2 курс / Нормальная физиология / Физиология_крови_Липунова_Е_А_,_Скоркина_М_Ю_

Птицы одного вида также обладают неодинаковой устойчивостью к воздействию стресс-факторов, проявляемой в особенностях поведения и выраженности функционирования системы гипофиз – кора надпочечников: у одних особей в крови быстро нарастает уровень адренокортикотропного гормона (АКТГ), кортикостероидных гормонов, и наступает гипертрофия коры надпочечников, инволюция тимико-лимфатической системы; у других – гормональные реакции на те же самые стрессвоздействия выражены слабее. В связи с этим различают птиц, чувствительных и устойчивых к стрессу. Устойчивые к стрессу птицы способны переносить воздействия большей интенсивности и продолжительности, чем стрессчувствительные (И.А. Болотников и соавт., 1983).

Таким образом, представленный фактический материал позволяет сделать вывод о том, что в основе клеточной лабильности главнейшим фактором выступают селективная проницаемость мембраны для ионов, управляемая системами ионного транспорта. Независимо от уровня организации животного первоначальная стереотипная реакция на стрессовое воздействие связана с понижением резистентности эритроцитов и активации гемолиза. Периоду регенерации предшествует образование в каждой клетке (ткани) веществ – аутокатализаторов, – имеющих свойство стимулировать ее собственную функцию (А.А. Богомолец, 1957), т. е. активация общего катаболиза и непременно эритродиереза.

3.5.3. Реактивность клеток крови

3.5.3.1. Методы определения. Реактивность клетки – функциональное, сугубо физиологическое ее свойство отвечать на внешние воздействия, превышающие известный индивидуальный уровень активного состояния, определенной формой деятельности – усиленным метаболизмом, ускоренным делением, движением, электрическим импульсом.

Одна из ведущих проблем клеточной физиологии и лабораторной диагностики – оценка функционального состояния организма человека и животных. Современная медицина и биология располагают достаточно широким арсеналом средств диагностики

222

отклонений функций от должных гомеостатических параметров. Так, в качестве показателя активности эритропоэза и эритропоэтической деятельности костного мозга применяется методика подсчета количества ретикулоцитов в периферической крови; проследить основные этапы этой деятельности можно посредством изучения пунктатов костного мозга. Достаточно надежный показатель репродуктивной способности костного мозга – общее количество эритроцитов в периферической крови. Использовав его в качестве индикатора регенераторной активности эритробластической части костного мозга и экспериментально определив полупериод гибели эритроцитов, рассчитывают общую возмещенную потерю эритроцитов, которая информирует о том, какое количество клеток поступило в кровоток, что, по сути, отражает костномозговую продукцию эритроцитов.

Особого внимания заслуживают способы оценки функционального состояния организма по степени резистентности клеток крови к гемолитикам, основанные на различии в скорости вовлечения в гемолитический процесс разновозрастных, а следовательно, различающихся и функционально, субпопуляций эритроцитарной системы. В последние годы степень применения этих способов не только в научных исследованиях, но также в клинической лабораторной диагностике существенно возросла.

Значимость этих методик в оценке функционального состояния эритрона была подтверждена в наших исследованиях, выполненных в сравнительно-физиологическом плане (Е.А. Липунова, М.Ю. Скоркина, 2004; Патент РФ № 2227280, 2004; Патент РФ № 2268463, 2006). Тем не менее, необходимость поиска нового высокоспецифичного способа, отличающегося точностью, информативностью, доступностью и быстротой выполнения, актуальна и в настоящее время. Тем более, теория клеточного формообразования по-прежнему интенсивно обсуждается специалистами в области патофизиологии клетки. В клинических исследованиях установлено, что параметры распределения эритроцитов и других форменных элементов крови по размерам и значения среднего объема частицы находятся в корреляционной зависимости с тем или иным заболеванием.

Таким образом, глубокие исследования в области клеточной физиологии дают основание создавать новые системы диагностики и мониторинга заболеваний, в которых основным параметром

223

оценки функционального состояния целого организма является соответствие между скоростью изменения формы клетки и типом воздействия на нее. Следовательно, скорость клеточного ответа на различные воздействия будет зависеть от функционального состояния системы кроветворения и отдельных ее звеньев.

