6 курс / Медицинская реабилитация, ЛФК, Спортивная медицина / Эффекты_трансплантации_мононуклеарных_клеток_пуповинной_крови_человека

51

Временное окно для терапевтического воздействия, нацеленного на восстановление и регуляцию синаптических функций, больше, чем при подходах,

нацеленных на очистку от токсинов. Следовательно, такие вмешательства могут применяться на относительно поздних стадиях заболевания. Терапевтическое вмешательство на уровне синаптической структуры и функции может быть полезным при множестве неврологических заболеваний независимо от типа токсического воздействия [Lu et al., 2013].

Синапсы регулируются на уровне синаптической передачи, синаптической пластичности и синаптического роста. Соответственно, терапия, направленная на синаптическую дисфункцию, может включать три различных подхода.

Первое - это усиление синаптической передачи. Один из способов -

увеличить концентрацию нейротрансмиттеров в синаптической щели, увеличив высвобождение или блокировав деградацию и/или повторное поглощение медиатора. Например, донепезил, ингибитор ацетилхолинэстеразы, который блокирует метаболизм ацетилхолина, усиливает передачу в холинергических синапсах. Этот препарат применяется для лечения когнитивных симптомов у пациентов с болезнью Альцгеймера от легкой до умеренной степени [Rodda et al., 2009]. Однако усиление синаптической функции в данном случае является временным событием, и после прекращения лечения синаптический дефицит возвращается. Кроме того, эти препараты не могут остановить или замедлить прогрессирование заболевания, и поэтому относятся к категории

«симптоматического», а не «модифицирующего болезнь» лечения.

Второй вариант модуляции синаптической функции - усиление синаптической пластичности. Синаптическая пластичность - это изменение синаптической силы в ответ на кратковременное повышение активности нейронов.

Многочисленные исследования за последние десятилетия показали, что синаптическая пластичность опосредует различные функции мозга - от памяти и эмоций до тонкой моторики и исполнительных функций. Считается, что долгосрочная потенциация (LTP), наиболее широко изученная форма синаптической пластичности, является клеточным механизмом, лежащим в основе

t.me/medicina_free

52

памяти. Сообщается о наличии дефицитов LTP у трансгенных животных с различными моделями болезни Альцгеймера [Marchetti et al., 2011].

Восстановление LTP в моделях на животных часто считается важным критерием при выборе лекарств-кандидатов для лечения нейродегенеративных заболеваний.

Синаптическая пластичность зависит от активности. Эта особенность делает синаптическую пластичность привлекательной терапевтической мишенью благодаря возможности предпочтительно изменять синапсы, которые активно участвуют в функциях мозга, например, эпизодической памяти [Lu et al., 2013].

Третий аспект модуляции функции синапсов - стимуляция синаптического роста (или синаптогенеза). Синаптический рост - это очень динамичный процесс,

который сохраняется на протяжении всей взрослой жизни. В отличие от потери нейронов, которая необратима, синапсы могут быть восстановлены путем роста новых терминалей и/или дендритных шипиков. Кроме того, вырождающиеся синапсы могут быть «стабилизированы» за счет усиления существующих пре- и

постсинаптических структур и повышения уровня синаптических белков.

Уникальной особенностью агентов, способствующих синаптогенезу, таких как нейротрофические факторы, является то, что они могут вызывать длительные эффекты даже после отмены [Lu et al., 2013].

Таким образом, терапевтический агент должен вызывать длительные функциональные (долговременная потенциация) и/или структурные изменения

(синаптогенез) синапсов, чтобы замедлять, останавливать или обратить вспять прогрессирование заболевания. В этом отношении перспективным является использование генно-клеточных технологий, позволяющих доставлять ростовые и нейротрофические факторы в ЦНС.

1.6. Генно-клеточная терапия болезни Альцгеймера

Важным направлением генной и клеточной терапии в регенеративной медицине является увеличение уровня экспрессии генов, кодирующих трофические факторы, факторы роста и молекулы адгезии, поддерживающие

t.me/medicina_free

53

выживание паренхиматозных клеток поражённого органа и стимулирующих его регенерацию. Трансплантация генетически модифицированных клеток,

экспрессирующих рекомбинантные гены, обоснована возможностью продолжительной секреции терапевтических молекул. В качестве клеточных носителей терапевтических генов нами использованы мононуклеарные клетки пуповинной крови (МКПК) человека. Преимуществами данных клеток являются:

доступность, низкая иммуногенность, отсутствие законодательных и этических норм для их применения. Аденовирусный вектор, использованный для трансфекции стволовых клеток, безопасен по репликативным, инфекционным,

иммуногенным и онкогенным свойствам [Исламов с соавт., 2008].

