2 курс / Нормальная физиология / Физиология_крови_Липунова_Е_А_,_Скоркина_М_Ю_

ством гомеостатических регуляторных механизмов у животных более низких ступеней эволюционного развития. Повышенную реактивность красных клеток крови этой группы животных увязывают также с превалированием во внутренней среде факторов, способствующих дисбалансу объема клетки над внешними факторами. К их числу можно отнести бактериальные и вирусные инфекции; образующиеся токсины, как известно, способны нарушать осмотический баланс клеток посредством формирования пор в клеточной мембране. Вероятно в эволюции животных параллельно с усовершенствованием иммунных механизмов защиты формировалась высокая устойчивость собственных клеток к экзо- и эндогенным факторам, потенциально способным нарушать их осмотический баланс.

Резистентность клеток к различным воздействиям обусловливается также уровнем формирования цитоскелета клеток. Доказано, что клетки разной степени зрелости цитоскелета поразному реагируют на действие гипотонии. В клетках, в которых цитоскелет выражен слабо, адаптивная реакция связана с регуляторным уменьшением клеточного объема; хорошо развитый цитоскелет, выполняя функцию внутриклеточного каркаса, удерживает клетку в жестком состоянии (Е.А. Смирнова и соавт., 1987).

201

Максимальная скорость гемолиза наблюдалась на 20-й с и составила 22,15±1,76% гемолизированных клеток. По функциональным свойствам отчетливо выделились три популяции клеток: популяция низкостойких клеток составила 93,31±1,25% с продолжительностью гемолиза 70 с, среднестойких – 6,58±0,20% с длительностью гемолиза 130 с и высокостойких – 0,66±0,06% и гемолизом до 180 с. Среднее время гемолиза – 170 с; эритрограмма асимметричная; до 30-й секунды скорость гемолиза максимальная. Присутствие в периферическом русле трех разностойких популяций эритроцитов свидетельствует об их функциональной неоднозначности.

Анализ научной литературы показывает, что для кроветворения лягушек характерна многоочаговость. В эритропоэзе помимо костного мозга участвуют также селезенка, краевая подкапсульная зона печени, кишечник. Гемопоэз может протекать также в периферическом русле (Ж.А. Медведев, 1972; Д.Х. Хамидов и соавт., 1978).

Как показали наши исследования, основную часть клеток составила низкостойкая популяция (быстроразрушающаяся), что связано, вероятно, со структурно-функциональными особенностями эритроцитарной мембраны лягушек (М.Ю. Скоркина и соавт., 2004; М.Ю. Скоркина, А.С. Зеленцова, 2004а; М.Ю. Скоркина, А.С. Зеленцова, 2006). Полученный экспериментальный материал не противоречит существующему мнению о том, что эритроцитам лягушек свойствен динамический тип старения, характерный для старения обновляемых клеток (Ж.А. Медведев, 1973). По сравнению с эритроцитами других видов, жизненный цикл эритроцитов лягушки более продолжительный и превышает 230 сут (Ж.А. Медведев, 1972); у жаб до 800-1400 сут и почти совпадает с продолжительностью жизни самих животных (P.D. Atland, K.C. Brace, 1962). Следовательно, старение эритроцитов по своему характеру приближается к старению неделящихся специализированных клеток организма. Эритроциты лягушек способны к обновлению белков ядра и негемоглобиновых белков цитоплазмы. О высокой биохимической и биологической «полноценности» эритроцитов земноводных косвенно свидетельствует их участие в иммунологических реакциях, в частности, установлена способность клеток к фагоцитозу бактерий, проникающих в кровь (А.А. Заварзин, 1953; P. Prunesco, 1971).

202

У отдельных особей многоочаговость кроветворения и функциональная гетерогенность эритроцитарной популяции подтверждаются наличием на кислотной эритрограмме двух пиков: первый – на 20-й с, отражающий популяцию низкостойких клеток (23,3%) с явно выраженным периодом сферуляции; второй – на 70-90-й с, включающий популяцию среднестойких клеток (40,0%). Популяция высокостойких клеток составила 37,3% с максимумом гемолиза на 100-й с (рис. 24, особь № 1).

