20 % опухолей чело­ века. Цитоплазматические протеинкиназы семейства Raf или МАР-киназ- ных каскадов также могут стать по­ стоянно активированными без необ­ ходимости в стимуляции. Число транскрипционных факторов, влияю­ щих на экспрессию определенных ге­ нов, в частности побуждающих клет­ ку к делению или оказывающих регу­ лирующее воздействие на цитоске­ лет, может резко возрасти, а эти фак­ торы — приобрести повышенную ак­ тивность.

Следствием этих нарушений в це­ пи проведения сигналов от интегри­ новых рецепторов в трансформиро­ ванной клетке являются постоянная стимуляция пролиферации, не зави­ симая от связывания интегринов с внеклеточным матриксом, а также снижение зависимости пролифера­ ции от ростовых факторов: митогенный сигнал от кодируемых онкогена­ ми рецепторов ростовых факторов

этого органа. Рецептором для E G F может служить продукт онкогена егВ2 (или neu). Этот онкоген часто гиперэкспрессируется в клетках ряда кар­ цином у человека, в том числе карци­ номы молочных желез, а также во всех случаях болезни Педжета. Его ги­ перэкспрессия коррелирует с метастазированием этой опухоли, а также ра­ ка желудка и рака яичника, что, повидимому, связано с мотогенным дей­ ствием E G F на клетки этих опухолей. Мишенью для F G F служит эндоте­ лий: стимулируя подвижность и про­ лиферацию эндотелиоцитов, этот цитокин вызывает активацию эндотелия, способствующую прикреплению к не­

лия в подвижные фибробластоподобные клетки играет драматическую роль в опухолевой инвазии, облегчая раковым клеткам активное внедрение в окружающие ткани. Так, среди кле­ ток, полученных из карцином толстой кишки человека, способными к инва­ зии in vitro были лишь те, которые полностью утратили эпителиоидную морфологию. При воздействии H G F / SF на культивируемые эпителиальные клетки или клетки различных карци­ ном человека они приобретали спо­

несколько таких факторов сейчас из­ вестны: это белки, секретируемые клетками карцином молочных желез и мочевого пузыря у человека. В резуль­ тате раковые клетки становятся ми­ шенями для мотогенного воздействия H G F / S F : клетки многих человеческих карцином несут его рецептор, экспрессированный в результате актива­ ции протоонкогена c-met.

Отдельную группу составляют "чистые" мотогены, стимулирующие локомоцию клеток, не влияя на про­ лиферацию. К ним относятся, в част­ ности, аутокринный фактор подвиж­ ности (AMF) и фактор, стимулирую­ щий миграцию (MSF). В отличие от

мы и фибробластов, трансформиро­ ванных онкогеном ras; M S F — фиб­ робластов (фетальных или получен­ ных от больных раком молочных же­ лез), придавая им, кроме того, спо­ собность инвазировать внеклеточный матрикс. Описан также мотоген (сход­ ный с AMF), продуцируемый высоко­ метастатическими клетками аденокарциномы молочных желез у крысы, стимулирующий локомоцию тех же клеток. Показано, что уровень A M F в моче больных раком мочевого пузыря прямо коррелирует с инвазивностью этой опухоли.

Неопластическая трансформация эпителиальных клеток сама по себе может привести к их поляризации (см. раздел 7.3.1) и приобретению "ло­ комоторного" фенотипа, столь важно­

7.3.4. Изменения топографических реакций клеток

профиля и не сосредоточиваются на промежутках между канавками (рис. 7.23), как это делают нормальные фибробласты (см. рис. 7.14); у них

представляется очень вероятной. Этот феномен называют контактным тор­ можением размножения.

Феномен контактного торможе­ ния движения определяется как свой­ ство нормальных клеток реагировать на контактные взаимодействия в культуре остановкой направленного движения одной клетки по поверхно­ сти другой.

В монослойных культурах эпите-

нестабильных, а затем стабильных ад­ гезионных межклеточных контактов. Псевдоподиальная активность в зоне соприкосновения клеточных краев и вблизи этой зоны полностью тормо­ зится, что сопровождается накоплени­ ем в этой зоне молекул адгезии Е- кадхерин/катенинового комплекса (см. ниже) и реорганизацией актино­ вого цитоскелета.