Объективным маркером развития адаптационных процессов на клеточном уровне служит расчет коэффициента резервной поверхности эритроцитов (CRS) (Патент РФ № 2268463, 2006). Его определение позволяет выявлять среди морфологически однородных эритроцитов крови функционально полноценные и деструктивные формы. Нами экспериментально установлено, что коэффициент резервной поверхности для функционально активных (полноценных) эритроцитов крови амфибий и птиц при изменении условий среды имеет обратную функциональную зависимость по отношению к коэффициенту эксцентричности, отражающего форму эритроцита (Патент РФ № 223701, 2004). Установлено, чем ближе форма ядросодержащегося эритроцита крови к узкоэллиптической, тем ниже значение коэффициента эксцентричности. Индикатором функциональных нарушений в мембране при максимальном набухании эритроцита служит увеличение до значения выше единицы коэффициента резервной поверхности, рассчитанного как отношение прироста площади поверхности эритроцитов, инкубированных в сильно гипотонической среде (0,2% раствор хлорида натрия), к аналогичным значениям клеток, выдержанных такое же время в изотоническом растворе (0,65% NaCl).

3.5.3.2. Функциональная морфология эритроцитов крови лягушек в условиях блокады кальциевых каналов. Верапамил, выступая кальциевым блокатором фенилалкиламиновой природы, широко используется в качестве эффективного препарата при лечении сердечно-сосудистых заболеваний. Первоначально основной механизм его действия рассматривали с позиций селективного ингибирования потенциалуправляемых кальциевых каналов L- типа. Однако на неактивных клетках крови – тромбоцитах установлено, что блокаторы потенциалуправляемых каналов способны подавлять рецепторзависимый подъем цитоплазматического Са2+ (P.V. Avdonin et al., 1988). Существует предположение, что Са2+-блокирующее действие верапамила не связано с активацией протеинкиназы С, поскольку он угнетает активность этого

224

фермента. По другим данным, высвобождение внутриклеточного Са2+ под действием инозитол-1,4,5-трифосфата (через ионные каналы) не ингибируется классическим блокатором кальциевых ка-

налов – верапамилом (S.M. Seiler et al., 1987).

Одним из возможных механизмов подавления входа Са2+ в невозбудимую клетку считают развитие деполяризации мембраны, обусловленное током одновалентных катионов: блокирование потока К+ в клетку при стимуляции потока Cl- из клетки. В частности, показано, что в максимальной дозе (50 мкМ) верапамил деполяризует плазмолемму тромбоцитов на 30 мВ (П.В. Авдонин, В.А. Ткачук, 1994). На Т-лимфоцитах установлено, что блокаторы, деполяризуя мембрану, уменьшают электродвижущую силу и снижают ток Са2+ (C. Randiamampita et al., 1991).

Учитывая разноречивый характер экспериментальных данных, известных в литературе, мы поставили задачу дать оценку эффектам универсального блокатора (верапамила) на эритроциты лягушки в период весенне-летний вспышки гемопоэза, обусловленной высокой активностью костного мозга. Более того, именно в этот период, по данным биохимического профиля плазмы, амфибии занимают более близкую позицию к млекопитающим по преобладанию полиеновых кислот ω 6-ряда над таковыми ω 3-ряда

(E.N. Maldonado et al., 2002; С.А. Забелинский и соавт., 2006).

К тому же, в физиологических условиях K+-Cl--котранспорт, являясь реверсивным, обеспечивает основную часть поступления К+ в клетки и обладает высокой чувствительностью к изменению температуры (Н.И. Агалакова, 1996). В связи с этим мы не исключаем возможность управления верапамилом транспорта одновалентных катионов и развития деполяризации эритроцитарной мембраны при отсутствии в ней потенциалуправляемых каналов.

Кривая, отражающая в динамике реактивность эритроцитов крови при экспозиции их в изотоничной среде с добавлением 0,25% раствора верапамила представлена на рис. 36.

Самая высокая реакционная способность характерна для эритроцитарной субпопуляции, с высоко подвижными внутриклеточными элементами цитоскелета, которые вовлекаются в ответ на изменение среды через 150 с от начала инкубации.

225

ляльности внутренней среды эритроцита ведет к его сжатию, что подтверждается снижением коэффициента эксцентричности и коэффициента резервной поверхности клетки. В следующие 120 с выражен активный внутриклеточный ответ, связанный с выкачиванием Na+ из эритроцитов посредством Na+-K+-насоса и с участием Na+/H+-обменника, поскольку, по литературным данным (Н.И. Агалакова, 1996), он обеспечивает реверсивный ток ионов, ведущий к росту коэффициентов эксцентричности и резервной поверхности эритроцитов, направленных на восстановление объема.

