6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Руководство_ВОЗ_по_исследованию_и_обработке_эякулята

68 ЧАСТЬ I Исследование эякулята человека

2.14.2.4 Подготовка окрашенных мазков спермы до их заключения в гистологическую среду

Существует два вида жидкости для заключения препаратов: гистологические среды, растворимые и нерастворимые в этаноле.

•Используйте гистологические среды, растворимые в этаноле, сразу же на мазках с невысохшим этанолом.

•Для гистологических сред, нерастворимых в этаноле, возьмите предметные стекла сразу же после этапа 19, описанного выше, с последующим действиями (работайте в вытяжном шкафу):

•1. Ксилол:этанол 1+1 (1:2) 1 мин

Удаляйте предметные стекла по одному за раз из ксилола и позвольте ему стечь в течение только 1–2 сек, так как стекло должно быть полностью влажным при заключении в гистологические среды.

2.14.2.5 Заключение окрашенных мазков спермы в гистологические среды

1.Добавьте две или три капли гистологической среды на предметное стекло.

2.Положите покровное стекло (24 × 50 мм или 24 × 60 мм, как наиболее пригодные) непосредственно на мазок.

3.Поместите покровное стекло таким образом, чтобы контакт с гистологической средой начинался по длинной стороне для предотвращения формирования пузырьков воздуха.

4.Если необходимо, аккуратно надавите на покровное стекло для того, чтобы помочь переместить пузырьки воздуха к краю стекла.

5.Уберите излишки ксилола (если они есть) из-под стекла.

6.Сушите заключенный мазок в горизонтальном положении в специальных контейнерах или на фильтровальной бумаге в течение 24 ч в вытяжном шкафу.

2.14.3Окрашивание по Шорру для оценки морфологии сперматозоидов

Окрашивание по Шорру обеспечивает сходные значения морфологически нормальных форм сперматозоидов, как и окрашивание по Папаниколау (Meschede et al., 1993).

2.14.3.1 Реагенты

1.Гематоксилин Харриса: Папаниколау № 1.

2.Раствор Шорра: куплен в готовом виде либо приготовлен следующим образом. Растворите 4 г порошка Шорра в 220 мл подогретого 50% (v/v) этанола. Охладите, добавив 2 мл ледяной уксусной кислоты

(в вытяжном шкафу) и профильтруйте.

3.Уксусный этанол: добавьте 25 мл ледяной уксусной кислоты в 75 мл от 95% (v/v) этанола.

Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

70ЧАСТЬ I Исследование эякулята человека

2.Фиксатор: 1,8 мг триарилметана, растворенного в 1000 мл 95% (v/v) метанола, опционально.

3.Фиксатор: метанол 95% (v/v), опционально.

2.14.4.2 Фиксация суховоздушных мазков спермы

Погрузите предметные стекла в фиксатор триарилметан (согласно набору Diff-Quik или приготовленному, как описано выше) на 15 сек или в 95% метанол на 1 ч. Дайте лишнему фиксатору стечь, помещая предметные стекла вертикально на фильтровальной бумаге.

2.14.4.3 Окрашивание зафиксированных мазков спермы

Последовательно погрузите предметные стекла в следующие растворы:

Удаляйте излишний раствор на каждом этапе окрашивания путем помещения предметных стекол вертикально на фильтровальную бумагу.

Важно 1: Предметные стекла могут быть заключены в гистологические среды или не заключены.

Важно 2: Если произошло чрезмерное окрашивание фона, следует отмыть аликвоту спермы (см. Раздел 2.13.2.4), подготовить новые предметные стекла и их покрасить. Отмывка может повлиять на морфологию сперматозоидов, поэтому ее использование должно быть записано.

2.14.3.4 Заключение окрашенных мазков спермы в гистологические среды

См. Разделы 2.14.2.4 и 2.14.2.5.

2.15 Оценка окрашенных препаратов

При оценке окрашенных препаратов следует использовать иммерсионный объектив ×100 и окуляр не менее ×10. Более четкое изображение можно получить, когда жидкость со сходным индексом преломления (приблизительно 1,5) и стекло (1,50–1,58) поместить между линзами и препаратом, не заключенным в гистологическую среду, или покровным стеклом. Обычно для этих целей используют иммерсионное масло (индекс преломления 1,52). Гистологическая среда для заключения имеет сходный индекс преломления (1,50–1,55: см. Бокс 2.14).

2.15.1 Классификация морфологически нормальных сперматозоидов

Оценка морфологии сперматозоидов связана с некоторыми трудностями, такими как потеря объективности, вариации в интерпретации или плохим выполнением внешнего контроля качества (см. Раздел 7.13.2).

Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

72 ЧАСТЬ I Исследование эякулята человека

Комментарий 4: Шейка 74 сперматозоидов, окрашенных по Папаниколау (окрашены согласно процедуре, описанной в Разделе 2.14.2, и классифицированы как нормальные согласно критериям, описанным

здесь), измеренные с помощью той же компьютерной системы, имели следующие размеры: медиана длины 4,0 мкм, 95% CI 3,3–5,2; медиана ширины 0,6 мкм, 95% CI 0,5–0,7.

Комментарий 5: Закрученные жгутики (>360о; см. Рис. 2.13m) могут указывать на дисфункцию эпидидимиса (Pelfrey et al., 1982).

