Проблема контаминации
Контаминация
Ложные результаты
Высокие требования
к организации ПЦР- лаборатории
Варианты контаминации продуктами амплификации
1. Контаминация специфическими продуктами амплификации
Ложно-положительные результаты
2. Контаминация неспецифическими продуктами амплификации
Дополнительные |
Шмеры |
Димеры праймеров |
|
полосы |
|||
|
|
Ложно-положительные |
Ложно-отрицательные |
результаты |
результаты |
Изобретение флуоресцентной ПЦР 
Метод «FLASH» (Fluorescent
Amplification-based Specific Hybridization) – специфическая гибридизация в процессе амплификации с ДНК- зондами, меченными флуорофорами).
Регистрация
флуоресценции происходит с помощью специального прибора «Джин» » после окончания реакции 
Флуоресцентные методы в ПЦР |
принцип |
варианты |
ДНК- |
Флуоресцентные методы в ПЦР |
|
Негибридизационные |
принцип |
|
|
Гибридизационные |
|
|
варианты |
|
ДНК- |
Флуоресцентные методы в ПЦР |
||
Негибридизационные |
принцип |
|
|
||
|
Флуоресцентные интеркаляторы |
|
Гибридизационные |
|
|
|
|
варианты |
|
|
• EtBr |
|
|
• SYBR green I |
|
|
ДНК- |
Флуоресцентные методы в ПЦР |
||
Негибридизационные |
принцип |
|
|
||
|
Флуоресцентные интеркаляторы |
|
|
– электрофорез |
|
Гибридизационные |
|
|
|
|
варианты |
|
|
• Агарозный |
|
|
• Акриламидный |
|
|
ДНК- |
Флуоресцентные методы в ПЦР |
||
Негибридизационные |
принцип |
|
|
||
|
Флуоресцентные интеркаляторы |
|
|
– электрофорез |
|
|
– метод "кривых плавления" |
|
Гибридизационные |
|
|
|
|
варианты |
|
|
• Качественный |
|
|
• Количественный |
|
|
( “real-time” ) |
|
|
ДНК- |
Флуоресцентные методы в ПЦР |
|
|
Негибридизационные |
принцип |
|
|
||
|
Флуоресцентные интеркаляторы |
|
|
– электрофорез |
|
|
– метод "кривых плавления" |
|
|
Флуоресцентно-меченные праймеры |
|
|
– праймеры со "шпилькой" |
|
Гибридизационные |
|
|
|
|
варианты |
|
|
ДНК- |
Флуоресцентные методы в ПЦР |
|
|
Негибридизационные |
принцип |
|
|
||
|
Флуоресцентные интеркаляторы |
|
|
– электрофорез |
|
|
– метод "кривых плавления" |
|
|
Флуоресцентно-меченные праймеры |
|
|
– праймеры со "шпилькой" |
|
Гибридизационные |
|
|
|
Гибридизация после амплификации |
варианты |
|
|
|
|
Гибридизация во время амплификации |
|
|
|
ДНК- |