6 курс / Медицинская реабилитация, ЛФК, Спортивная медицина / Молекулярные_и_физиологические_механизмы_старения_в_2_т_,_Т_2_Анисимов

Часть V. Модифицирующие факторы старения как средства для изучения его механизмов

Рис. 15.9. Метформин угнетает экспрессию Cyclin D1, HER2, E2F1 и передачу сигнала ErbD2 в MCF7/713 (Alimova et al., 2007).

et al., 2005). В опытах на мышах NMRI обнаружено, что диабенол не влиял на динамику веса тела, поглощение корма и жидкости, температуру тела. Препарат тормозил возрастные нарушения эстральной функции, уменьшал смертность животных, увеличивал показатели продолжительности жизни самок, в особенности среднюю продолжительность жизни 10 % максимально проживших мышей (с 480 до 504 дней). У подопытных животных, полу- чавших препарат, по сравнению с интактным контролем средний латентный период развития опухолей молочных желез увеличивался с 259 до 328 дней, снижались количество мышей с метастазами этих опухолей в легких и частота злокачественных лимфом (табл. 15.8).

Влияние диабенола на показатели гомеостаза у мышей HER-2/neu выражалось в замедлении появления возрастных нарушений эстральной функции. Препарат не оказывал значительного влияния на продолжительность жизни животных. У трансгенных мышей, получавших диабенол, отмечена тенденция к уменьшению частоты метастазирования рака молочной железы в легких (с 48.3 до 35.7 %) и максимального диаметра метастазов. Полученные данные свидетельствуют об отсутствии токсического и канцерогенного эффекта диабенола и наличии у диабенола геропротекторных свойств. Следует отметить, что введение диабенола оказывало отчетливое угнетающее влияние на канцерогенез толстой кишки, индуцируемый у крыс 1,2-диме- тилгидразином (Popovich et al., 2005).

181

Â.Н. Анисимов

Òà á ë è ö à 15.8

Влияние диабенола на показатели продолжительности жизни и развитие спонтанных опухолей у самок мышей линии NMRI (Popovich et al., 2004)

П р и м е ч а н и е. Константа a в уравнении Гомпертца: R = R0(exp)at, ãäå R0 = смертность во время t = 0; MRDT — время удвоения силы смертности (mortality rate doubling time). à — в скобках — 95%-ный доверительный интервал. Различие с соответствующим показателем для контрольной группы статистиче- ски достоверно, * — p < 0.05; ** — p < 0.01.

В связи с приведенными выше данными необходимо указать, что при изучении противодиабетической активности диабенола ранее была показана способность исследуемого препарата восстанавливать физиологический профиль секреции инсулина, снижать резистентность тканей к инсулину, улучшать утилизацию глюкозы периферическими тканями и пролонгировать гипогликемический эффект инсулина. Показано нормализующее действие диабенола на периферическую утилизацию глюкозы при использовании моделей инсулинрезистентности различного генеза (экзогенной гиперинсулинемии и ожирения у старых животных, сопровождающихся повышенным содержанием гормона в организме), что в первую очередь может быть связано с улучшением чувствительности тканей к инсулину (Popovich et al., 2005). Все это подтверждает предположение о том, что эффект диабенола обусловлен несколькими механизмами, как панкреотропными, так и экстрапанкреатическими. Есть основания полагать, что отмеченные

182

Часть V. Модифицирующие факторы старения как средства для изучения его механизмов

Ò à á ë è ö à 15.9

Механизм действия антидиабетичсеких бигуанидов (Anisimov, 2003)

Снижает концентрацию холестерина в лимфоцитах и тромбоцитах

механизмы могут быть ответственными за геропротекторные и антиканцерогенные свойства диабенола.

В совокупности имеющиеся данные позволяют рассматривать применение антидиабетических средств с учетом их химической природы и механизма действия (табл. 15.9) в качестве перспективного направления в области профилактики ассоциированной с возрастом патологии. В клинических наблюдениях было установлено, что применение антидибетических бигуанидов улучшает 5- и 10-летнюю выживаемость онкологических больных (Berstein, 2005) и снижает риск развития рака молочной железы у больных сахарным диабетом 2-го типа (Evans et al., 2005). В ряде исследований показано, что применение метформина снижает на 36 % общую смертность у людей, смертность от инфарктов миокарда (на 39 %) и на 42 % смертность от осложнений сахарного диабета (Scarpelli, 2003; Eurich et al., 2005).