1.6.1. Мононуклеарные клетки пуповинной крови человека

После первого клинического применения пуповинная кровь стала альтернативой костному мозгу и мобилизированной периферической крови в качестве источника гемопоэтических стволовых клеток. Проведено более 1000

трансплантаций пуповинной крови пациентам с различными заболеваниями,

включая злокачественные опухоли, анемии, гемоглобинопатии и врождённые нарушения метаболизма [Gluckman, 2000].

В пуповинной крови к настоящему времени описано несколько типов стволовых и прогениторных клеток: стволовая кроветворная клетка, стволовая мезенхимная клетка, прогениторная эндотелиальная клетка, SP-клетка (от side population), способная к дифференцировке в миогенном и кроветворном направлениях, а также клетки, экспрессирующие специфические CD-маркёры,

дающие начало разным клеточным типам [Nakahata et al., 1982].

МКПК можно безопасно криоконсервировать и сохранять жизнеспособность в течение многих лет. МКПК сохраняют иммунологически незрелый фенотип [van de Ven et al., 2007]. Также сообщается, что прогениторные клетки пуповинной крови содержат в 4 раза больше CD34+ клеток и обладают до восьмикратной пролиферативной способностью по сравнению с аналогичными клетками в

t.me/medicina_free

54

костном мозге [Broxmeyer et al., 1995]. Кроме того, эти клетки образуют более крупные колонии, обладают более высокими скоростями клеточного цикла и имеют довольно большую длину теломер, что подтверждает их незрелый статус.

Благодаря большей доступности, слабой иммуногенности и уменьшенной вероятности арбитражной передачи вируса, МКПК могут представлять лучшую альтернативу для клеточной терапии [Lewis, 2002].

МКПК показали терапевтический потенциал на животных моделях болезни Альцгеймера, рассеянного склероза, бокового амиотрофического склероза,

возрастной макулярной дегенерации, болезни Паркинсона, черепно-мозговых травм, травмах спинного мозга и инсульта [Chen et al., 2001; Darlington et al., 2013; El-Badri et al., 2006; Garbuzova-Davis et al., 2003; Lu et al., 2002; Nikolic et al., 2008].

Показано, что введённые внутривенно клетки пуповинной крови мигрировали преимущественно в места дегенерации нервной ткани, хотя также были обнаружены и в других органах [Garbuzova-Davis et al., 2003]. Кроме того,

установлено, что трансплантированные клетки пуповинной крови человека экспрессировали нейрональные маркёры, такие как нестин, нейрональная форма β тубулина (TuJ1), глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP). При моделировании инсульта у крыс трансплантация клеток пуповинной крови уменьшала клинические проявления ишемии мозга [Chen et al., 2001].

Одной из основных проблем применения мононуклеарных клеток пуповинной крови человека (МКПК) является их недостаточно высокая терапевтическая эффективность для лечения тяжелых дегенеративных заболеваний. Генетическая модификация МКПК позволяет усилить экспрессию биологически активных терапевтических факторов, а также модулировать дифференцировку клеток в различных направлениях.

1.6.2. GDNF и его аналоги

Семейство нейротрофических факторов GDNF (Glial cell Derived Neurotrophic Factor) в настоящее время состоит из четырех членов: нейротурин

t.me/medicina_free

55

(NRTN), нейротрофический фактор, полученный из глиальной клеточной линии

(GDNF), персефин и артемин. Все эти белки являются мощными факторами выживания для нескольких популяций центральных и периферических нейронов.

Рецепторы для этих факторов представляют собой комплексы, которые включают рецептор Ret-тирозинкиназы и GPI-связанный лиганд-связывающий компонент,

называемый рецептором семейства GDNF альфа 1-4 (GFRalpha1-4) [Golden et al., 1999].

GDNF экспрессируется в различных типах клеток и в различных структурах нервной системы. У человека транскрипция GDNF была выявлена в полосатом теле, в каудальных и нижних областях коры. Обнаруживаемые количества были также отмечены в гиппокампе, коре и спинном мозге, но не в мозжечке [Springer et al., 1994].

GDNF обладает выраженным нейропротекторным действием в отношении дофаминэргических нейронов и мотонейронов спинного мозга [Iannotti et al., 2004],

и является мощным трофическим фактором для норадренергических нейронов и клеток Пуркинье. Подсадка фибробластов, эктопически экспрессирующих GDNF,

предотвращает индуцированную 6-гидроксидопамином дегенерацию и улучшает фенотип взрослых норадренергических нейронов in vivo [Arenas et al., 1995].

Уровень мРНК GDNF быстро возрастает при повреждении нервной системы [Hoke et al., 2000].

Терапевтический потенциал GDNF при лечении болезни Альцгеймера в настоящее время полностью не раскрыт.