Рис. 24. Индивидуальные особенности кислотной резистентности эритроцитов крови лягушек (объяснение в тексте)

Нами отмечена активация эритропоэза у отдельных лягушек, находящихся в состоянии анабиоза (см. рис. 24, особь № 2) – пик гемолиза низкостойкой популяции клеток смещен вправо (50 с), эритрограмма уплощена и растянута. Среднее время гемолиза у особей № 1 и № 2 составило соответственно 120 и 145 с.

Характер изменения осмотической устойчивости эритроцитов крови лягушек соответствовал возрастным особенностям клеток эритроцитарной популяции, установленным нами методом построения кислотных эритрограмм. Эритроциты обладают повышенной осмотической устойчивостью. Критическая точка резистентности соответствовала осмоляльности 0,2% раствора хлорида натрия (рис. 25).

Точка минимальной устойчивости отмечалась при концентрации раствора хлорида натрия 0,60%, при которой 96,8% клеток резистентны. В точке максимальной гипотонии (0,2% раствор

203

В основе осмотической резистентности эритроцитов лежат их устойчивость к гипотоническому набуханию и способность клеток красной крови к регуляторному восстановлению объема, контролируемого сигнальными молекулами, в том числе катехоламинами (А.В. Муравьев, В.С. Шинкаренко, 2003; S. Tuvia et al., 1999; S. Hilario et al., 1999; D.W. Knowles et al., 1999). Установ-

лено присутствие на мембране эритроцитов α- и β-адрено-

рецепторов (R.J. Lef-kowitz, 1978; G. Sager, S. Jacobsen, 1985; J. Sundquist et al., 1992). Мембрана земноводных содержит систему β-адренорецепторов, и активность некоторых ионтранспортирующих систем контролируется катехоламинами (Н.И. Агалакова, 1996; Г.П. Гусев, Т.И. Иванова, 2003).

Инкубация эритроцитов с адреномиметиком адреналином (4,5·10-7 ммоль·л-1, 15 мин, t = 25°С) привела к снижению гемолитической стойкости клеток. Анализ кислотных эритрограмм, отражающих липидную разнокачественность мембран популяции эритроцитов, позволяет заключить, что 93,8±1,02 и 93,31±1,25% в популяции составляют клетки пониженной стойкости (с гемолизом до 70 с); 9,02±0,14 и 6,58±0,20% – средней стойкости (ге-

молиз до 130 с) и 0,31±0,05 и 0,66±0,06% – эритроциты повы-

шенной стойкости (время гемолиза – до 180 с) соответственно в опытной и контрольной пробах. Эритрограммы асимметричны, скорость гемолитического процесса максимальна на 20-й с, кото-

204

рой соответствует разрушение большей части низкостойких клеток; в опытной пробе эритроциты менее резистентны. В обеих пробах гемолиз начинается через 10 с и заканчивается на 160 с в опытной и на 180 с – в контрольной. Ширина интервала гемолиза в опытной и контрольной пробах – соответственно 150 и 170 с. Сужение интервала гемолиза происходит преимущественно вследствие увеличения скорости гемолитического процесса на 20-й с: высота максимума эритрограммы лягушек опытной пробы на 7,4% выше, чем в контрольной (А.С. Зеленцова, 2004) (рис. 26).

Полученные данные отражают одноочаговость эритропоэза у лягушек в состоянии анабиоза и преобладание в периферической крови зрелых форм клеток. Снижение стойкости эритроцитов под влиянием адреналиновой нагрузки в наших опытах связано с особенностями организации адреналового регуляторного механизма. В исследованиях in vivo, проведенных Н.А. Троицкой (1967) на кроликах, установлены две стороны в эффектах гормона на красные клетки крови при разовом (однократном) воздействии в дозе 0,20 мг·кг-1: повышение стойкости эритроцитов в первые 30 мин после инъекции и уменьшение – в более позднее время наблюдения. Продолжительное введение гормона (в той же дозе в виде эмульсии с 0,5 мл масла) вызывало увеличение стойкости эритроцитов. Анализируя эти данные, автор приходит к выводу, что метод кислотных эритрограмм позволяет характеризовать свойства эритроцитов, циркулирующих в кровяном русле: так же, как и при осмотическом гемолизе, устойчивость красных клеток крови к ки-

205

слотному гемолизу зависит от свойств мембраны и особенностей внутриэритроцитарных метаболических процессов.

