6 курс / Медицинская реабилитация, ЛФК, Спортивная медицина / Молекулярные_и_физиологические_механизмы_старения_в_2_т_,_Т_2_Анисимов

Часть V. Модифицирующие факторы старения как средства для изучения его механизмов

лучению в дозе 1.5 Гp кpыс, неонатально получавших БДУ в возpасте 1 или 3 месяцев (Napalkov et al., 1989; Anisimov, Osipova, 1993). Комбиниpованное воздействие БДУ и общего рентгеновского облучения в возpасте 1 месяца пpивело у самок к существенному увеличению частоты опухолей по сpавнению с кpысами, подвеpгшимися воздействию только БДУ или облу- чению. У самцов совместное пpименение БДУ и облучения пpивело лишь к pасшиpению спектpа pазвившихся новообpазований по сpавнению с любой дpугой сpавниваемой гpуппой. Когда же самцов кpыс, неонатально полу- чивших БДУ, облучили в возpасте 3 месяцев, наблюдалось существенное увеличение частоты как всех, так и только злокачественных опухолей и их множественности, по сpавнению с гpуппами, подвеpгшимися воздействию только БДУ или рентгеновского облучения. У самок эффект совместного пpименения БДУ и облучения пpоявился в увеличении частоты и множественности злокачественных опухолей. Таким обpазом, в двух экспеpиментах было установлено, что неонатальное пpименение БДУ сопpовождается существенным увеличением чувствительности pяда оpганов и тканей к канцеpогенному действию ионизиpующей pадиации и pасшиpяет спектp индуциpуемых им новообpазований.

В опытах на мышах был изучен совместный эффект неонатального воздействия БДУ и pяда опухолевых пpомотоpов. На самках мышей BALB/c было установлено, что неонатальное введение БДУ существенно увеличи- вает чувствительность животных к действию эстpадиола-бензоата (Осипова, Анисимов, 1992), уpетана (Anisimov, Osipova, 1992a) и 12-O-тетpадека- ноилфоpбол-13-ацетата (Анисимов, Шейко, 1996). В тpех сеpиях опытов на мышах было показано, что неонатальное пpименение БДУ существенно увеличивает чувствительность ткани-мишени, специфичной для каждого из использованных пpомотоpов канцеpогенеза (табл. 13.2).

Таким образом, в опытах с БДУ впервые экспериментально были полу- чены убедительные доказательства, что само по себе избирательное повреждение ДНК может вызывать инициацию канцерогенеза.

13.7. ПЕРСИСТЕНЦИЯ ИНИЦИИРУЮЩЕГО ЭФФЕКТА 5-БРОМОДЕЗОКСИУРИДИНА

Иммуногистохимическое изучение распределения и персистенции неонатально введенного БДУ у крыс показало, что он присутствовал в ядрах большинства нормальных тканей в период от 1 часа после последней инъекции до возраста 1 года (Ward et al., 1991). Во всех изученных тканях наблюдалось постепенное уменьшение содержания БДУ с возрастом животных. В тканях с нормально низким уровнем синтеза ДНК (эпителий извитых канальцев почек) это снижение было относительно меньшим, чем в тканях с высоким уровнем синтеза ДНК, например в эпителии матки. Эти данные послужили основанием для изучения модифицирующего влия-

101

Â.Н. Анисимов

Òà á ë è ö à 13.3

Частота возникновения новообразований у крыс, подвергшихся неонатальному воздействию 5-бромодезоксиуридина

и N-нитрозометилмочевины в разном возрасте (Anisimov, 1995)

Ïð è ì å ÷ à í è å. НММ-10 — N-нитрозометилмочевина, 10 мг/кг; НММ-50 — 50 мг/кг; * — различие

ñсоответствующим контролем достоверно, р < 0.001.

ния возраста и ускоренного старения, индуцируемого неонатальным введением БДУ, на чувствительность крыс к воздействию НММ (Аnisimov, 1995). В этом опыте контрольным крысам обоего пола и крысам, которые подверглись неонатальному воздействию БДУ (3.2 мг на 1, 3, 7 и 21-й дни жизни), в возрасте 3 или 15 месяцев однократно внутривенно ввели НММ в дозе 10 или 50 мг/кг веса тела. Основные результаты представлены в табл. 13.3.