1.6.3. Векторы на основе аденовируса

Аденовирусы — это вирусы среднего размера (90–100 нм), лишенные липопротеиновой оболочки и имеющие икосаэдрическую форму. Состоят из нуклеокапсида и двухцепочечной линейной геномной ДНК. Впервые выделены из аденоидов человека (миндалины), благодаря чему и получили свое название

[Филдс с соавт., 1989].

t.me/medicina_free

56

Аденовирусы обладают несколькими особенностями, благодаря которым они широко используются в генной терапии. Во-первых, они встречаются повсеместно:

аденовирусы выделены из большого количества различных видов и насчитывают более 100 различных серотипов из которых около 43 у людей. Во-вторых, векторы на основе аденовирусов быстро заражают широкий спектр клеток человека и, как правило, дают высокий уровень переноса генов. В-третьих, векторы на основе аденовирусов имеют низкую патогенность у людей: они вызывают лишь несколько слабых симптомов, связанных с респираторными заболеваниями. В-четвертых,

аденовирусные векторы могут переносить относительно большие сегменты ДНК

(до 7,5 т.п.н.), и трансдуцировать данные трансгены в непролифирирующие клетки.

В-пятых, вирусный геном не подвергается перестройке с высокой скоростью, и

вставленные чужеродные гены, как правило, сохраняются без изменений путем проведения последовательных раундов репликации вируса [Филдс с соавт., 1989].

Аденовирусные векторы позволяют осуществить передачу своих генов в ядро хозяина, но не производят их инсерцию в хромосому хозяина. Таким образом,

имеется низкая вероятность нарушения жизненно важных клеточных генов или процессов. В доклинических испытаниях было показано, что аденовирусная векторная ДНК экспрессируется в печени, скелетной мышце, сердце, мозге, легких,

поджелудочной железе и опухолевой ткани [Bramson et al., 1995]. При введении аденовирусных векторов внутривенно, большинство вирусов накапливается в печени. Даже с репликационно-компетентными аденовирусными векторами,

которые дольше сохраняются в контрольной ткани и печени, ни у одного потомка не наблюдалось трансмиссии в зародышевую линию [Paielli et al., 2000].

t.me/medicina_free

57

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Создание генно-клеточных конструкций

Генно-клеточные конструкции были приготовлены сотрудниками НИЛ

OpenLab Генные и клеточные технологии – к.н. Гараниной Екатериной Евгеньевной и к.н. Салафутдиновым Ильнуром Ильдусовичем. Заготовку пуповинной крови человека проводили после получения информированного согласия у беременной и дородового скрининга на наличие противопоказаний к донорству пуповинных клеток. Кровь собирали в пластиковые контейнеры CPDA-

1 250 GG (Terumo). Мононуклеарную фракцию выделяли путем центрифугирования в градиенте плотности фиколла. Мононуклеарные клетки пуповинной крови (МКПК) ресуспензировали в среде DMEM с добавлением сыворотки крови плодов коровы (10%), L-глутамина (2 мМ) и смеси антибиотиков

(пенициллин и стрептомицин - 1%) и трансдуцировали рекомбинантными аденовирусами, экспрессирующими ген EGFP или GDNF (10 бляшко-образующих единиц на клетку). После этого клетки культивировали 14-16 часов во влажной атмосфере при 37 °С с поддержанием 5% уровня СО2. Перед трансплантацией МКПК осаждали центрифугированием и разводили в стерильном физиологическом растворе до концентрации 2x10^6 клеток/100 мкл. Часть генно-клеточных конструкций оставили культивироваться на 3 суток для оценки эффективности трансдукции аденовирусными векторами. Методом вестерн-блот детектировали в клеточных линиях МКПК-ad5-EGFP и МКПК-ad5-GDNF экспрессию соответствующих белков. Обе генно-клеточные конструкции экспрессировали кодируемые аденовирусным вектором белки. В интактных клетках экспрессии

GDNF выявлено не было (Рис. 1).

t.me/medicina_free

58

Рис. 1. Вестерн-блот анализ эффективности трансдукции мононуклеарных клеток пуповинной крови человека. А – экспрессия зеленого флуоресцирующего белка (EGFP) мононуклеарными клетками пуповинной крови, трансдуцированными аденовирусным вектором, кодирующим EGFP (3 дня после трансдукции). Б – экспрессия глиального нейротрофического фактора (GDNF) мононуклеарными клетками пуповинной крови (МКПК), трансдуцированными аденовирусным вектором, кодирующим GDNF (3 дня после трансдукции) и интактными МКПК.

