6 курс / Медицинская реабилитация, ЛФК, Спортивная медицина / Эффекты_трансплантации_мононуклеарных_клеток_пуповинной_крови_человека

11

Степень достоверности и апробация работы

Методы и подходы полностью соответствуют заявленной цели и задачам.

Применены современные исследовательские подходы, включая использование модифицированных клеток пуповинной крови, трансгенных мышей с моделью болезни Альцгеймера (мутации в генах пресенилина и предшественника бета-

амилоида), а также методов: иммуногистохимия, иммуно-блот,

электрофизиология. Статистический анализ результатов проводился с помощью пакета прикладных программ Origin 8.0 с использованием теста Манна-Уитни и дисперсионного анализа ANOVA с поправкой Бонферрони для количественных шкал. Отличия считались статистически значимыми при p<0.05. Результаты исследования были доложены на следующих конференциях: 88-я Всероссийская научно-практическая конференция студентов и молодых ученых (Казань, 26-27

марта 2014); 91-я Всероссийская научно-практическая конференция студентов и молодых ученых (Казань, 11-13 апреля 2017); XXIII съезд Физиологического общества имени И.П. Павлова (Воронеж, 18-22 сентября 2017); 92-я Всероссийская научно-практическая конференция студентов и молодых ученых (Казань, 4-6

апреля 2018); Международная научная конференция – школа молодых ученых

«Заболевания мозга: вызов XXI века» (Казань, 16-17 мая 2018); Всероссийская конференция с международным участием «Актуальные проблемы клеточной биологии и клеточных технологий» (Санкт-Петербург, 8-11 октября 2019); 94-я

Международная научно-практическая конференция молодых ученых (Казань, 25

ноября 2020); III Всероссийская научно-практическая конференция «Физиология человека» (Чебоксары, 27 ноября 2020).

Личный вклад автора

Планирование и проведение экспериментов, анализ данных, подготовка публикаций и написание статей осуществлялись при личном участии автора.

t.me/medicina_free

12

Публикации

По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ, из них 5 статей в рецензируемых изданиях.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 116 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания методов и результатов исследования,

заключения, выводов, рекомендаций, списка литературы, включающего 230

наименований. Работа проиллюстрирована 24 рисунками.

t.me/medicina_free

13

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 История болезни Альцгеймера

Альцгеймер пришел к выводу, что у Огюст нет чувства времени или места.

Она едва могла вспомнить подробности своей жизни, ее речь была непоследовательной, при опросе она часто давала ответы, которые не имели ничего общего с вопросом. Ее настроение быстро менялось между тревогой, недоверием,

абстиненцией и плаксивостью. Однако Огюст осознавала свою беспомощность и часто повторяла: «Я, так сказать, потеряла себя». Альцгеймер назвал это состояние

«Болезнью Забвения» [Maurer et al., 1997]. Впоследствии, по предложению Эмиля Крепелина, заболевание стало известно, как болезнь Альцгеймера [Kraepelin, 1913].

В 1906 году в возрасте 55 лет Огюст Детер умерла от сепсиса вследствие инфицирования пролежней [Maurer et al., 1997].

t.me/medicina_free

14

В 1907 году Алоис Альцгеймер по результатам вскрытия Огюст Детер опубликовал сообщение «О

необычной болезни коры головного мозга» в центральном журнале неврологии и психиатрии [Alzheimer, 1907].

Альцгеймер отметил наличие двух отличительных гистопатологических признаков в головном мозге Детер:

нейрофибриллярных клубков и нейритных бляшек.

Нейрофибриллярные клубки, как он правильно предположил, были аномальными внутриклеточными агрегатами (позднее было установлено, что это агрегаты гиперфосфорилированного тау-белка). Нейритные бляшки (которые он назвал милиарными очагами) представляли собой

дистрофические нейрональные отростки, окружающие «особое вещество в коре»

[Alzheimer, 1907; Alzheimer et al., 1995]. Это «особое вещество» было выделено и очищено в 1984 году Гленнером и Вонгом [Glenner et al., 1984]. Они показали, что вещество представляет собой пептиды, имеющие массу 4.2 кДа, состоящие в основном из 40 или 42 аминокислот, которые, по их предположению, были отщеплены от более крупного предшественника. Их прогноз был подтвержден в короткие сроки: в 1987 году был клонирован предшественник β-амилоида [Kang et al., 1987], а сам пептид стал известен как β-амилоид.