Фибробласты в монослойных куль­ турах также претерпевают контактное торможение движения, однако способ его осуществления иной, чем у эпителиоцитов: при столкновениях фиб­ робластов происходит наползание друг на друга их ведущих краев, затем наползающий край ретрактирует, и одновременно с этим клетка начинает образовывать другой ведущий край в стороне от участка бывшего контакта. В результате фибробласты меняют на­ правление движения, "отворачивая" от прежнего места контакта.

Описанные различия в осуществ­ лении контактного торможения дви­ жения у эпителиоцитов и фибробла­ стов, вероятно, имеют в своей основе биомеханический цитоскелетный ме­ ханизм. У эпителиоцитов в начальной стадии установления контакта проис­ ходит реорганизация актиновых мик­ рофиламентов в зоне контакта, в ре­ зультате чего вектор их натяжения ста­ новится направленным латерально — вдоль краев контактирующих клеток. Эта механическая сила натяжения приводит к параличу псевдоподиальной активности в зоне контакта и

Рис. 7.26. Межклеточные контакты эпите­ лиоцитов печени крысы. МНИФ с приме­ нением антител против Е-кадхерина, кон­ фокальная микроскопия. Ув. 600. (Препа­ рат Н. А. Глушанковой.)

вблизи ее, а также обеспечивает экс­ пансию зоны межклеточного контак­ та, стабилизируя его. У фибробластов при установлении контакта в отличие от эпителиоцитов не происходит ре­ организации актиновых микрофила­ ментов, и их натяжение в зоне кон­ такта остается направленным центро­ стремительно — вдоль длинной оси каждой из контактирующих клеток. Это натяжение приводит к ретракции ведущих краев с последующим фор­ мированием нового ведущего края и расхождением фибробластов. Ингибирования псевдоподиальной активно­ сти не возникает.

Различное направление сил натя­ жения в зоне межклеточного контакта у эпителиоцитов и фибробластов оп­ ределяет различную ориентацию фор­ мирующихся контактных структур. У эпителиоцитов адгезионные контак­ ты формируются между краями кле­ ток и ориентируются тангенциально — вдоль контактирующих краев (рис. 7.26). У фибробластов такие контакты могут образовываться между поверх­ ностями перекрывающихся ведущих ламелл и ориентированы вдоль длин­ ной оси контактирующих клеток.

Межклеточные контакты осущест­ вляются посредством широкого спек­ тра трансмембранных молекул адге-

зии. Подобно интегриновым рецепто­ рам, связывающим клетки с внекле­ точным матриксом, молекулы меж­ клеточной адгезии, помимо механиче­ ской связи, выполняют также функ­ ции трансдукторов внутриклеточных сигналов, влияющих на пролифера­ цию и движение клеток.

Молекулы межклеточной адгезии разделяются на несколько групп: кадхерины, интегрины, иммуноглобу­ лины и селектины, а также протеогликаны и другие гликоконъюгаты.

Рассмотрим коротко главные харак­ теристики каждой группы молекул ад­ гезии.

Кадхерины. Это семейство транс­ мембранных гликопротеинов разделя­ ется на несколько субклассов:

• кадхерины, осуществляющие десмосомальные контакты: десмоглеин и десмоколлины I и II.

Подобно интегринам, кадхерины обладают внутриклеточными домена­ ми, которые через цепь взаимосвя­ занных белков соединяются с цитоскелетными структурами контакти­ рующих клеток. Кадхерины адгези­ онных контактов связываются с актиновыми микрофиламентами через α-, β- и γ - катенины (последние назы­ ваются также плакоглобинами), вин­ кулин и некоторые другие белки

Интегрины. Хотя подавляющее большинство интегриновых рецепто­ ров участвует в формировании кон­ тактов клеток с внеклеточным мат­ риксом (см. раздел 7.2.3), некоторые интегрины осуществляют межклеточ­ ные контакты. К ним относятся лей­ коцитарные интегрины LFA-1 и Мас- 1, а также интегрин α4β1, для которых лигандами служат молекулы адгезии другого семейства — иммуноглобули­ нов (см. ниже). Указанные интегрины обеспечивают адгезию лейкоцитов к эндотелию сосудов при воспалении.

Иммуноглобулины — семейство трансмембранных гликопротеинов, у которых внеклеточный домен содер­ жит несколько иммуноглобулиноподобных доменов. Семейство включает молекулы межклеточной гомо- и гетеротипической адгезии: ICAM-1, VCAM-1, РЕСАМ-1, карциноэмбриональный антиген (СЕА) и др.