Как показали исследования, биологический эффект лекарственного средства (препарата), с позиций кинетической теории, определяется скоростью образования комплекса рецептор – молекула лекарственного средства и скоростью его диссоциации (В.В. Гацура, А.С. Саратиков, 1977; П.В. Сергеев, Н.Л. Шимановский, 1987; А.Г. Камкин и соавт., 2007)). Исходя из этого, мы проанализировали реактивность клетки – универсальной живой системы с позиций динамики морфометрического профиля эритроцитарной популяции.

Оказалось, первоначальная сорбция верапамила на клеточной поверхности была связана с эффектом изменения формы клеток: через 30 с инкубации коэффициент эксцентричности в опытной группе увеличивался на 7,17%, а в последующие 30 с – снижался на 5,44% (р<0,001) по сравнению с контролем

(табл. 16, 17).

Таблица 16

Морфометрический профиль эритроцитов крови лягушек

( в опытной группе проб; n=20)*

227

Окончание табл. 16

Примечание: ε – коэффициент эксцентричности, V – объем эритроцита, S – площадь поверхности, Т – толщина, CRS – коэффициент резервной поверхности эритроцита. * Статистическая значимость достоверности различия с исходными данными при р<0,001 (критерий Стьюдента).

Таблица 17

Морфометрический профиль эритроцитов крови лягушек

(в контрольной группе проб; n=20)*

228

Окончание табл. 17

Примечание: обозначения, как в табл. 16.

Через 120 с экспозиции различий по форме между клетками опытной и контрольной проб крови не наблюдалось. Однако, начиная со 150 с коэффициент эксцентричности в опытной группе снижался на 7,29% (р<0,05) по сравнению с контролем, причем такая особенность сохранялась до 300 с инкубации. Затем коэффициент эксцентричности в опытной группе повышался на 8,86; 6,40 и 6,69% (р<0,05) соответственно на 330, 360 и 390 с.

Разница по форме клеток между контрольной и подопытной пробами исчезала к 420 с, в последующее время отмечался рост коэффициента эксцентричности в опытной пробе на 4,81% на

450 с и на 8,08% – к концу инкубации (3600 с; р<0,05; рис. 37).

Эффекты воздействия верапамила на геометрические параметры эритроцитов оказались следующие: площадь поверхности клеток, их объем и толщина в подопытной группе были достоверно выше контрольных значений (см. табл. 16 и 17). С позиций оценки реактивности и чувствительности эритроцита как основного транспортера кислорода и метаболитов, циркулирующего во внутренней среде организма, наблюдаемые эффекты вполне закономерны. Особенно это касается таких параметров, как пло-

229

щадь поверхности и объем клетки – их прирост в условиях in vivo способствовал бы более эффективной доставке препарата в орга- ны-мишени.

%

15

10

5

0

-5

-10 30 90 150 210 270 330 390 450 510 570 900 3600c

Рис. 37. Динамика разницы по коэффициенту эксцентричности эритроцитов ( %) между опытной и контрольной пробами

Не исключено, что интегральный клеточный ответ на верапамил, проявившийся в увеличении площади поверхности, объема и толщины эритроцитов, произошел за счет внутренних резервов клетки, а именно – коэффициента резервной поверхности. Из табл. 16 и 17 видно, что CRS в опытной пробе высокодостоверно снижался по сравнению с контролем в первые минуты ин-

кубации: через 30 с – на 7,43%, 60 с – на 13,52; 210 с – на 11,31; 300 с – на 4,01% (р<0,001). В последующий период инкубации отмечен достоверный прирост коэффициента резервной поверх-

ности в опытной пробе: на 3,67; 3,46; 4,45 и 7,58% (р<0,05) соот-

ветственно на 330, 360, 390 и 420 с. Затем вновь коэффициент резервной поверхности уменьшался на 5,65; 4,04; 1,39% (р<0,05) на 450, 480, 570 с соответственно; с 600 с отмечен его рост и через 1 час экспозиции коэффициент резервной поверхности превысил контрольные значения на 11,27% (р<0,05; рис. 38).

Таким образом, характер взаимодействия верапамила с клеточной поверхностью и его эффекты на морфологию клеток красной крови лягушек свидетельствует о том, что пороговое фармакологическое действие блокатора на мембрану начинает проявляться через 330 с и длится 120 с; в этот временной отрезок увеличиваются коэффициент эксцентричности и коэффициент резервной поверхности (см. рис. 37, 38).

230