Было установлено, что канцерогенез, индуцированный введением НММ самцам и самкам крыс в 3-месячном и в 15-месячном возрасте, носит дозозависимый характер. При комбинированном воздействии БДУ и НММ, введенном 3-месячным крысам, происходило усиление канцерогенеза в тех органах, которые являются мишенями для НММ. У крыс всех групп, получавших БДУ, отмечалось появление у самцов редких опухолей и торможение развития опухолей гипофиза у самок, а также уменьшение числа гормонозависимых доброкачественных опухолей молочных желез. При введении НММ крысам в возрасте 15 месяцев инициирующий эффект БДУ сохранялся, а новообразования возникали также преимущественно в тех органах, которые являлись мишенями для этого канцерогена (Anisimov, 1995). Расчеты динамики развития опухолей показали, что фатальные опухоли, приводив-

102

Часть V. Модифицирующие факторы старения как средства для изучения его механизмов

Рис. 13.1. Динамика возникновения новообразований: À — у самцов крыс, подвергшихся неонатальному воздействию БДУ и введению НММ в возрасте 3 мес.; Á — в возрасте 15 мес.

По оси абсцисс — возраст, сут.; по оси ординат — количество крыс с опухолями, %. Стрелками указано время введения НММ.

шие к гибели животных, развивались быстрее всего у животных, которым неонатально вводили БДУ, а НММ вводили в возрасте 15 месяцев (рис. 13.1).

Таким образом, при комбинированном воздействии БДУ и дополнительных промотирующих или канцерогенных воздействий происходит существенное усиление канцерогенеза преимущественно в тканях, являющихся мишенями для второго агента.

Этот феномен наблюдался как в случае применения в качестве второго агента, вызывающего опухоли многих локализаций (например, общее рентгеновское облучение или N-нитрозометилмочевина), так и в случае применения агентов, обладающих выраженной тканеспецифичностью действия

103

В. Н. Анисимов

(например, уретана, эстрадиола-бензоата или ТФА). Эти данные, а также отсутствие единого механизма активации онкогена Ki-ras в мезенхимальных опухолях почек у крыс (наличие трансверзий, не свойственных непосредственному действию БДУ на ДНК) убедительно свидетельствуют о развивающейся вследствие неонатального введения БДУ нестабильности генома во всех тканях организма. Результаты опыта, в котором второй агент (НММ) вводился крысам в 15-месячном возрасте, демонстрируют, что инициирующий эффект БДУ длительно сохраняется после его введения во многих тканях организма.

13.8. МАТЕМАТИЧЕСКОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ ИНДУЦИРУЕМОГО БДУ СТАРЕНИЯ И КАНЦЕРОГЕНЕЗА

Для математической модели была выбрана схема старения с двумя возможными путями развития процесса: в сторону старения с апоптозом и некрозом для дифференцированных клеток и многостадийный процесс злока- чественной трансформации клетки (Бутов и др., 2001; Butov et al., 2002). Была рассмотрена математическая модель процессов старения и канцерогенеза в пролиферирующих тканях. Совокупный объем тканей с усредненным уровнем пролиферации был принят в размере 1.5 1010 клеток, что соответствует 15 г живой ткани, т. е. совокупности числа клеток с совпадающим уровнем пролиферации, эквивалентным сумме пролиферирующих с различными скоростями различающихся объемов тканей. В ходе моделирования в качестве отдельных фазовых состояний рассматривались: интерфаза клетки, фаза митоза, преинициированное, инициированное и трансформированное состояния клетки, фаза опухолевого роста. Явлениями, определяющими выбытие клеток, были: апоптоз, некроз, иммунная элиминация. Промоторы и инициаторы рассматривались отдельно. Учитывались системный уровень регулирования пролиферации, усредненное белковое и углеводное питание клетки. В качестве причин смерти рассматривались: функциональная недостаточность органа, критический размер опухоли и др. В порядке упрощения допускалось, что основное число явлений апоптоза и некроза происходит во время интерфазы, и большая* часть мутаций приходится на фазу митоза клеточного цикла. Уровень повреждений, обусловленных свободными радикалами, в норме предполагался превышающим совокупный уровень повреждений ДНК мутагенами и повреждений в процессе транскрипции не менее чем в 5 раз. При этом уровни повреждений мутагенами и в результате транскрипции полагались равными. Уровень репарации ДНК предполагался обеспечивающим равновесное восстановление повреждений.

При воздействии БДУ мутагенный фактор старения увеличивался многократно и становился превалирующим (в модели предполагалось, что уровни промоции и инициации оказываются выше базовых в 2000 раз непо-

104

Часть V. Модифицирующие факторы старения как средства для изучения его механизмов

Рис. 13.2. Схема состояний и переходов в клетке при канцерогенезе.

средственно после введения БДУ, после чего концентрация БДУ и частота мутаций экспоненциально уменьшаются).

