2 курс / Микробиология 1 кафедра / Доп. материалы / Микробиология_Нанобиотехнологии_А_А_Адиева_2016_пособие
.pdfоказались как нельзя кстати: при переходе к нанометровым масштабам традиционные подходы к описанию биологических объектов становятся неприменимы.
Важность новой области нанобиотехнологий разъяснил профессор кафедры биоинженерии и биоинформатики МГУ им. М.В. Ломоносова Константин Вольдемарович Шайтан: «Изучая гибридные, сделанные de novo
молекулы, мы понимаем, как функционируют и природные, и искусственно синтезированные полимеры». Вообще говоря, синтез биополимеров – прежде всего, белковых молекул – главный пример приложения новой техники для выяснения принципов самоорганизации молекул для создания искусственных нанообъектов.
Схожие примеры приводил в своем докладе и руководитель отдела структурной биологии Института биоорганической химии им. М.М.
Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН Александр Сергеевич Арсеньев. Его работы посвящены, в частности, изучению структуры и функции трансмембранных ионных каналов. По мнению Арсеньева, выяснение деталей функционирования ионных каналов может послужить подспорьем при создании искусственных пор нанометровых размеров. В работах используются три главных методики структурной биологии: экспрессия белков, ЯМР-спектроскопия биополимеров и молекулярное моделирование.
Эта комбинация – универсальный инструмент для изучения динамичной структуры ансамблей молекул.
Если пользоваться образными сравнениями, то работа нанобиотехнологов очень похожа на сборку устройств из деталей молекулярного конструктора.
Здесь ученые используют подходы биомиметики, пытаясь копировать материалы и объекты, уже созданные природой.
Уве Слейтр, специалист из нанотехнологического центра Вены,
рассказал о создании нанорешеток на основе бактериальных белков.
Некоторые белковые молекулы способны формировать плоские периодические структуры — т.н. S-слои, в пространстве образующие
решетку. Их можно использовать в качестве компонентов наноэлектронных устройств и биосенсоров. Фактически, S-слои — очень удобная площадка для самосборки протяженных объектов. Их можно размещать на самых разных поверхностях, как металлических, так и органических, а также закреплять на них функциональные группы из молекул других биополимеров
— например, ферментов. Австрийскими нанобиотехнологами уже создан прототип сенсора глюкозы — на S-слоях закрепили фермент глюкозооксидазу, который и стал основным компонентом биосенсора.
2.Лекарства доставят по адресу
Ивсе же наибольшие ожидания от нанобиотехнологии связывают с медицинскими разработками. Действительно, спектр задач, решаемых новой сферой науки, велик: здесь и диагностика, и лечение болезней самой разной природы.
Пожалуй, номер один в списке практических приложений нанобиотехнологических разработок — адресная доставка лекарств. Речь идет о «прицельном» попадании лекарств в патологически измененные клетки и ткани — мечте медиков, долгое время казавшейся призрачной, но,
похоже, начавшей принимать зримые очертания.
Палитру методов адресной доставки лекарств представил в своих работах Владимир Петрович Торчилин, профессор Центра фармацевтической биотехнологии и наномедицины (Северо-восточный университет, Бостон,
США).
По словам Торчилина, просто ввести лекарство в организм, даже снабдив его молекулярным «компасом», недостаточно. По пути к цели может случиться многое — надо защитить лекарство от разрушения в окружающей среде,
обеспечить его долговременную циркуляцию, накопление в одном,
конкретном, месте. Отдельная задача — «научить» лекарство проникать в конкретные клетки.
Существует несколько классов доставщиков лекарств — липосомы,
полимерные мицеллы, неорганические наночастицы. Для создания
Рекомендовано к изучению разделом по микробиологии сайта https://meduniver.com/
подходящего молекулярного «перевозчика» ученым приходится решать многофакторную задачу: учитывать размер, заряд, стабильность гибридного соединения в организме пациента, его биосовместимость и биодеградируемость.