Косвенно адреналин может влиять на проницаемость мембраны эритроцита через изменение концентрации глюкозы в крови. Избыток глюкозы, как известно, приводит к гликозилированию белков мембраны эритроцита (спектрина, гликофорина и белка полосы 3) и гемоглобина. При этом меняется конформация гемоглобина (повышается доля HbАic от общего гемоглобина крови), что снижает деформабельность красных клеток. Снижению пластичности эритроцитов способствует также интенсификация полиолового пути метаболизма глюкозы, приводящая к накоплению в клетках сорбитола. Изменение внутриэритроцитарного метаболизма приводит к осмотическому дисбалансу, нарушению барьерной функции мембраны, увеличению ее проницаемости для липидов, кислых мукополисахаридов, катионов (В.А. Галенок и соавт., 1987).

У некоторых подопытных лягушек обнаружена активация эритропоэза: появление на эритрограмме нескольких пиков, отражающих наличие в периферической крови разностойких клеток, и увеличение до 200 с времени гемолиза (рис. 27). Наблюдаемые эффекты мы связываем с особенностями функционального состояния эритрона и эритропоэза у отдельных особей.

Осмотическая стойкость эритроцитов крови лягушек опытной пробы в точке максимальной гипотонии (0,2% раствор NaCl) на 20,9% выше, чем в контрольной (рис. 28).

206

Рис. 28. Осмотическая резистентность эритроцитов крови лягушек под влиянием адреналиновой и гипоосмотической нагрузок

Ускорение гемолитического процесса мы связываем со структурно-функциональными изменениями мембран под влиянием адреналина, ростом в эритроцитарной популяции процентной доли широкоэлиптических клеток (magnulocytus), имеющих большую площадь поверхности и обладающих значительным количеством сквозных гидрофильных пор, по которым вода диффундирует в клетку (Е.А. Липунова, М.Ю. Скоркина, 2004; 2006; М.Ю. Скоркина, А.С. Зеленцова, 2004; Е.А. Липунова, М.Ю. Скоркина, А.С. Зеленцова, 2006; 2007).

Адреналин посредством эффекта «растекания на мембране» приводит к изменению физико-химического состояния липидной фазы в сторону большей ее жидкостности, а следовательно, и подвижности как липидных, так и белковых молекул мембраны

(М.Н. Перцева, 1989).

Феномен «обволакивания» эритроцитов катехоламинами при стрессе описывают П. Резницкий и соавт. (P. Resnitzky et al., 1972).

Увеличение проницаемости мембраны и изменение механизмов трансмембранного переноса ионов отражается на морфометрических и биометрических индексах клеток и их устойчивости к гипотонии (Е.А. Липунова, М.Ю. Скоркина, А.С. Зеленцо-

ва, 2005).

После инкубации суспензии эритроцитов с адреналином (4,5·10-7 ммоль·л-1, 15 мин, t=25°С) клетки помещали в гипоосмотическую среду (0,2 % раствор хлорида натрия). В ходе часовой экспозиции через каждые 30 с осуществляли видеорегистрацию и компьютерный анализ морфологического профиля клеток, ис-

207

пользуя анализатор изображений «Видео-Тест-Мастер- Морфология» (Санкт-Петербург, 2000). Определяли максимальную и минимальную оси клетки, рассчитывали коэффициент эллонгации (эксцентричности), средний объем, толщину и площадь поверхности мембраны. Биометрические индексы определяли по предложенному нами способу (патент № 2234701, 2004). Контролем служили эритроциты, также помещенные в 0,2% NaCl, но не инкубированные с адреналином.

Через 30 с экспозиции при незначительном увеличении объема эритроцита прирост поверхности мембраны составил 57,9% (p<0,001); характер отклонения резервных возможностей мембраны (RVM) и регуляторные свойства /возможности клеток (RVK) в опыте и контроле отличались незначительно; коэффициент резервной поверхности (KRS) был выше в опыте на 58,1% (p<0,001). Через 180 с прирост RVM составил 53,0%, KRS понизился на 17,5% (p<0,001), а RVM – возросли на 94,1% (p<0,05). Увеличение RVM составило 7,2; 8,4; 10,0 и 48,8 % , а понижение KRS – на 14,8; 13,5; 9,3 и 5,4% (p<0,001) соответственно через 270, 600, 900 и 3600 с. Объем клетки и площадь поверхности мембраны снижались, и только через один час отмечено повышение объема на 5,5 % и площади поверхности – на 6,7%. Адреналин способствовал повышению каталазного числа (на 12,0%) на фоне ингибиции перекисной резистентности. Следовательно, мембраннотропные эффекты адреналина проявлялись в стабилизации и снижении устойчивости мембран к гипоосмотическим нагрузкам и кислотным гемолитикам на фоне активации антиоксидантных систем (А.С. Зеленцова, 2007; Е.А. Липунова, М.Ю. Скоркина, А.С. Зеленцова, 2004; 2005; 2007).