ICAM-1, VCAM-1 и РЕСАМ-1 экспрессируются на поверхности различ­ ных типов клеток, в том числе клеток сосудистого эндотелия. Для выражен­ ной экспрессии ICAM-1 или VCAM-1 необходима активация эндотелия цитокинами (например, интерлейкином 1β или фактором некроза опухоли TNF-α), экспрессия РЕСАМ-1 явля­ ется конститутивной. Основной функ­ цией этих молекул является обеспече­ ние прикрепления лейкоцитов к сосу­ дистому эндотелию при воспалении.

Селектины — семейство трансмем­ бранных молекул, внеклеточный до­ мен которых содержит лектиноподобную часть. Наличие последней позво­ ляет селектинам распознавать углево­ ды на поверхности других клеток и связываться с ними, осуществляя межклеточную адгезию. Представите­ лями этого семейства являются Е-се- лектин и Р-селектин, которые, экспрессируясь на сосудистом эндотелии, активированном цитокинами, обеспе­ чивают адгезию к нему лейкоцитов при воспалении.

Хотя пути проведения сигналов от межклеточных контактов, влияющих на пролиферативную и локомоторную

активность клеток, полностью не вы­ яснены, очевидно, что эти сигнальные пути ведут к изменению регуляции ге­ нов.

Контактное торможение размно­ жения связывают с усилением экс­ прессии определенных генов — опу­ холевых супрессоров (Kipl и INК4а). Белки этих генов ингибируют циклинзависимые киназы, активностью которых обеспечивается последова­ тельный переход из одной фазы кле­ точного цикла в другую. Установление межклеточных контактов вызывает усиление экспрессии этих генов-су- прессоров и блокирование выхода клеток из Gl - фазы . Белок другого ге­ на — опухолевого супрессора р53, ко­ торый также препятствует входу кле­ ток в S-фазу, накапливается при обра­ зовании конфлуэнтного эпителиаль­ ного пласта, тогда как при разобще­ нии клеток этот белок дестабилизиру­ ется. Достижение конфлуэнтности у фибробластов блокирует передачу сигналов от ростовых факторов на уровне (или "выше") белков Racl и Cdc42. При удалении части монослоя прохождение сигналов восстанавлива­ ется в клетках на краю "раны", ини­ циируя их размножение и локомоцию. Достижение конфлуэнтности не ока­ зывает влияния на классическую Ras- Raf-MAP-киназную сигнальную цепь.

7.4.2. Нарушения межклеточных контактных взаимодействий и их роль в опухолевой инвазии

Неопластическая трансформация вызывает нарушения межклеточных контактов, что приводит к ослабле­ нию связей между клетками. В основе этих нарушений могут лежать мутации и делеции в генах, кодирующих моле­ кулы межклеточной адгезии (напри­ мер, Е-кадхерин) и (или) другие моле­ кулы, участвующие в межклеточных контактах (например, а- и β-катени- ны). Дестабилизация кадхеринопосредованных контактов может быть так­ же обусловлена действием онкогенов,

Рис. 7.27. Трансформированные фибро­ бласты мыши: многослойный рост клеток. СЭМ. Ув. 900. (Препарат Ю. А. Ровен­ ского.)

продукты которых, обладая тирозинпротеинкиназной активностью, вызы­ вают гиперфосфорилирование β-кате- нина, что приводит к нарушению ад­ гезивных функций всего Е-кадхерин- катенинового комплекса.

В результате инактивации генов — опухолевых супрессоров, опосредую­ щих контактное торможение размно­ жения (см. раздел 7.4.1), трансформи­ рованные клетки утрачивают эту спо­ собность.

Ранее общепринятым было мне­ ние, что трансформированные клетки утрачивают также контактное тормо­ жение движения. Недавно, однако, было показано, что у эпителиоцитов, трансдуцированных онкогеном N-ras

мые различия в характере роста нетрансформированных и трансформи­ рованных клеток в культурах (монослойный рост у первых и многослой­ ный — у вторых), по-видимому, обу­ словлены ослаблением прикрепления клеток к субстрату и ослаблением межклеточной адгезии — свойствами, характерными для трансформирован­ ных клеток, что облегчает подползание одной клетки под тело другой и создает эффект многослойного роста (рис. 7.27).