Что касается конечного эффекта, то переносимые соединения должны удовлетворять двум требованиям: хорошо накапливаться в нужных тканях и обладать высокой степенью проникновения в клетки-«адресаты». Кроме того, в идеале молекулярные комплексы надо «научить» работать по принципу «включено-выключено», высвобождая лекарство в зависимости от окружающих условий (например, при распознавании патологических изменений в тканях).
3. Бактерии диагностируют рак
Но доставка лекарств — шаг терапевтический, следующий за диагностикой заболеваний. И здесь, в области определения конкретного недуга, нанобиотехнологии способны значительно облегчить работу медиков. Причем речь идет как о диагностике болезни in vitro, на лабораторном столе, так и in vivo — внутри тела пациента.
Яркий пример междисциплинарности нанобиотехнологий — биосенсоры.
Сфера их применения широка: например, они могут применяться для оценки степени химического загрязнения окружающей среды.
Для медицины нанобиотехнологи предлагают остроумные по своему устройству и принципу действия биосенсоры — например, на основе живых бактерий.
И это не выглядит фантастичным. В самом деле, что такое бактериальные клетки? На первый взгляд — микробы, одни из которых — патогенные,
другие относительно безвредные; излюбленный объект исследований молекулярных биологов. Все это верно. Но справедливо и другое утверждение: бактерии — непревзойденные кибернетические «устройства»,
обладающие способностью к движению, логике и коммуникации, а потому их можно считать уникальными сенсорами. Чувствительность отдельных
бактериальных клеток поражает: они могут распознавать до 7 молекул анализируемого вещества в пробе.
Заманчиво «приручить» бактериальные клетки, наделив их возможностью сигнализировать о развитии болезни у того или иного человека.
Идея сотрудников Института физико-химической медицины Росздрава,
под руководством профессора Вадима Марковича Говоруна: использовать бактерию Helicobacter pylori в качестве биосенсора для диагностики злокачественных поражений желудка. Как принято считать, деятельность этого микроорганизма связана с риском развития язвы и рака желудка. В
России ежегодно фиксируется почти сорок случаев этого тяжелого заболевания в расчете на сто тысяч человек. Раннее определение опухолевого процесса позволяет рассчитывать на благоприятный исход лечения. К
сожалению, ныне существующие методы диагностики рака желудка — не только у нас в стране, но и за рубежом — не позволяют однозначно регистрировать наличие опухолей. Предложенный российскими учеными способ позволяет создать новый диагностический инструмент, пригодный для клинического применения.
Особенность рака желудка заключается в том, что опухолевые клетки не способны к выработке соляной кислоты — таким образом, в районе локализации опухоли происходит локальное защелачивание среды.
Следовательно, желудочный сок, взятый у пациентов, способен просигнализировать о наличии злокачественного роста. Нашим ученым удалось определить гены кислотного стресса, экспрессия которых меняется в зависимости от кислотности среды почти в 2 раза (примечательно, что экспрессия этих генов зависит и от степени роста опухоли, что чрезвычайно важно для ранней диагностики болезни). Далее участки генов, ответственные за их работу (так называемые промоторы), методами генетической инженерии соединили с генами флуоресцентных белков — и получилась молекулярная конструкция, ставшая основой биосенсора.
Рекомендовано к изучению разделом по микробиологии сайта https://meduniver.com/
Однако для того, чтобы использовать микроорганизмы в качестве сигнальных устройств, надо научиться синхронизировать деятельность бактерий в культуре клеток — ведь многие из них работают по-разному.
Кроме того, требуется решить вопрос об интерпретации картины экспрессии бактериальных генов: у H.pylori, по разным оценкам, от 79 до 120 генов участвуют в ответе на закисление внешней среды.
Кардинальное решение - использовать профиль генной экспрессии одной клетки, благо современные технологии позволяют манипулировать одиночными объектами. Ученые зафиксировали одиночную клетку на твердой поверхности — теперь речь идет об оптимизации работы сконструированного микрофлюидного биосенсора.