В соответствии с этими предположениями и приведенной на рис. 13.2 схемой переходов клеток из одного фазового состояния в другое и осуществляется запись математической модели. Так, процесс Nt представляет собой число клеток в интерфазе с некоторой идеальной нормой развитого организма N; Nts — число клеток в фазе митоза; Аt являются считающим процессом числа переходов из состояния Nt, a A st — обратных переходов. Процесс Bt — число событий гибели клеток в ходе старения (апоптоз и некроз). Число актов удвоения при развитии и (или) ущербе ткани обозначено A Dt , а выбытие во время митоза — Bst . Количество повреждений клеток (инициация) AtP находится в состоянии динамического равновесия с процессом репарации A Rt ; соответствующие прелатентные (обратимо инициированные) клетки NPt в случае дополнительной инициации порождают субпопуляцию клеток латентных (необратимо инициированных) NLt . Соответствующий процесс переходов BPt — закрепление инициации. Воздействие на латентные клетки мутагеном-промотором вызывает поток переходов ATt с формированием субпопуляции трансформированных (неопластических) клеток NTt . В данной модели предполагается, что трансформированные клетки могут осуществлять опухолевый рост ATDt при наличии иммунного контроля с числом элиминированных клеток BTt . Уровни мутагенов и факторов роста определяют интенсивности соответствующих процессов переходов, являясь по существу просто переменными коэффициентами пропорциональности.

105

Â.Н. Анисимов

Âсоответствии с этими обозначениями выполняются следующие балансовые соотношения:

лом означает, что в момент s за малое время D число клеток, переходящих из состояния NP в состояние NS, пропорционально числу исходных клеток N sP и фактору пролиферации ρ ls с коэффициентом репарации à4, и аналогично во всех остальных уравнениях.

Указанные процессы регулируются онтогенетическими, тканевыми, пролиферативными и синтетическими факторами в соответствии со следующими соотношениями: программный (онтогенетический) уровень развития описывается как dà t = r (1 – à t ) dt с решением à t = 1 – (1 – à 0 ) exp{–rt}, уровень «заполненности» органа определяется соотношением: nt = Nt/N, соответственно, уровень «ущерба» ткани равен Lt = 1 – nt . Функциональная способность органа пропорциональна уровню синтеза белка Qt с учетом онтогенетического уровня à t :Ôt = Gt Qt à t = nt Qt à t .

При нарастании уровня повреждений Àt анаболический потенциал QtM снижается dQtM = – k QtM dAt = – k QtM Dt dt, и при начальном значении Q0M = Q M exp {–k A0 }, равен QtM = Q M exp{–k At }; достижимый по условиям питания уровень синтеза белка определяется следующим соотношени-

åì: dQt = Z (QtM V – Qt ) dt, Q0 > 0, ãäå Vtε [0, 1] — уровень питания (Vt = 1 соответствует норме, но и Vt > 1 допустимо, что соответствует стимуляции

синтеза). Уровень иммунитета Jt снижается по закону dJ t = – J t Dt dt и при начальном значении J 0 = exp{– A0 } равен J t = exp{– A}. Системно обусловленный уровень пролиферации записывается в виде: ρ lt = H t Qt , ãäå Ht — гормонально обусловленный индекс пролиферации.

Внешние воздействия и внутренние повреждающие факторы в уравнениях учитывают условия эксперимента. Мутагены-инициаторы определяются как ϕ t = ϕ b + ϕ ýêñï I (tε K ϕýêñï ), ãäå ϕ b — базовый уровень, ϕ ýêñï — дополнительно привнесенные экспериментом интенсивности мутации во время воздействия K ϕýêñï . Совокупная концентрация мутагенов (промоторов и ини-

106

Часть V. Модифицирующие факторы старения как средства для изучения его механизмов

циаторов) µ t = φ t + ψ t влияет на изменение общесистемных показателей — как уровня иммунитета, так и повреждения типа (II). Уровень свободных радикалов, ответственных прежде всего за повреждения типа (I), определя-

дартным винеровским процессом. Частота анаболически обусловленных мутаций db предполагается постоянной. Интенсивность общего разруше-

В модели предполагается, что смерть организма происходит по нескольким причинам: по причине истощения функциональной способности ткани с моментом смерти τ φ = inf {t:t > 0, Φ t < ∆ Φ }, по причине истощения иммунитета с ее моментом τ ∫ = inf {t:T > 0, N Tt > N ∆ N }. Давление среды (обусловливающее постоянные компоненты смертности и соответствующие экспоненциальные составляющие в кривой дожития) предполагаются инициированными двумя моментами τ ENV è τ EXP , ãäå τ EXP вызван дополнительным давлением среды эксперимента к независимым от уровней мутагенов событиям внешней среды τ ENV . Эти моменты записываются соотноше-

ниями τ ENV = –T ENV In(ξ 1 ) è τ EXP = –T EXP (a – bφ ýêñï ) × In (ξ 2 ), ãäå ξ 1 è ξ 2 — независимые равномерно распределенные на интервале (0.1) случайные

В ходе имитационного моделирования при больших значениях чисел клеток в субпопуляциях (1)—(5) осуществляется нормирование и соответствующая диффузионная аппроксимация с переходом к уравнениям диффузионного типа [например, уравнения (1) и (5) заменяются соответственно на

Dn1 = Lt {a1 ntm – a2 nt } ρ lt dt – b1 At nt dt + σ 1 n112 dW1 ,

DnT1 = nT1 (a9 – J 1 b4 ) ρ l1 dt + Ω (nTt )12 dWt ,

и аналогично для тех процессов, значения которых велики для имитации в форме точечных процессов].