Болезнь Альцгеймера в настоящее время признана распространенной формой деменции у пожилых людей, имеющей описанные Алоисом Альцгеймером характерные гистопатологические признаки.

1.2 Болезнь Альцгеймера. Современные представления

На 2021 год по данным Всемирной организации здравоохранения в мире насчитывается около 50 миллионов человек, страдающих от деменции. Деменция -

это синдром, при котором происходит ухудшение памяти, мышления, поведения и

t.me/medicina_free

15

способности выполнять повседневные действия. Деменция является одной из основных причин инвалидности и беспомощности пожилых людей во всем мире.

Болезнь Альцгеймера является наиболее распространенной формой деменции и составляет 60–70% случаев. Другие основные формы - это сосудистая деменция, деменция с тельцами Леви и группа заболеваний, способствующих лобно-височной деменции. Границы между различными формами деменции нечеткие, и часто представлены смешанные типы. Смешанная патология особенно широко распространена среди пожилых людей. Даже в случаях с семейной формой БА деменция с тельцами Леви часто является сопутствующей. Хотя слабоумие поражает в основном пожилых людей, оно не является нормальной частью старения [World Health Organization, 2021].

1.2.1 Течение болезни

Обычно выделяют от трех до семи стадий развития болезни Альцгеймера. На самой ранней стадии заболевание проявляется умеренными когнитивными нарушениями: возникают трудности при запоминании новой информации; может отмечаться апатия; незначительно нарушаются семантическая память, абстрактное мышление, способность сосредотачиваться на конкретной задаче, навыки планирования. По мере прогрессирования заболевания когнитивные нарушения становятся все более глубокими и начинают препятствовать нормальной повседневной жизни. Появляются изменения в поведении (эмоциональная лабильность, раздражительность, апатия), снижается физическая активность,

нарушается долговременная память, возникают галлюцинации и судороги,

утрачиваются речевые навыки. Пациенты теряют самостоятельность и становятся все более зависимыми от ухода [Craig et al., 2005]. Смерть в среднем наступает через 8,5 лет с момента установления диагноза обычно вследствие сторонних факторов, таких как пневмония, пролежневая язва, сердечно-сосудистые заболевания и др. [Gambassi et al., 1999; Wada et al., 2001].

t.me/medicina_free

16

1.2.2 Этиология

Подавляющее большинство случаев БА возникает спорадически.

Мутации в трех генах - белке-предшественнике амилоида (APP),

пресенилине 1 (PSEN1) и пресенилине 2 (PSEN2) - вызывают редкую (<0,5%)

семейную форму БА. Семейная форма БА характеризуется ранним развитием симптомов: обычно в возрасте от 30 до 50 лет [Bateman et al., 2011].

Мутации в гене тау приводят к таупатии и различным нейродегенеративным заболеваниям в спектре лобно-височной деменции, но в отличие от мутаций в генах

β-амилоида, сами по себе не вызывают развитие БА [Lane et al., 2018].

Спорадические формы БА, вероятно, обусловлены сложным взаимодействием между генетическими факторами и факторами окружающей среды. Считается, что около 70% риска БА связано с генетическими факторами.

Ген APOE, который имеет три варианта, E2, E3 и E4, является важнейшим фактором риска развития спорадической формы БА: по сравнению с носителями не-E4 гетерозиготы E4 имеют отношение шансов развития БА около 3-х,

гомозиготы - до 12 [Verghese et al., 2011].

Исследования геномной ассоциации выявили ряд генетических факторов риска, которые вовлечены в сигнальные пути воспалительных реакций,

холестеринового обмена, рециркуляции эндосом и др. - рис. 3 [Karch et al., 2015].

