2 курс / Нормальная физиология / Физиология_крови_Липунова_Е_А_,_Скоркина_М_Ю_

%

15

10

5 0 -5

-10

-15 30 90 150 210 270 330 390 450 510 570 900 3600 c

Рис. 38. Динамика разницы коэффициента резервной поверхности эритроцитов ( %) между опытной и контрольной пробами

Блокада кальциевых каналов верапамилом индуцирует включение внутриклеточных адаптационных механизмов с участием внутриклеточного кальция, высвобождаемого из цитоскелета клеточных мембран и внутриклеточных органоидов. Появление функционально неполноценных форм клеток на 150 с экспозиции совпадает с влиянием повреждающего агента на популяцию старых клеток. Вторая волна вызвана включением внутриклеточных механизмов регуляции, развивающихся в связи с отсутствием экзогенного Са2+. По литературным данным, в присутствии антагонистов Са2+ (верапамила) начинается самопроизвольный ток ионов Na+ в клетки (П.В. Авдонин, В.А. Ткачук, 1994). В эритроцитах лягушек R. Ridibunda установлены низкое содержание Na+ (12,2±0,8 ммоль/л клеток) и высокая концентрация К+ (90,1±1,9 ммоль/л клеток), при этом концентрация Na+ и К+ в эритроцитах лягушек достоверно стабильна в разные сезоны года (Н..И. Агалакова и соавт., 1996). Таким образом, самопроизвольный ток Na+ по Са2+-каналам в присутствии кальциевого антагониста, снижающего сродство Са2+ и блокирующего его вход, теоретически будет приводить к развитию деполяризации мембраны и изменению ее заряда.

В поддержании объема эритроцитов основную роль отводят ионам К+, большая часть которых поступает в клеткучерез К+-Cl–-ко- транспорт (Н.И. Агалакова, 1996). Не исключено, что наблюдаемые нами циклические процессы в динамике формы клеток и их коэффициента резервной поверхности, а также появление пиков, связанных с массовой деструкцией клеточных мембран, являются

231

показателем конкурентных потоков ионов в клетку и, как следствие, развития деполяризации мембраны, причем по скорости выраженности наблюдается различная динамика, не исключено в связи с последовательным вовлечением в процесс целого спектра каналов переноса. Мы полагаем, что первые 120 с инкубации, пока устанавливается связь в комплексе рецептор – верапамил, поток Na+ в клетки зависит от диффузионной компоненты. В последующие 180 с Na+ поступает через Са2+-каналы и Na+/H+- обменник, в результате чего клетки сжимаются, что подтверждается снижением коэффициента эксцентричности и коэффициента резервной поверхности. В следующие 120 с развивается активный внутриклеточный ответ, связанный с выкачиванием Na+ из клетки посредством Na+-K+-насоса, и не исключено, что с участием Na+/H+-обменника (поскольку, по литературным данным, он обеспечивают реверсивный ток ионов), в результате чего увеличиваются коэффициент эксцентричности и коэффициент резервной поверхности клеток, эритроциты пытаются восстановить свою форму.

Фармакологический эффект, развивающийся в организме in vivo, начинается с клеточного уровня. Наиболее мобильной интегральной системой, вовлекаемой в реакцию, является периферическая кроветворная ткань. Эритроциты – универсальные транспортеры – будут моментально реагировать на введение химического вещества. В условиях in vitro мы моделируем ситуацию не просто транспортировки эритроцитами экзогенного вещества, но и инициируем фармакологическую реакцию, основанную на усилении или угнетении физиологических процессов, которые реализуются на базе определенной клеточной структуры.

Нами установлено, что первоначальная реакция на воздействие верапамила – снижение сорбционной способности эритроцитов вследствие адсорбции препарата на клеточной поверхности. По литературным данным, адсорбция характеризуется обратимостью, в основе ее лежат все типы непрочных связей: ван-дер- ваальсовы, водородные, ионные, дипольные. Поскольку опыт был поставлен in vitro, исключались движение крови по микроциркуляторному руслу и реализация механизма десорбции верапамила эндотелиальными стенками сосудов. В результате представилась возможность наблюдать прямые эффекты блокатора

232

Са2+-каналов на эритроцитарные мембраны, т. е. влияние вещества после образования прочных ковалентных связей с клеточной поверхностью.