Выбор коэффициентов и параметров модели определялся значениями соответствующих биологических характеристик и условиями эксперимента (так, например, в отсутствие воздействия мутагеном интенсивности переходов должны обеспечить стабильность объемов клеточных субпопуляций с известными объемами клеток в интерфазе, клеток в фазе митоза и трансформированных, соответственно 1.5 1010, 1.5 106, 10—100).

Моделирование проводилось на основе рекуррентных алгоритмов, построенных по стохастическим уравнениям в терминах семимартингальных характеристик указанных выше процессов и явлений.

107

В. Н. Анисимов

Рис. 13.3. Экспериментальные (À) и модельные (Á) кривые дожития для крыс, подвергшихся четырехкратному воздействию БДУ.

По оси абсцисс — возраст, сут.; по оси ординат — доля выживших.

Результаты моделирования приведены на рис. 13.3.

Соответствие модельных кривых экспериментальным (как для контрольных групп, так и при воздействии БДУ) может служить подтверждением вывода о том, что под воздействием БДУ возникает ускоренное старение в тканях с пролиферирующими клетками (Butov et al., 2002). Полученные данные косвенно свидетельствуют также об уровне влияния повреждений тканей при мутагенезе и оксидативном стрессе как на скорость старения, так и канцерогенеза. Заметим, что этот вывод был подтвержден в наблюдениях in vitro, в которых было показано, что добавление БДУ в культуры клеток человека и животных ускоряет их старение (Michishita et al., 1999). Авторы полагают, что вывод об активации БДУ механизма старения, общего для неиммортализированных и иммортализированных клеток, справедлив. Предложенный принцип построения математических и имитационных

108

Часть V. Модифицирующие факторы старения как средства для изучения его механизмов

моделей процессов старения и канцерогенеза может рассматриваться как первый шаг в попытке описания достаточно сложного и еще не полностью изученного явления.

13.9. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Синтетический аналог тимидина 5-бромодезоксиуридин (БДУ), включа- ясь вместо него в ДНК, не «узнается» ферментами репарации, длительно персистирует в различных органах и тканях организма, что приводит к нарушениям комплементарности, точковым мутациям и нестабильности генома в целом. Ряд биологических эффектов БДУ in vitro è in vivo позволил предположить, что этот агент может быть использован для изучения роли избирательных повреждений ДНК в процессах инициации канцерогенеза и старения. Было установлено, что неонатальное введение крысам БДУ сопровождается преждевременным развитием у них и их потомства ряда нарушений в репродуктивной системе, увеличением частоты хромосомных аберраций, более частым и ранним, чем в контроле, развитием новобразований (табл. 13.4). Эти наблюдения, а также анализ кривых выживае-

Ò à á ë è ö à 13.4

Основные биологические свойства 5-бромодезоксиуридина

109

В. Н. Анисимов

мости и расчеты параметров скорости старения подопытных и контрольных животных позволяют предполагать, что использованная модель может рассматриваться как модель ускоренного старения, а полученная совокупность фактов может служить серьезным аргументов в пользу мутационной теории старения.

Нестабильность генома, развивающаяся у крыс, подвергшихся неонатальному воздействию БДУ, по-видимому, является тем первичным механизмом, который определяет развитие как процесса ускоренного старени, так и инициацию канцерогенеза и повышение чувствительности организма к действию промоторов опухолевого роста и других канцерогенных агентов, как химических, так и радиационных и вирусных. Таким образом, в опытах in vivo с БДУ впервые были получены убедительные доказательства, что само по себе избирательное повреждение ДНК может вызывать инициацию канцерогенеза. Кроме того, было установлено, что БДУ ускоряет процесс старения организма.

Ë è ò å ð à ò ó ð à

Анисимов В. Н. Молекулярные и физиологические механизмы старения. СПб.: Наука, 2003. 468 с.

Анисимов В. Н. Роль индуцируемой 5-бромодезоксиуридином нестабильности генома в механизмах ускоренного старения и канцерогенеза / Успехи геронтол. 1997. Т. 1. С. 50—56.

110