Данные литературы и результаты наших исследований свидетельствуют о перспективности использования антидиабетических бигуанидов как для профилактики и лечения опухолей, так и в качестве геропротекторов. Таким образом, в опытах на крысах и мышах нами выявлен геропротекторный

183

Â.Н. Анисимов

Òà á ë è ö à 15.10

Влияние антидиабетических бигуанидов на канцерогенез у грызунов*

П р и м е ч а н и е. ДМБА — 7, 12-диметилбенз(а)антрацен; ДМГ — 1,2-диметилгидразин; МХ — 20-метилхолантрен; НБОПА — N-нитрозо-бис(2-оксопропил)амин; НММ — N-нитрозометилмочевина; НЭМ — N-нитрозоэтилмочевина. * — полная библиография цитированных работ приведена в работах (Anisimov, 1987, 2006).

эффект антидиабетических бигуанидов, сопровождавшийся снижением частоты развития спонтанных опухолей. Наши результаты соответствуют наблюдениям американских исследователей, использовавших крыс и мышей других линий и также не обнаруживших канцерогенного эффекта фенформина. Следует отметить, что антидиабетический препарат толбутамид (производное сульфонилмочевины) при хроническом введении крысам и мышам не оказывал влияния на продолжительность жизни животных и частоту развития у них спонтанных опухолей (Anisimov, 1987). На различных моделях химического и радиационного канцерогенеза установлено, что фенформин и буформин тормозят развитие опухолей различных гистогенеза и локализаций. Этот эффект проявлялся не только в снижении частоты опухолей, но и в увеличении латентного периода их развития (Anisimov, 1987) (табл. 15.10). Показано, что фенформин угнетает in vitro пролиферацию клеток рака предстательной железы LNCaP и клеток нейробластомы SH-SY5Y человека (Caraci et al., 2003). В опытах с перевиваемыми опухолями выявлено тормозящее действие феноформина на рост карциномы Эрлиха (Dilman, 1994) и потенцирует цитостатический эффект на перевиваемый рак шейки матки SCC, гепатому-22а и карциному легкого Льюис (Dilman, Anisimov, 1979). Установлено, что метформин уменьшает проявления окислительного стресса, вызываемого адриамицином и его мутагенный эффект (Aleisa et al., 2007).

Сравнение эффектов, вызываемых ограничением калорийности диеты и антидиабетическими препаратами, показывает, что последние имеют

184

Часть V. Модифицирующие факторы старения как средства для изучения его механизмов

Ò à á ë è ö à 15.11

Сравнительные характеристики у грызунов при нормальном старении, ограничении калорийности питания

и воздействии антидиабетических бигуанидов (Anisimov et al., 2005)

П р и м е ч а н и е. — снижение; — увеличение; = нет эффекта; 0 — отсутствует; НД — нет данных. a — Толерантность к глюкозе увеличивалась у самок, но уменьшалась у самцов. b — Репродуктивная функция по отношению к нормально стареющим мышам.

ряд очевидных преимуществ перед ограниченным калорийно питанием и могут рассматриваться как миметики последних (табл. 15.11) (Ingram et al., 2006).

15.12.МЕЛАТОНИН

15.12.1.Опыты на мышах

Впервые способность мелатонина увеличивать продолжительность жизни мышей была установлена W. Pierpaoli и G. J. M. Maestroni (Pierpaoli, Maestroni, 1987). В ноябре 1985 г. авторы начали ежедневные введения мелато-

185

В. Н. Анисимов

нина с питьевой водой (10 мг/л) 10 самцам мышей линии C57BL/6J. 10 контрольных животных получали 0.01 % раствор этанола, служивший растворителем для мелатонина. В начале опыта возраст мышей составлял 575 дней (около 19 месяцев), и все они были вполне здоровы. Мелатонин животные получали с 18.00 до 8.30 ч. Через 5 месяцев после начала опыта контрольные животные стали терять в весе, были малоактивны, облысели. Введение мелатонина предохраняло животных от возрастной потери веса, и он сохранялся на уровне 18-месячных. Средняя продолжительность жизни мышей под влиянием мелатонина увеличилась на 20 %, составив 931 ± 80 дней против 752 ± 81 дней в контрольной группе. По расчетам авторов различие достоверно (р < 0.01, при вариантном анализе). Однако при расчете по критерию t Стьюдента, различие оказывается незначимым (t = 1.57;

ð< 0.05).