Входе проведенных экспериментов установлена высокая чувствительность клеточной поверхности к действию кальциевого антагониста. Быстрота морфологических перестроек эритроцитарной популяции находилась в пределах 30 с, при этом в ре-

акцию вовлекались либо magnulocutys, либо teretiocutys; eliptocutys реагировали через 330 с. Не исключено, что для эритроцитарной популяции форма клеток eliptocutys является афизиологической и появляется in vitro на стекле или в пробирке в условиях инкубации при измененной температуре, рН среды, отсутствии глюкозы и воздействии других факторов. Возможно, что вначале определенная субклеточная популяция адаптировалась к измененным факторам среды, а затем реагировала на верапамил, что отразилось на скорости реакции. С другой стороны, нельзя исключить предположения, что eliptocutys – физиологически зрелая

иустойчивая субпопуляция эритроцитарной системы, поэтому имеет достаточно совершенный адаптационный резерв, участвующий в поддержании формы клетки, тогда на 330 с инкубации, когда эта субпопуляция вовлекается в реакцию, можно полагать функциональное истощение этого резерва.

Вотношении динамики формы клеток и коэффициента резервной поверхности нами продемонстрирована цикличность. Первоначальная реакция связана с разнонаправленным характером эффектов – увеличением коэффициента эксцентричности на фоне снижения коэффициента резервной поверхности через 30 с инкубации. Впоследствии динамика этих параметров была однонаправленной и выражалась в снижении коэффициента резервной поверхности и коэффициента эксцентричности до 330 с, затем их увеличении в период с 330 до 420 с экспозиции и ростом коэффициента эксцентричности на фоне снижения коэффициента резервной поверхности до истечения времени инкубации.

Отмеченные флуктуации морфологии эритроцитов и их временную зависимость мы связываем с влиянием верапамила на

конкурентные транспортные ионные потоки. По косвенному параметру (рН среды) нами установлена стимуляция Na+/H+-

обменника в эритроцитарных мембранах лягушек, в результате чего в среду активно выкачивается водород в обмен на Na+. Со-

233

гласно литературным данным, ингибирующее влияние антагонистов Са2+ связывают с уменьшением деполяризации мембраны. Такая интерпретация была дана в работе C. Randiamampita et al. (1991) по ингибированию нитрендипином Са2+-входа в Т-лимфо- циты. На тромбоцитах показано, что кальциевые антагонисты не блокируют, а модулируют рецепторуправляемые каналы, подавляя вход Са2+ и активируя ток Na+. В работах П.В. Авдонина, В.А. Ткачука (1994) отмечается, что такая ситуация создается вследствие уменьшения сродства каналов к Са2+, при этом в присутствии антагонистов начинается самопроизвольный ток Na+ в клетки, который ингибирует ток Са2+. Эта гипотетическая схема наиболее подходит для объяснения полученных нами результатов.

Сопоставив рассмотренные гипотезы, результаты опытов Н.И. Агалаковой (1996) по транспорту одновалентных катионов через эритроцитарные мембраны лягушек Rana ridibunda с собственными результатами, приходим к выводу, что верапамил действительно активирует работу Na+/H+-обменника, в итоге клетки сжимаются, что отражается на их геометрических характеристиках. Не исключено, что ток Na+ в клетку вызывает деполяризацию мембраны и смену ее заряда. Цикличность в изменении формы клеток как раз связана, по всей видимости, с разновременным включением транспортных мембранных каналов. Установлено, что поток Na+ в эритроцитах Rana ridibunda происходит за счет диффузионной компоненты, а также посредством активации Na+/H+-обменника. В то же время конкурентный ток К+ осуществляется через Na+-K+- насос, K+-Cl--переносчик и диффузионную компоненту. Таким образом, включение различных ионных транспортеров отражается на форме клетки и поверхностном заряде ее мембраны. При этом физиологические эффекты верапамила на систему эритрона не выходят за пределы эволюционно выработанных физиологических функций и связаны с функционированием адаптационных клеточных механизмов на уровне транспортных ионных систем мембран.