Каждый из этих генов имеет относительно высокую распространенность и в отдельности придает лишь очень небольшое повышение риска, но при объединении в полигенный риск шансы развития БА увеличиваются [Escott-Price et al., 2015].

К модифицируемым факторам риска развития болезни Альцгеймера относят сахарный диабет (относительный риск, ОР: 1,46; 95% ДИ: 1,20–1,77), гипертензию среднего возраста (ОР: 1,61; 95% ДИ: 1,16–2,24), ожирение среднего возраста (ОР: 1,60; 95% ДИ: 1,34–1,92), отсутствие физической активности (ОР: 1,82; 95% ДИ:

1,19–2,78), депрессию (ОР: 1,65; 95% ДИ: 1,42–1,92), курение (ОР: 1,59; 95% ДИ:

1,15–2,20) и низкий уровень образования (ОР: 1,59; 95% ДИ: 1,35–1,86) [Norton et

t.me/medicina_free

17

al., 2014]. Большинство этих факторов риска связаны с атеросклеротическими цереброваскулярными заболеваниями. Однако насколько модуляция каждого отдельного фактора риска способна приводить к снижению тяжести прогрессирования или возраста начала болезни Альцгеймера, остается неопределенным. Комплексное вмешательство в образ жизни, включающее диету,

физические упражнения, когнитивные тренировки и снижение риска сосудистых заболеваний, показало пользу в определенных показателях когнитивных функций,

но напрямую не решило вопрос о том, можно ли таким путем изменить течение или предотвратить развитие болезни Альцгеймера [Ngandu et al., 2015; Norton, et al., 2014].

Рисунок 3. Редкие и распространенные генетические факторы риска развития болезни Альцгеймера. Результаты общегеномных исследований (англ. GWAS, genome-wide associated studies) [Karch et al., 2015].

t.me/medicina_free

18

1.2.3 Патофизиология болезни Альцгеймера

Основными гистопатологическими признаками болезни Альцгеймера являются амилоидные бляшки и нейрофибриллярные клубки (НФК). Помимо этого, отмечаются нейропильные нити, дистрофические нейриты, астроглиоз,

активация микроглии, а также церебральная амилоидная ангиопатия.

Последствиями этих патологических процессов являются нейродегенерация с потерей синапсов и нейронов и последующая макроскопическая атрофия [Lane et al., 2018].

1.2.3.1 Амилоидная патология при болезни Альцгеймера.

Амилоидная теория патогенеза БА, предполагает, что накопление патологических форм бета-амилоида, продуцируемых последовательным расщеплением белка-предшественника амилоида (БПА) ферментами β- и γ-

секретазами в мозге, является первичным патологическим процессом,

обусловленным дисбалансом между производством и выведением Аβ.

Предполагается, что образование НФК и последующая нейронная дисфункция и нейродегенерация, возможно, опосредованная воспалением, возникают вследствие накопления Аβ, хотя прямых доказательств такой связи нет [Hardy et al., 2002]. В

пользу центральной роли Аβ в патогенезе БА свидетельствуют генетические данные: все мутации, связанные с семейной формой БА, участвуют либо в генерации, либо в процессинге Аβ и приводят к перепроизводству токсических форм Аβ. И наоборот, миссенс-мутация БПА (A673T), соседствующая с сайтом действия бета-секретазы, снижает клинический риск развития БА у людей. Эта мутация приводит к снижению образования бета-амилоида приблизительно на 40%

в условиях in vitro [Jonsson et al., 2012]. При спорадической форме болезни ApoE,

как и многие другие гены риска, участвует в выведении амилоида из мозга.

Однако для диагностики БА необходимо подтверждение наличия как Aβ, так и таупатии, поскольку значительная доля пожилых людей на момент смерти имеет

t.me/medicina_free

19

массивные отложения β-амилоида без сопутствующих симптомов, т.е. образование и накопление амилоидных агрегатов может происходить в бессимптомных и продромальных условиях. У субъектов, которые несут аутосомно-доминантную мутацию, увеличивающую риск болезни Альцгеймера, отложение бета-амилоида в мозге и изменение его уровня в спинномозговой жидкости могут происходить за

15-25 лет до того, как клинические симптомы становятся очевидными [Reiman et al., 2012]. Бета-амилоидная патология достигает плато на ранней симптомной стадии заболевания, тогда как формирование НФК, синаптическая потеря и глиоз развиваются на всем протяжении заболевания [Ingelsson et al., 2004].