Нарушение межклеточной адгезии, опосредованной Е-кадхерином, вно­ сит важный вклад в инвазивный по­ тенциал опухолевых клеток. Мутации в гене Е-кадхерина (наблюдаемые в половине случаев рака желудка и при раке яичников у человека), а также мутации и делеции в генах, кодирую­ щих а- и β-катенины, рассматривают как условие перехода опухоли к инвазивному генотипу. Снижение экс­ прессии Е-кадхерина и (или) альфа-кате- нина коррелирует с возрастанием под­ вижности и инвазивной способности

уклеток рака различных локализаций

учеловека. Трансфекция генов, коди­ рующих Е-кадхерин или α-катенин, в опухолевые эпителиальные клетки с дефицитом продуктов этих генов сни­ жает инвазивную активность клеток. Наоборот, блокирование межклеточ­ ной адгезии антителами к Е-кадхери- ну индуцирует инвазивные свойства у нормальных эпителиоцитов.

Внастоящее время ген Е-кадхери­ на рассматривается как ген-супрессор инвазии и метастазирования экспери­ ментальных и человеческих карцином.

формации фибробластоподобную форму, а также у трансформирован­ ных фибробластов контактное тормо­ жение движения осуществляется тем же способом, что и у нормальных фибробластов (хотя и по-иному, чем у нормальных эпителиоцитов).

Таким образом, контактное тормо­ жение движения присуще как нетрансформированным, так и транс­ формированным клеткам. Наблюдае-

прессора АРС может связываться со свободным (не связанным с Е-кадхе­ рином) β-катенином, функционирую­ щим как транскрипционный фактор, который стимулирует вход клеток в S- фазу. Связывание с АРС вызывает де­ градацию этого свободного β-катени- на. Таким образом, инактивация АРС, как и мутации β-катенина, препятст­ вующие его связыванию с Е-кадхери­ ном, вызывают возрастание количест-

которые связываются со своими интегриновыми рецепторами на поверх­ ности опухолевых клеток. После этого следует ретракция эндотелиоцитов. Ее вызывают тромбоциты, активирован­ ные опухолевыми клетками: послед­ ние индуцируют агрегацию тромбоци­ тов, агрегаты прикрепляются близ участков межклеточных контактов эн­ дотелиоцитов и вызывают их ретрак­ цию. Адгезию опухолевых клеток к тромбоцитам с образованием агрега­ тов стимулирует тромбин, продуци­ руемый тромбоцитами, а также мно­ гими опухолевыми клетками. Эти со­ бытия "открывают дорогу" для про­ движения опухолевых клеток в субэн­ дотелий, который обнажается в ре­ зультате ретракции эндотелиоцитов.

Дальнейшее продвижение опухоле­ вых клеток в субэндотелий обеспечи­ вается модификацией экспрессии ин­ тегриновых и неинтегриновых рецеп­ торов к различным компонентам вне­ клеточного матрикса (например, воз­ растанием экспрессии рецепторов к ламинину и снижением — к фибронектину), а также протеолитической активностью опухолевых клеток: по­ следние секретируют широкий спектр протеаз, вызывающих деградацию различных структур внеклеточного матрикса и способствуя миграции опухолевых клеток в окружающие ткани.

* * *

Таким образом, морфологическая трансформация может возникать в хо­ де многостадийной неопластической эволюции, вызываемой различными агентами, например онкогенными ви­ русами или канцерогенными вещест­ вами, а также при трансфекции ак­ тивных мутантных онкогенов. Разно­ образие форм и степеней морфологи­ ческой трансформации очень велико, тем не менее можно выявить некото­ рые общие черты и направления таких изменений.

Одним из таких общих сдвигов яв­ ляется уменьшение адгезии клеток к

внеклеточному матриксу и к соседним клеткам. Нормальные клетки, контак­ тирующие с плоскостью культуральной подложки, подвергаются распла­ стыванию: выпускают и прикрепляют псевдоподии, полимеризуя актин и формируя актиновые пучки и фокаль­ ные адгезии.