3.5.3.3. Функциональный профиль эритроцитарной системы лягушек при блокаде β-адренорецепторов. Реактивность живых систем к фармакологическим агентам, широко применяемым в экспериментальной биологии и медицине, определяется спецификой метаболизма, структуры и нейрогуморальной регуляцией функций. С использованием фармакологических средств

234

воспроизводятся модели патологических состояний и создаются условия для анализа физиологических функций при отклонении гомеостатических параметров среды от оптимального для метаболизма уровня (В.В. Гацура, А.С. Саратиков, 1977).

Фармакологический эффект препарата, возникающий в целом организме, начинается с действия лекарственного вещества на клетки, изменяя их мембранную проницаемость, в связи с чем в качестве модели для изучения реализации внутриклеточных механизмов ионного обмена со средой, отражающихся на морфологии клетки, нами использовались эритроциты лягушек Rana ridibunda. По литературным данным, мембраны ядерных эритроцитов земноводных содержат систему β-адренорецепторов и активность некоторых ионтранспортирующих систем в клетках красной крови регулируется катехоламинами. Стимулирующее действие катехоламинов устраняется антагонистами β-адрено- рецепторов (Н.И. Агалакова, 1996).

Пропранолол является неизбирательным блокатором β-адре- норецепторов, одновременно воздействуя на β1- и β2-адрено- рецепторы (В.Г. Граник, 2001). В литературе имеются сведения о наличии атипичных β-адренорецепторов в эритроцитах лягушек, которые обладают одновременным сходством с β1- и β2-адреноре- цепторами высших животных (П.В. Сергеев, Н.Л. Шимановский, 1987). Учитывая это, мы проанализировали динамику морфометрического профиля эритроцитов в гипотонической среде при преинкубации их с пропранололом. Установлено, что под влиянием пропранолола через 30 с снижается коэффициент эксцентричности на фоне резкого повышения толщины, площади поверхности и объема клеток (табл. 18, 19).

Наиболее значимые различия между опытной и контрольной пробами отмечались на 30, 120, 240 и 3600 с. Так, на 30 с в опытной пробе коэффициент эксцентричности снижался на 16,83% (р<0,001), а толщина, площадь поверхности и объем клетки возрастали соответственно на 64,43; 85,44; 94,55%, а коэффициент резервной поверхности под влиянием пропранолола снижался на 40,29% (р<0,001). Через 120 с инкубации коэффициент эксцентричности в опытной пробе снижался на 20,92% (р<0,001), толщина, площадь поверхности и объем клетки повышались на

61,97; 84,03; 94,03% (р<0,001), коэффициент резервной поверх-

ности снижался на 34,32% (р<0,001) по сравнению с контрольной. На 240 с инкубации коэффициент резервной поверхности

235

повышался на 23,20%, толщина, объем и площадь поверхности возрастали соответственно на 63,46; 94,04; 84,43%; коэффициент эксцентричности снижался на 34,84% (р<0,001). К концу инкубации (3600 с) в опытной пробе коэффициент эксцентричности снижался на 15,39% (р<0,001), толщина, площадь поверхности,

объем увеличивались на 60,47; 82,55; 92,74% (р<0,001), коэффи-

циент эксцентричности снижался на 37,11% (р<0,001) по сравнению с контролем.

Таблица 18

Морфологический профиль крови лягушек

(физиологические условия, n = 50)

Примечание: ε – коэффициент эксцентричности, S – площадь поверхности; V – объем, Т – толщина, CRS – коэффициент резервной поверхности.

236

Примечание: обозначения, как в табл. 18.

* Статистическая значимость достоверности различия с исходными данными при р<0,001; критерий Стьюдента.

Наблюдаемые эффекты пропранолола на морфологический профиль эритроцитов мы связываем с влиянием блокатора на проницаемость эритроцитарной мембраны для ионов и изменением транспортных ионных потоков в клетку. В работах Н.И. Агалаковой (1996) показано ингибирование пропранололом транспорта К+ в эритроциты. При этом показано, что поток К+ в эритроцит лягушек вносит Cl-зависимый транспорт. К-Сl-котранспорт обеспечивает

237

основную часть поступления К+ в клетку и участвует в регуляции внутриклеточного содержания ионов и объема клеток.