2.2 Объект исследования

Мыши с генетической моделью болезни Альцгеймера, экспрессирующие мутантные человеческие гены белка предшественника амилоида и пресенилина 1 (APP/PS1 мыши) были закуплены в Jackson Laboratory (США) и содержатся в питомнике лабораторных животных «Пущино» (Московская область). К началу эксперимента мышей доставили в КГМУ. Животные содержались в стандартных условиях вивария в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и научных целей (при естественном освещении и температуре окружающего воздуха 22±2°С, с постоянным доступом к комбинированному корму и воде). Работа проведена в соответствии с требованиями приказа Министерства здравоохранения Российской Федерации от 23 августа 2010 г. № 708н «Об утверждении Правил лабораторной практики» была одобрена локальным

t.me/medicina_free

59

этическим комитетом Казанского государственного медицинского университета (выписка из протокола заседания №10 от 20 декабря 2016 года). Были сформированы следующие экспериментальные группы: 1) «WT» - мыши дикого типа (n=18); 2) «Alz» - APP/PS1 мыши (n=13); 3) «Alz-EGFP» - APP/PS1 мыши после трансплантации МКПК, экспрессирующих репортерный белок EGFP (n=12); 4) «Alz-GDNF» - APP/PS1 мыши после трансплантации МКПК, экспрессирующих

GDNF (n=12). Ксенотрансплантация генно-клеточных конструкций экспериментальным животным осуществлялась однократно в количестве 2 млн. клеток в 100 мкл физиологического раствора путем инъекции в ретроорбитальный венозный синус. В работе использовались мыши обоего пола в возрасте 8-12

месяцев.

2.3 Электрофизиологическая регистрация

Анестезированных хлоралгидратом (0.53 мг/кг) мышей декапитировали, головной мозг извлекали и помещали в ледяной раствор ACSF. Фронтальные срезы мозга мышей толщиной 350 мкм были изготовлены на моторизованном виброслайсере NVSLM (World Precision Instruments, США) в ледяном растворе ACSF с повышенным содержанием магния (в мМ): NaCl 126, KCl 3.5, NaH2PO4 1.2, глюкоза 10, NaHCO3 25, MgCl2 10, CaCl2 0.5 (pH 7.3-7.4 при постоянной оксигенации карбогеном; 290-300 mOsm). До начала эксперимента срезы в течение часа инкубировали в ACSF: NaCl 126, KCl 3.5, NaH2PO4 1.2, глюкоза 10, NaHCO3 25, MgCl2 1,3, CaCl2 2 при комнатной температуре.

Срезы визуализировали при помощи микроскопа Olympus BX51WI,

оборудованного водно-иммерсионными объективами x10 и x60 и видеокамерой. Регистрацию проводили при температуре 30-31°C. Перед началом эксперимента срезы оставляли в ванночке на 30 мин для температурной адаптации. Локальные полевые потенциалы (ЛПП) регистрировали при помощи пэтч-кламп усилителя

EPC-10 (HEKA Elektronik, Germany) в слое Stratum radiatum CA1 области гиппокампа с использованием стеклянных микропипеток с сопротивлением 1-2

t.me/medicina_free

60

МОм, заполненных внеклеточным раствором. ЛПП получали путем стимуляции коллатералей Шаффера внеклеточным биполярным электродом; стимулятор - DS3

Constant Current Isolated Stimulator, Digitimer, England. Интенсивность стимуляции устанавливали на уровне 2 пороговых значений (обычно - 12-20 мкА при длительности 200 мкс). Пороговым значением считали силу, при которой возникал минимальный полевой ответ (0.2-0.5 мВ).

Электрофизиологические данные анализировали с использованием пакета программ Igor Pro 6.02 (WaveMetrics, USA). Статистическую обработку данных и построение графиков проводили в программе OriginPro 2015. Результаты представили как среднее значение ± стандартная ошибка среднего. Статическую значимость отличий оценивали с использованием U-критерия Манна-Уитни и дисперсионного анализа ANOVA с поправкой Бонферрони. Отличия считали статистически значимыми при p<0.05.

2.4 Окрашивание срезов тиофлавином S

После электрофизиологической регистрации срезы мозга были проверены на предмет наличия амилоидных бляшек путем окрашивания тиофлавином S. Срезы помещали на 30 минут в 4% раствор формалина, далее промывали в дистиллированной воде. После этого на срезы наносили 100 μл 1% раствора тиофлавина S, разведенного на 50% растворе этанола. Далее срезы дважды промывали в 70% растворе этанола и заключали в глицерин. Визуализировали при помощи флуоресцентного микроскопа Olympus BX51WI и осветителя Thorlabs (LED4D067) со светодиодом 365 нм.

2.5 Вестерн-блот

Анестезированных хлоралгидратом (0.53 мг/кг) мышей декапитировали,

после чего извлекали головной мозг. Из одного полушария конечного мозга выделяли гиппокамп, замораживали в жидком азоте и переносили в морозильную

t.me/medicina_free