3.5.2.2. Резистентность эритроцитов крови птиц. Тесты на резистентность, проведенные нами на птицах (петухи кросса «Иза Браун»), показали качественную разнородность эритроцитарной системы, обусловленную возрастными особенностями клеток. Кривая распределения эритроцитов по их стойкости в физиологических условиях (рис. 29) отражает одновременное присутствие в крови нескольких принципиально различающихся между собой популяций клеток.

В приведенной эритрограмме можно выделить три максимума (пика), которые отражают скорость гемолитического про-

208

цесса и соотносятся со стойкостью клеток: максимум высокостойких клеток выявлен на 5,5-й мин, их процентная доля в общей популяции клеток составляет 12,89 2,74%; среднестойких – на 4-й мин (13,67 2,74%); низкостойких – на 2,5-й мин (12,36 2,16%) гемолиза. Начинается процесс через 1,5 мин, заканчивается – на 6,5-й мин. Ширина интервала гемолиза составляет 5,0 мин. Появление нескольких максимумов – признак двойственного и неравномерного кроветворения (И.И. Гительзон, А.И. Терсков, 1959), что мы связываем с особенностями новообразования эритроцитов у птиц и сохранением у взрослых особей черт эмбрионального кроветворения. Кроме того, для костномозгового эритропоэза птиц свойственно интраваскулярное происхождение. Основной источник образования эритроцитов – эндотелиальные клетки синусов костного мозга. Процессы созревания и дифференцировки эритроцитов происходят в просвете сосудов костного мозга (И.А. Болотников, Ю.В. Соловьев, 1980).

Сравнительное изучение возрастной динамики эритроцитарной популяции птиц и млекопитающих методом построения эритрограмм выявило их общность, несмотря на морфологические различия клеток эритроидного ряда.

В наблюдаемой нами разновозрастной кинетике эритроцитарной популяции в физиологических условиях тест на осмотическую резистентность эритроцитов дополняет показатели кислотных эритрограмм (рис. 30). Установлено, что критическая точка резистентности крови птиц, т. е. концентрация NaCl, при которой еще не наблюдается полного лизиса клеток, как и у млекопитающих,

209

соответствует осмоляльности 0,55% раствора NaCl и отражает группу среднестойких эритроцитов. Границу минимальной резистентности определяют старые эритроциты, а максимальной – молодые (Л.М. Фридман, 1957; Я.Д. Ужанский, 1968).

Рис. 30. Осмотическая эритрограмма крови петухов в физиологических условиях

Осмотическая резистентность отражает проницаемость эритроцита для различных веществ и ее зависимость от формы клетки и свойств мембраны (Т.С. Истманова и соавт., 1973). Гипотоническое окружение может провоцировать разрыв клеточной мембраны вследствие механического повреждения. В физиологических условиях осмотическая стойкость клеток – величина достаточно постоянная, но может изменяться при старении клетки, повышении ее функциональной активности, в условиях патологии или дополнительных воздействий на организм (В.П. Бондаренко и соавт., 1985; 1990). При относительно стабильных условиях основной причиной мембранного разрыва выступают не механические, а биохимические повреждения мембраны (W. Bolton, M.F. Perutz, 1970).

По нашим данным, у птиц в фоновых исследованиях 0,08% клеток эритроцитарной популяции дестабилизируются в физиологическом растворе (0,85% NaCl), и зона резистентности, характеризующая разницу между физиологическим раствором и точкой наименьшей резистентности, отсутствует. Поскольку процентная доля этих клеток незначительна, при анализе осмотических эритрограмм (в физиологических условиях) за точку минимальной резистентности мы приняли клетки, устойчивые в 0,60% растворе NaCl, что составило 99,6% всех клеток. Даже при высокой гипотонии раствора не происходил полный гемолиз эритроцитов с образованием «лаковой» крови.

210