Â1991 г. W. Pierpaoli и соавт. представили результаты трех серий опытов с хроническим введением мелатонина мышам различных линий. Во всех опытах мелатонин вводили только в ночное время с питьевой водой (10 мг/л). 15 самкам мышей линии С3Н/Не мелатонин начинали вводить с 12-месячного возраста. В контрольной группе было 14 мышей. Мелатонин не только не увеличил продолжительность жизни этих мышей, но привел к увеличению частоты развития новообразований, преимущественно поражавших органы репродуктивной системы (лимфоили ретикулосаркомы, карциномы яичников). Данные о средней продолжительности жизни и частоте новообразований в контрольной и подопытной группах не были приведены. Следует отметить, что самок мышей линии С3Н/Не характеризует высокая частота развития спонтанных опухолей молочной железы (Storer, 1966), однако авторы не сообщают каких-либо сведений об их обнаружении в контрольной или подопытной группах. Мыши, получавшие мелатонин, жили в среднем на 2 месяца меньше контрольных. На 2 месяца была короче и максимальная продолжительность жизни мышей, которым вводили мелатонин.

Во 2-й серии опытов мелатонин вводили в дневное или ночное время мышам-самкам линии NZB (New Zealand Black), характеризующихся высокой частотой развития аутоиммунной гемолитической анемии, нефросклероза и системных или локализованных ретикулоклеточных опухолей типа А или В. В каждой группе было по 10 животных, и мелатонин начинали вводить с четырехмесячного возраста. Введение мелатонина днем не оказывало влияния на выживаемость мышей, и все они погибли к 20-месячному возрасту (в контроле — к 19-му месяцу жизни). При введении мелатонина в ночные часы в возрасте 20 месяцев были живы 4 из 10 мышей этой группы, а до 22-месячного возраста дожили 2 мыши. Последняя мышь прожила 2 месяца, т. е. на 4 месяца больше максимальной продолжительности жизни в контрольной группе. Авторы не наблюдали каких-либо различий в причи- нах смерти в контрольной и подопытных группах.

Третья серия опытов была повторением опыта с мышами-самцами линии C57BL/6. На этот раз в контрольной группе было 20, а в подопытной —

186

Часть V. Модифицирующие факторы старения как средства для изучения его механизмов

15 мышей в возрасте 19 месяцев. Средняя продолжительность жизни в контроле составила 743 ± 84 дня, а в группе, получавшей мелатонин, 871 ±118 дней (р < 0.001 по данным авторов и t = 0.8; р < 0.05 при расчете с использованием критерия t Стьюдента). Введение мелатонина не сказывалось существенно на весе тела мышей в ту или иную сторону при сравнении с контролем.

Позднее W. Pierpaoli и W. Regelson (1994) обобщили старые данные и представили результаты новых экспериментов по изучению влияния мелатонина на продолжительность жизни мышей разных линий. Мелатонин вводили с питьевой водой (10 мг/л) в ночные часы (с 18.00 до 8.30 ч). Самкам мышей BALB/c гормон начинали вводить с 15-месячного возраста. Средняя продолжительность жизни 26 контрольных животных составила 715 дней, тогда как получавшие мелатонин 12 мышей жили в среднем 843 дня, т. е. на 18 % дольше. Медиана составила соответственно 24.8 месяца в контроле и 28.1 месяца в подопытной группе, а максимальная продолжительность жизни — 27.2 и 29.4 месяца соответственно. Авторы не наблюдали каких-либо различий в весе тела между мышами обеих rpyпп. В другом опыте мелатонин вводили также с питьевой водой в ночные часы в дозе 10 мг/л самцам мышей BALB/c начиная с 18-месячного возраста и убивали группами через 4, 7 и 8 месяцев после начала воздействия. Через 8 месяцев наблюдения вес тимуса, надпочечников и тестикул мышей, получавших мелатонин, существенно отличался от одновозрастного контроля. Аналогичным образом улуч- шались такие показатели, как число лимфоцитов в периферической крови, уровень цинка, тестостерона и тиреоидных гормонов. Авторы полагают, что циклическое введение мелатонина оказывает положительное влияние на мышей, поддерживая в них более молодое состояние эндокринных и ти- мико-лимфоидных органов. Следует отметить, что число старых мышей в группах было крайне невелико (5—6), а контрольная группа 3-месячных мышей включала только 3 животных.