4. Квантовое многоточие
Но рак можно выявлять, помечая непосредственно опухоль. До недавнего времени считалось, что флуоресцентные метки — органические молекулы — единственные соединения, пригодные для «обзора» клеток и тканей in vivo. Однако нанотехнологии и здесь опровергли устоявшиеся представления. Методическая база визуализации биологических объектов стала меняться с появлением на рынке высоких технологий квантовых точек.
Один из лидеров данного направления в нашей стране, профессор Владимир Александрович Олейников (Институт биоорганической химии им. М.М.
Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН) обрисовал преимущества квантовых точек перед традиционными методиками визуализации биологических объектов. Так, например, набор из нескольких полупроводниковых нанокристаллов позволяет одновременно диагностировать множество интересующих исследователей объектов.
Вопросы для самоконтроля.
1.Каковы перспективы использования нанотехнологий в медицине, физике,
химии и биологии
2.Каковы возможные опасности нанотехнологий?
Тема 10. Наноструктуры на основе органических веществ.
1.Наноструктуры на основе липидов и белков
2.Наноструктуры на основе углерода
Наноструктуры на основе липидов –
наносферы, нанокапсулы, липосомы, мицеллы
Наноструктуры на основе белков, получаемые при конъюгации белков с неорганическими нанообъектами -
Золотые наночастицы: SH-группа аминокислоты цистеина Наночастицы CdSe, CdTe, CdS и ZnS (квантовые точки):
Полигистидиновая последовательность, например, (His)6или
(His)8«bZipdomain» -лейциновая «молния» с последовательностью основных аминокислот
Наночастицы SiO2
додекапептид QBP3Leu-Pro-Asp-Trp-Trp-Pro-Pro-Pro-Gln-Leu-Tyr-His
Наночастицы Fe2O3
пептид Arg-Arg-Thr-Lys-His-His-Val-Asn
Пептидные наноструктуры Молекулярные «ЛЕГО»
гидрофильно-гидрофобные части «ПАВ» используют для получения
нанофибрилл
Применение:
Биоразлагаемый каркас для выращивания мышечной или костной ткани
Рекомендовано к изучению разделом по микробиологии сайта https://meduniver.com/
R = пептид Arg-Gly-Asp (+ Ser с фосфатной группой)
M. Zhou, A.M. Smith, A.K. Das, N.W. Hodson, R.F. Collins, R.V. Ulijn, J.E. Gough Self-assembled peptide-based hydrogelsas scaffolds for anchorage dependent cells Biomaterials, 2009, 30, 2523-2530.
Ионные самокомплементарные пептиды используют для получения бислоев
и каркасных гидрогелей
Применение:
Биоразлагаемый каркас для выращивания нейронов или хрящевой ткани
S. Zhang, “Fabrication of Novel Materials through Molecular Self-Assembly,”
Nature Biotechnology 21, 1171-1178 (2003).
Амилоидные пептиды используют для получения β-амилоидных фибрилл.
Амилоидные фибриллы обладают высокой устойчивостью к денатурирующим агентам и протеазам (ферментам, расщепляющим белки)
Применение:
Введение остатков Cys (SH-группа) для конъюгации с золотыми наночастицами с последующим серебряным усилением приводит к
образованию нанопроводов
Meital Reches and Ehud Gazit«Molecular Self-Assembly of Peptide
Nanostructures: Mechanism ofAssociation and Potential Uses» Current
Nanoscience, 2006, 2, 105-111
S-слои белков
Образованы идентичными субъединицами белков или гликопротеидовв клеточной стенке бактерий и археобактерий
Получение |
искусственных |
S-слоев |
Полезные свойства S-слоев
•Формирование методом самосборки
•Высокая стабильность белков в составе S-слоев
Например, мономеры бактериородопсина в растворе полностью денатурируют в течение суток. S-слои бактериородопсина выдерживают кратковременное кипячение (!)