1.2.3.1.1 Белок-предшественник амилоида. От нормы к патологии.

Предшественник бета-амилоида (англ. Amyloid precursor protein, APP) – это трансмембранный гликопротеин типа 1. Он состоит из большого внеклеточного домена, одного трансмембранного сегмента и короткого цитоплазматического хвоста. Человеческий APP принадлежит к семейству белков – предшественников амилоида, включающему также подобные предшественнику амилоиду белки 1 и 2

(APLP1 and APLP2 - amyloid precursor-like protein 1 and 2). Эти три гомологичных белка имеют общие консервативные аминокислотные последовательности и белковые субдомены (рис. 4). Консервативность строения белков особенно выражена во внеклеточных и цитоплазматических областях и распространяется на их физиологические функции [Wasco et al., 1992].

Белки семейства APP присутствуют у множества видов, в том числе найдены у беспозвоночных животных, включая C. elegans (APP-like 1, APL-1) и D. melanogaster (APP-like, APPL). Эволюционное появление белков APP совпадает с эволюцией самых ранних нервных систем с функционирующими синапсами

[Shariati et al., 2013], а также с появлением рецепторов липопротеинов [Dieckmann et al., 2010].

Как C-, так и N-концевые домены белков семейства APP участвуют во многих клеточных процессах. Короткий неструктурированный C-концевой домен является

t.me/medicina_free

20

консервативным среди APP, APLP1 и APLP2 и служит сайтом для многочисленных функциональных белковых взаимодействий. N-конец имеет больше вариаций между членами семейства APP и сплайсинговыми изоформами APP. N-конец

APLP2 и APP770 (оба экспрессируются во многих органах и тканях) содержат два домена димеризации (E1 и E2), кислотный домен (Ac), область ингибитора протеазы Кунитца (KPI) и домен OX-2, тогда как APP695 и APLP1,

экспрессируемые преимущественно в головном мозге, лишены доменов KPI и OX-

2 (рис. 4) [van der Kant et al., 2015].

Мыши с нокаутом одного из трех генов семейства белков APP, а также с двойным нокаутом генов APP-/- и APLP1-/- остаются жизнеспособными и фертильными. Мыши со следующими вариантами нокаута генов летальны на раннем постнатальном периоде: APLP2-/-APP-/-, APLP2-/-APLP1-/-, APLP1-/-APP-/-

APLP2-/+. Эти данные свидетельствуют о функциональной избыточности среди данных белков [Heber et al., 2000].

В 2016 году Клейн с соавторами описали случай гомозиготной нонсенс-

мутации в гене APP у человека. Пациенту на момент обследования было 20

месяцев. Отсутствие у него экспрессии белка-предшественника амилоида привело к снижению роста тела, микроцефалии, гипотонии, задержке развития, истончению мозолистого тела, судорогам. Схожими фенотипическими характеристиками обладают и мыши с нокаутом гена APP или со сниженной экспрессией белка-

предшественника амилоида [Klein et al., 2016].

APP является единственным членом семейства, несущим пептидный домен

Aβ. Ген APP млекопитающих содержит 18 экзонов и претерпевает несколько событий альтернативного сплайсинга. APP695, основная изоформа мозга,

исключает экзон 7 (домен KPI) и 8 (домен гомологии OX-2) (рис. 4).

APP695 является преобладающей формой, экспрессируемой в нейронах, а

изоформы АРР770 (полноразмерная форма) и АРР751 (без экзона 8)

экспрессируются преимущественно в глиальных клетках [Matsui et al., 2007].

Сплайсинговые изоформы АРР, за исключением APP695, экспрессируются также во многих других тканях, таких как тимус, сердце, мышцы, легкие, почки, жировая

t.me/medicina_free