S. P. Lenz и соавт. (1995) вводили мелатонин самкам мышей NZB/W в инъекциях в разовой дозе 100 мкг на мышь (2—3.5 мг/кг) ежедневно в утренние часы (между 08.00 и 10.00 ч) или вечером (между 17.00 и 19.00 ч) начиная с 8-месячного возраста и в течение 9 месяцев. В каждой группе было по 15 животных. Было установлено, что введение мелатонина в утренние часы существенно (р < 0.001) увеличивает выживаемость мышей, тогда как вечерние инъекции таким эффектом не обладали. Так, если до 34-недельно- го возраста дожило только 20 % контрольных мышей, в «утренней» группе были живы 65 % животных, причем 30 % дожили до конца периода наблюдения (44 недели). В «вечерней» группе до 34-недельного возраста дожило практически столько же (60 %) мышей, однако 37-недельный возраст пережили лишь 20 % животных. Авторы отметили замедление возрастного нарастания протеинурии у мышей, которым мелатонин вводили в утренние часы. К сожалению, наблюдение за животными было прекращено до естественной гибели животных во всех группах. Число мышей в группах было весьма невелико, полная аутопсия животных не производилась.

187

Â.Н. Анисимов

E.Mocchegiani и соавт. (1998) вводили мелатонин с питьевой водой (10 г/л) в ночные часы 50 самцам мышей линии Balb/c начиная с 18-месяч- ного возраста. 50 мышей другой группы получали воду с добавлением сульфата цинка (22 мг/л) и 50 служили интактным контролем. За мышами наблюдали до естественной гибели, их регулярно взвешивали и определяли потребление корма. Применение мелатонина и цинка существенно сдвигало вправо кривые выживаемости животных и увеличивало на 2 и 3 месяца соответственно максимальную продолжительность жизни животных по сравнению с интактным контролем. Ни мелатонин, ни цинк не влияли на потребление корма и динамику веса тела животных.

A. Conti и G. J. M. Maestroni (1998) изучали влияние мелатонина на продолжительность жизни самок мышей линии NOD (non-obese diabetic), характеризующихся высокой частотой развития инсулинзависимого диабета. Одной из групп мышей (n = 25) была произведена эпифизэктомия сразу после рождения, 2-я группа (n = 30) получала мелатонин подкожно в дозе 4 мг/кг в 16.30 ч 5 раз в неделю начиная с возраста 4 недели и до 38-й недели жизни. Мышам 3-й группы по такой же схеме вводили подкожно бычью сыворотку (PBS) и они служили контролем к группе 2. Мышам 4-й группы (n = 17) мелатонин вводили с питьевой водой (10 мг/л) в ночные часы 5 раз

âнеделю с 4-й по 38-ю неделю жизни, 5-ю группу составили 29 интактных животных. Эпифизэктомированные мыши начали погибать уже в возрасте 19 недель, аутоиммунный диабет у них быстро прогрессировал, и к 32 неделе жизни 92 % всех животных этой группы погибли. В контроле мыши на- чали погибать с 18-й недели жизни, однако наклон кривой выживаемости был существенно меньшим, и к 50-й неделе жизни вымерло 65.5 % контрольных животных. При хроническом подкожном введении мелатонина в течение 33 недель существенно замедлялась скорость развития болезни и снижалась смертность. До возраста 50 недель не дожило только 10 % мышей, которым подкожно вводили мелатонин. Интересно, что инъекции бычьей сыворотки также замедляли развитие диабета, однако до возраста 50 недель дожило лишь 32 % мышей этой группы. Эффект введения мелатонина с питьевой водой был менее выражен, чем при его подкожном введении: до конца срока наблюдения дожило 58.8 % мышей этой группы против 34.5 % в контроле (р < 0.0019). Таким образом, если эпифизэктомия ускоряла развитие диабета и укорачивала продолжительность жизни мышей линии NOD, то введение мелатонина замедляло развитие заболевания и увеличивало продолжителньость жизни животных (Conti, Maestroni, 1998).

Âдругом большом исследовании мелатонин с кормом (11 ррm или 68 мкг/кг веса тела в день) давали самцам мышей линии C57BL/6 начиная с 18-месячного возраста (Lipman et al., 1998). Динамика веса тела и потребления корма под влиянием мелатонина существенно не отличалась от таковой у контрольных животных. Не наблюдалось также никаких различий в смертности в группе контрольных мышей и мышей, получавших с кормом мелатонин. Так, 50%-ная смертность в контроле наступала в возрасте 26.5 меся-

188

Часть V. Модифицирующие факторы старения как средства для изучения его механизмов