•Возможность формирования некоторыми белками регулярных массивов пор в S-слоях. Диметр пор варьируется в диапазоне 2-9 нм
•Возможность химической модификации белков безразрушения S-слоя
•Широкий спектр белков, способных к образованию S-слоев
(как следствие, наличие нескольких вариантов симметрии слоя и спектра периодов двумерной решетки в диапазоне 5-20 нм)
•Возможность применения S-слоев как фоторезистов при использовании жесткого ультрафиолетового излучения
Гибридные наноструктуры на основе фуллеренов
Актуальной проблемой развития современных нанотехнологий является создание новых материалов для медицины на основе гибридных наноструктур. Значительное место среди современных наноматериалов занимают наноуглеродные структуры, в том числе фуллерены. В ИПХФ РАН
Рекомендовано к изучению разделом по микробиологии сайта https://meduniver.com/
совместно с ИНЭОС РАН активно развиваются работы по созданию водораство-римых производных фуллеренов, которые обладают высокой биосовместимостью и проявляют широкий спектр биологической активности.
Ранее была предложена оригинальная методика прямого присоединения аминокислот и пептидов по двойной связи фуллерена через аминогруппу. Оказалось, что такие производные хорошо растворимы в воде,
обладают малой токсичностью и проявляют различную биоло-гическую активность. Нами обнаружены мембранотропные, антиоксидантные и иммуномоду-лирующие свойства таких гибридных структур, их активность против СПИДа. Недавно для этих аминокислотных производных была обнаружена высокая активность против цитомегаловирусной инфекции, а
также стререоспецифичность взаимодействия аминокислотных производных с мембранами и белками.
Авторами предложен новый подход к дальнейшей модификации аминокислотных производных фуллерена. Существенно расширить возможности создания гибридных наноструктур на основе фуллеренов можно за счет присоединения к фуллереновому ядру второго адденда путем замещения атома водорода, введенного в структуру фуллерена в процессе присоединения аминокислоты.
Таким образом, открывается возможность создания широкого набора биосовместимых гибридных структур с помощью комбинации двух различных аддендов: один из них, аминокис-лота, придает фуллереновому ядру водорастворимость и мембранотропность, а второй – допол-нительные биологические свойства, в том числе антиоксидантные, способность донировать оксид азота, выступать фотосенсибилизатором или ингибировать ключевые ферменты.
Для усиления биологической эффективности производных фуллерена использованы открытия в области физиологической активности оксида азота.
Известно, что оксид азота контролирует тонус сосудов, служит модулятором окислительных реакций, процесса апоптоза и иммунных реакций. В ИПХФ РАН впервые был обнаружен хемосенсибилизирующий эффект доноров оксида азота при терапии рака, позволяющий достичь практически 100%
излечения экспериментальных животных.
Для исследования противоопухолевых эффектов производных фуллерена были синтезированы гибридные структуры на основе фуллерен-
пролина с биологически активными донорами NO, а также с антиоксидантом карнозином. Обнаружен значительный противоопухолевый эффект действия таких наноструктур. Новые гибридные наноструктуры выступали как эффек-
тивные хемосенсибилизаторы, которые вызывали излечение ~ 70 %
животных с лейкемией Р388 при введении данных соединений в комбинации с клиническими цитостатиком циклофосфамидом. Аналогичные гибридные молекулы выступают в качестве выраженных инги-биторов процесса метастазирования при введении в комбинации с цитостатиками. При этом терапевтическая доза цитостатиков снижается в 10 раз, что обеспечивает уменьшение их токсич-ности и предотвращает развитие резистентности.
Значительный интерес представляет введение в гибридную структуру малеимидной группировки, которая позволяет присоединять фуллерены и эндометаллофуллерены к белкам и пептидам через SH-группы цистеиновых остатков или аминогруппы других аминокислотных остатков. Используя эту
Рекомендовано к изучению разделом по микробиологии сайта https://meduniver.com/