Таким образом, наблюдаемое нами резкое увеличение объема и потеря формы клеток, вероятно, связаны с ингибированием К-Сl- котранспорта. Указанный транспортный путь высокочувствителен к изменению температуры окружающей среды по сравнению с Na-K-АТФазой. В эритроцитах летних лягушек К-Сl-котранспорт будет первой мишенью для пропранолола. Увеличение объема клетки, площади поверхности и толщины в условиях действия пропранолола мы связываем с химической природой этого вещества и способностью его хорошо растворяться в липидах.

При связывании пропранолола с β-адренорецепторами происходит стабилизация мембраны за счет изменения транспорта ионов. В частности, пропранолол блокирует фосфорилирование G-белков цитоскелета, в результате чего поток кальция в клетку прекращается. Кроме того, учитывая, что кальциевые каналы эритроцитарных мембран являются рецепторуправляемыми (С.А. Сторожок и соавт., 1997), под влиянием пропранолола не происходит активация инозитол-1,4,5-трифосфата и поток кальция в клетку тормозится.

Реактивность эритроцитов крови лягушек в ответ на изменение состава среды при добавлении 0,27·10-3 ммоль/л пропранолола (неселективный блокатор β-адренорецепторов) отражена на-

рис. 39.

Рис. 39. Динамика клеточного ответа на блокаду мембранных β-адренорецепторов

238

Первая реакция эритроцитов отмечается через 90 с инкубации, в которую вовлекаются клетки с высокопроницаемой мембраной. По данным литературы (Н.И. Агалакова, 1996), показано ингибирование пропранололом транспорта К+ в эритроциты. К-Сl-котранспорт обеспечивает основную часть поступления К+ в эритроцит и участвует в регуляции внутриклеточного содержания ионов и объема клеток. Наблюдаемая реакционная способность эритроцитов на 90, 150 и 210 с связана с ингибицией К-Сl-котрнспорта. Начиная с 270 с и по 450 с наблюдается следующая волна вовлечения эритроцитов в ответ на воздействие пропранолола, что связано с химической природой этого вещества и способностью его растворяться в липидах биологических мембран. В течение этого временного интервала пропранолол массово проникает через плазмолемму, изменяя вязкоэластические свойства липидного бислоя и блокируя деятельность β-адренорецепторов. Кроме того, в липидном бислое пропранолол образует дополнительные кластеры проницаемости. Заключительная волна реактивности эритроцитов наблюдается на 3600 с инкубации и совпадает с включением функционально активных эритроцитов.

Учитывая резкое повышение коэффициента резервной поверхности через 20 с инкубации, мы не исключаем повышенной реакционной способности клеток на фармакокинетический агент. Через 30 с количество функционально неполноценных клеток в условиях действия пропранолола повышалось в 8 раз, через 60 с – в 9 раз. Следовательно, рост коэффициента резервной поверхности на фоне сокращения коэффициента формы клеток свидетельствует о развитии гемолитических процессов в системе. На 180 с количество форм с дестабилизированной мембраной составило 79,41% (в контроле – 23,45%). Наблюдаемое явление сохранялось до конца инкубации (рис. 40).

Таким образом, блокада β-адренорецепторов неспецифическим блокатором пропранололом в дозе 0,27·10-3 ммоль/л приводит к физиологической дисфункции эритроцитов.

239

контроль опыт

Рис. 40. Динамика функционально неполноценных форм эритроцитов при воздействии пропранолола и гипотонии

С эволюционной точки зрения, возможно, наблюдаемая реакция закономерна, поскольку всё многообразие лекарственных препаратов вызывает изменение физиологических систем клеток, которые генетически сложились в ходе эволюции. В конкретном случае пропранолол изменяет протекание физиологических процессов по пути торможения К-Cl-котранспорта, что является главной причиной морфологической дисфункции в период весенне-летней вспышки гемопоэза.

240