В результате распластывания клет­ ка становится сильно уплощенной и растянутой на подложке. Трансфор­ мированные клетки самых разных ти­ пов выполняют реакции распластыва­ ния хуже, чем их нетрансформированные предшественники: они приобре­ тают менее плоскую форму, их пло­ щадь на подложке существенно уменьшается. Число фокальных адге­ зии и размеры каждой такой адгезии резко уменьшаются. Число межкле­ точных контактов снижается; они со­ всем исчезают во многих типах карци­ ном в организме и трансформирован­ ных эпителиоцитов в культуре. У культивируемых трансформированных клеток уменьшаются в числе и часто совсем исчезают пучки актиновых микрофиламентов — кольцевые пучки эпителиоцитов и прямые пучки фиб­ робластов.

Особого анализа заслуживают из­ менения формы клеток и распределе­ ния псевдоподиальной активности. Эпителиоциты образуют псевдоподии, т. е. полимеризуют актин по всему пе­ риметру дисковидной клетки. После трансформаций, вызванных мутация­ ми самых разных онкогенов, форма клеток из дисковидной становится вытянутой, фибробластоподобной. Соответственно образование псевдо­ подий сосредоточивается лишь в од­ ной части клеточного края — актив­ ном переднем крае. По-видимому, размеры зоны активного края, т. е. зо­ ны, полимеризующей актин, при этом сужаются по сравнению с нетрансформированной дисковидной клет­ кой.

Что является основой тех пере­ строек цитоскелета, которые опреде­ ляют морфологию трансформации и о которых говорилось выше? На этот

котором они временно выходят из тканевых структур, их контакты с дру­ гими клетками и матриксом уменьша­ ются или исчезают. В результате клет­ ки становятся способными мигриро­ вать на новые территории и основы­ вать там новые тканевые структуры, переходя вновь в оседлое состояние под влиянием новой микросреды. В основе этих обратимых переходов ле­ жат реорганизации цитоскелета, вы­ зываемые внешними сигналами. В мигрирующем состоянии эпителиоци­ ты и фибробласты гораздо более сход­ ны друг с другом, чем в оседлых со­ стояниях. Это сходство можно обо­ значить как "физиологическую транс­ формацию". Как далеко заходит это сходство, мы пока не знаем. При нео­ пластической эволюции мутации ге­ нов регуляторных систем блокируют переход в оседлое состояние, клетка постоянно остается в миграционном состоянии независимо от получаемых ею сигналов.

Таким образом, морфологический фенотип опухолевой клетки норма­ лен, ненормальны лишь время и ме­ сто его экспрессии. Эти соображения позволяют наметить ряд направлений исследований. Так, необходимо выяс­ нить не просто природу трансформи­ рованного фенотипа, но молекуляр­ ную природу физиологических пере­ ходов между миграционным и осед­ лым состоянием клеток, а также при­ роду блоков перехода к оседлости, вы­ зываемых разными онкогенами. Очень важным, но совершенно еще не

изученным является выяснение связей между перестройками морфологиче­ ских состояний и дифференцировками стволовых клеток разных тканей. Природа и границы таких дифференцировок в последние годы изучаются очень активно, но здесь почти все еще не ясно. Ответы на все эти вопросы не получены, но можно надеяться, что основные вопросы уже сформулиро­ ваны верно.

Рекомендуемая литература

Альбертc Α., Брей Д., Льюис Р. и др. Моле­ кулярная биология клетки (в 3 т.): Пер. с англ. — М.: Мир, 1994.

Васильев Ю. М. Клетка как архитектурное чудо. — Ч. 2. Цитоскелет, способный чувствовать и помнить // Соросовск. образоват. журн. — 1996. — № 4. — С. 4-10.

Васильев Ю. М. Социальное поведение нормальных клеток и антисоциальное поведение опухолевых клеток. — Ч. 1. Сигнальные молекулы, вызывающие размножение и гибель клеток // Соро­ совск. образоват. журн. — 1997. — № 4. — С. 17-22.

Васильев Ю. М. Социальное поведение нормальных клеток и антисоциальное поведение опухолевых клеток. — Ч. 2. Клетки строят ткань // Соросовск. об­ разоват. журн. — 1997. — Т. 5. — С. 20-25.

Ровенский Ю. А. Клеточные и молекуляр­ ные механизмы опухолевой инвазии // Биохимия. — 1998. — Т. 63, вып. 9. — С. 1204-1221.

Ровенский Ю. А. Как клетки ориентируют­ ся на местности // Соросовск. образо­ ват. журн. — 2001. — Т. 3. — С. 4—11.