ца, а при введении мелатонина — в 26.7 месяца. Кривые смертности, а также данные о максимальной продолжительности жизни животных в разных группах в работе не представлены. Более того, их убивали в возрасте 24 месяцев (когорта 1) либо в возрасте, когда умирала половина всех животных в группе (возраст 50%-ной смертности), т. е. через 6 или 8.5 месяца после на- чала опыта (когорта 2). Последнюю, 3-ю когорту составили мыши, которые пали ранее двухлетнего возраста или до достижения возраста 50%-ной смертности. В 1-й когорте было по 20 контрольных и получавших мелатонин мышей, во 2-й соответственно 7 и 13 мышей, а в 3-й соответственно 38 и 30 животных в группе. В этих трех когортах раздельно оценивалась частота развившихся патологических процессов. Авторы не обнаружили ка- ких-либо различий в общей частоте патологических процессов между мышами контрольной группы и получавшими мелатонин. Однако такой вывод, на наш взгляд, не вполне корректен и опровергается данными, представленными в статье. Так, авторы объединили под одной рубрикой все патологические процессы, включая дегенеративно-атрофические, лимфопролиферативные, и новообразования. Вместе с тем, если частота лимфом среди мышей контрольной группы и группы, получавшей мелатонин (3-я когорта), была одинаковой (21.1 и 23.3 % соответственно), то среди доживших до срока 50%-ной смертности она составила 28.6 и 77.9 % соответственно. Вызывает крайнее удивление отсутствие какого-либо упоминания о лимфомах у мышей в 1-й когорте, т. е. умерщвленных в возрасте 24 месяца, что лишь на 2.5—3 месяца меньше, чем в когорте 2, притом что у павших до этого срока лимфомы выявлялись в 21—23 % случаев. В статье полностью отсутствуют сведения о новообразованиях других локализаций у мышей различных групп. Приходится констатировать, что работа Lipman и соавт. (1998) содержит ряд серьезных методических ошибок, которые ставят под сомнение результаты всей работы и ее выводы.

В наших опытах (Anisimov et al., 2001a) 50 подопытным самкам мышей линии СВА начиная с шестимесячного возраста курсами (5 дней подряд раз в месяц) вводили с питьевой водой мелатонин (20 мг/л). 50 интактных самок служили контролем. За животными наблюдали до их естественной гибели. Ежемесячно мышей взвешивали, определяли количество потребленного корма. Каждые три месяца исследовали эстральную функцию, мышечную силу, утомляемость, двигательную активность мышей, а также измеряли температуру тела. Всех животных вскрывали. Обнаруженные опухоли исследовали гистологически. Было установлено, что длительное введение мелатонина самкам мышей СВА замедляло у них возрастные изменения эстральной функции и не оказывало сколько-нибудь неблагоприятного влияния на их физическую активность. В ходе эксперимента было установлено, что у мышей контрольной группы температура тела не падала, а на 9-м месяце опыта была достоверно выше по сравнению с 6-м месяцем. У мышей, получавших мелатонин, напротив, температура тела в ходе всего эксперимента достоверно снижалась (p < 0.001). Сходная тенденция отме- чена также при измерении средней температуры отдельных фаз эстрального

189

В. Н. Анисимов

Рис. 15.10. Влияние мелатонина на продолжительность жизни самок мышей CBA с фатальными опухолями.

По оси абсцисс — возраст, сут.; по оси ординат — доля выживших мышей. Штриховая линия — контроль; сплошная линия — мелатонин.

цикла. Однако различий между значениями температуры отдельных фаз цикла практически не было. Только у мышей подопытной группы на 3-м месяце опыта температура во время эструса была достоверно выше, чем во время метаэструса и проэструса (p < 0.05).

Данные о влиянии мелатонина на продолжительность жизни мышей представлены на рис. 15.10. Можно видеть, что динамика выживаемости не различалась в обеих группах до возраста 22 месяца, после чего наблюдалось отчетливое уменьшение смертности под влиянием мелатонина. Если к двухлетнему возрасту не осталось в живых ни одной контрольной мыши, то мышей, получавших мелатонин, было 9. Таким образом, кривая выживаемости мышей, получавших мелатонин, была смещена вправо по сравнению с кривой выживаемости контрольных мышей. Средняя продолжительность жизни мышей в обеих группах достоверно не различалась, тогда как максимальная продолжительность жизни под воздействием мелатонина увеличилась почти на 2.5 месяца. Сведения о частоте, локализации и типе опухолей в контрольных и подопытных группах представлены в табл. 15.12.

Таким образом, применение мелатонина оказало определенное усиливающее спонтанный канцерогенез действие у самок мышей СВА. Число мышей со злокачественными опухолями в подопытной группе было достоверно (на 20 %) больше, чем в контрольной. Под влиянием мелатонина отмечено появление 4 лейкозов и 5 аденокарцином легких (р < 0.01), отсутствовавших в контрольной группе. Показано наличие опухолей матки в под-

190