Такую оценку морфологически нормальных сперматозоидов лучше использовать при исследовании для выявления незначительных вариаций по форме всего сперматозоида (нормальные/пограничные головки и жгутики сперматозоидов; см. Раздел 2.16, Вклейки 1–12 и комментарии

кним).

2.15.2Классификация морфологически аномальных сперматозоидов

Образцы спермы человека содержат сперматозоиды с различными типами нарушений. Дефектный сперматогенез и некоторые формы патологии эпидидимиса часто связаны с увеличенным количеством аномальных сперматозоидов. Морфологические дефекты часто сочетаны. Аномальный сперматозоид обычно имеет сниженный оплодотворяющий потенциал, зависящий от типа аномалии, и может содержать также аномальную ДНК. Морфологические дефекты связаны с усиленной фрагментацией ДНК (Gandini et al., 2000), повышенным риском структурных хромосомных аберраций (Lee et al., 1996), незрелым хроматином (Dadoune et al., 1988) и анеуплоидией (Devillard et al., 2002; Martin et al., 2003). Именно поэтому акцент сделан на форму головки сперматозоида, хотя жгутик (средняя и основная его части) также рассматриваются. Необходимо отмечать следующие категории аномалии (дефекта)

(см. Рис. 2.13):

•Дефекты головки: большая или маленькая, конусообразная, грушевидная, круглая, аморфная, вакуолизированная (более двух вакуолей или >20% головки занимает неокрашенная вакуолярная область), вакуоли в постакросомной области, малого размера или крупная акросома (<40% или >70% области головки), двухголовый или любая комбинация вышеназванных дефектов.

•Дефекты шейки и средней части: ассиметричное прикрепление средней части к головке (гетероаксиальность), толстая или с неправильным контуром, чрезмерно изогнутая, аномально тонкая или любая комбинация названных характеристик.

•Дефекты основной части жгутика: короткая, множественная, сломанная, шпилькообразная, с резко выраженным углом, ширина с неправильным контуром, скрученная или любая комбинация названных характеристик.

•Чрезмерная резидуальная цитоплазма (excess residual cytoplasm, ERC) связана с аномальным сперматозоидом, формирующимся при аномальном сперматогенезе. Сперматозоид с большим количеством окра-

Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

ГЛАВА 2 Стандартные тесты 73

шенной цитоплазмы с неровным контуром, размером более одной трети головки, часто сочетаемым с дефектом средней части (Mortimer & Menkveld, 2001), считают аномальным. Такую аномалию не следует называть цитоплазматической каплей (Cooper, 2005).

Комментарий 1: Цитоплазматические капли (окруженные мембраной пузырьки на средней части в месте соединения головки со жгутиком) являются нормальным компонентом физиологически функционального сперматозоида. Если капли чрезмерно увеличены, они могут располагаться вдоль средней части жгутика, что наблюдают в фазовоконтрастном микроскопе, в дифференциальном контрасте и при рентгеновой микроскопии живых клеток в сперме и цервикальной слизи (Abraham-Peskir et al.,2002; Fetic et al., 2006).

Комментарий 2: Цитоплазматические капли осмотически чувствительны и плохо сохраняются при рутинной процедуре сушки препаратов на воздухе (Chantler & Abraham-Peskir, 2004; Cooper et al., 2004). Их невозможно наблюдать на окрашенных препаратах, где они выглядят как небольшое расширение средней части. Цитоплазматические капли на фиксированных и окрашенных препаратах практически всегда меньше одной трети размера головки (Mortimer & Menkveld, 2001) и их не считают аномальными в таких случаях.

Рис. 2.13 Схематическое изображение некоторых патологических форм сперматозоидов че-

ловека

A. Дефекты головки:

Из Kruger et al., 1993, с любезного разрешения MQ Medical.

74 ЧАСТЬ I Исследование эякулята человека

2.16 Морфология сперматозоидов на вклейках 1–14

Все микрофотографии на вклейках 1–14 были оценены согласно строгим морфологическим критериям, описанным выше. Анализ морфологии сперматозоидов субъективен и отчасти трудно поддается стандартизации, поэтому сделана эта попытка описать искусственные cut-off-точки между нормальными и аномальными клетками на основе множества характеристик головок и жгутиков сперматозоидов. Вклейки, которые идут ниже, были оценены единственным экспертом, доктором Т. Крюгером (Dr. Thinus Kruger). Оценки содержат дополнительные комментарии для того, чтобы гарантировать обоснованность всех типов аномалий.

Напротив каждой цветной вклейки есть таблица, описывающая морфологическую оценку каждого изображенного сперматозоида. В таблице указано, является ли головка нормальной или аномальной, указаны подробности аномалии головки, является ли средняя (шейка) или концевая части нормальными по форме, и можно ли рассматривать сперматозоид в общем морфологически нормальным. Другие важные замечания указаны в колонке «Комментарии». Сокращения объясняются в Табл. 2.6.

Таблица 2.6 Сокращения, используемые в комментариях к вклейкам 1–14

Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

76 ЧАСТЬ I Исследование эякулята человека

Вклейка 1

10 микрон

Микрофотографии с любезного согласия C.Brazil

Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/