6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Руководство_ВОЗ_по_исследованию_и_обработке_эякулята

7

ГЛАВА 2 Стандартные тесты

2.1 Введение

Во время семяизвержения концентрированная суспензия сперматозоидов, хранящаяся в эпидидимисе, смешивается и разжижается с помощью жидкости желез дополнительной секреции мужского полового тракта. Эякулят подразделяют на несколько фракций. Сравнения объема эякулята из пре- и постсемявыносящего протока показали, что около 90% объема эякулята составляет секрет желез дополнительной секреции (Weiske, 1994), в основном простаты и семенных пузырьков, меньший вклад вносят луковично-уретральные железы (Куперовы) и эпидидимис. Семиологическая жидкость имеет два основных количественных показателя:

•общее количество сперматозоидов: оно отражает продукцию сперматозоидов яичками и потенцию посттестикулярной канальцевой системы;

•общий объем эякулята, состоящий из выделений желез дополнительной секреции: параметр отражает секреторную активность желез.

Качество сперматозоидов (их жизнеспособность, подвижность и морфология) и состав семенной жидкости также являются важными факторами для сперматологической функции.

Во время сексуального контакта первичная, богатая сперматозоидами фракция эякулята вступает в контакт с цервикальной слизью, находящейся во влагалище (Sobrero & MacLeod, 1962), другая фракция остается во влагалище в виде свободной жидкости. В отличие от естественных условий, в лаборатории весь эякулят собирают в один контейнер, где сперматозоиды формируют коагулят с протеинами семенных пузырьков. Этот коагулят затем разжижается под действием протеаз простаты, при этом осмолярность возрастает (Bjо¨rndahl & Kvist, 2003; Cooper et al., 2005). Получены некоторые свидетельства тому, что качество образцов семени варьирует в зависимости от того, как эякулят был собран. Эякулят, собранный посредством мастурбации в контейнер в специальной комнате близ лаборатории, может иметь более низкое качество по сравнению с эякулятом, полученным в неспермицидный презерватив по время коитуса в домашних условиях (Zavos & Goodpasture, 1989). Это различие может отражать различные формы сексуального возбуждения, так как время, потраченное на сбор образца семени посредством мастурбации — промежуток времени до эякуляции — также влияет

на качество эякулята (Pound et al., 2002).

Несмотря на условия сбора семени, качество эякулята зависит от факторов, которые обычно не могут быть изменены, такие как продукция сперматозоидов яичками, секрет желез и недавно перенесенное заболевание (особенно лихорадка), а также другие факторы, такие как время воздержания, которые следует записывать и принимать во внимание при интерпретации результатов.

Результаты расчета качества эякулята в лаборатории будут зависеть от следующих параметров.

8ЧАСТЬ I Исследование эякулята человека

•Собран ли полностью весь эякулят. Во время семяизвержения первая фракция семени в основном богата сперматозоидами с секретом

предстательной железы, при этом последующие фракции представляют собой секрет семенных пузырьков (Bjо¨rndahl & Kvist, 2003).

Именно поэтому потеря первой (богатой сперматозоидами) порции эякулята наиболее влияет на результаты семиологического анализа, чем потеря последующей порции.

•Активность желез дополнительной секреции; жидкости, которые разбавляют концентрированные эпидидимальные сперматозоиды при семяизвержении (Eliasson, 2003). Концентрация сперматозоидов напрямую не связана с возможностью продукции половых клеток яичками, так как на нее влияют функциональные возможности других репродуктивных органов; однако общий объем эякулируемых сперматозоидов (концентрация сперматозоидов, умноженная на объем эякулята) связан с яичками. Например, концентрация сперматозоидов в эякуляте молодых и пожилых мужчин может быть одна и та же, но

общее количество сперматозоидов может отличаться, так как и объем семиологической жидкости, и общее количество производимых сперматозоидов снижаются с возрастом, по крайней мере, в некоторых популяциях (Ng et al., 2004).

•Время от последней сексуальной активности. При отсутствии эякуляции сперматозоиды накапливаются в эпидидимисе, затем избыток клеток попадает в уретру и вымывается вместе с мочой (Cooper et al., 1993; De Jonge et al., 2004). Увеличение времени абстиненции не отражается на жизнеспособности сперматозоидов и состоянии хроматина (Tyler et al., 1982b; De Jonge et al., 2004), при этом нарушается функция эпидидимиса (Correa-Perez et al., 2004).

•Предпоследний период абстиненции. Так как эпидидимис не полностью опустошается при одной эякуляции (Cooper et al., 1993), некоторые сперматозоиды остаются со времени последней эякуляции. Это влияет на старение и качество сперматозоидов в эякуляте (Tyler et al., 1982a). Степень этого влияния трудно установить и его редко принимают в расчет.

•Размер яичек влияет на общее число сперматозоидов в эякуляте (Handelsman et al., 1984; WHO, 1987; Behre et al., 2000; Andersen et al., 2000). Тестикулярный объем отражает уровень сперматогенной активности, который также влияет на морфологию сперматозоидов (Holstein et al., 2003).

Комментарий: Наибольшие биологические вариации качества семени (Castilla et al., 2006) отражают многие факторы, перечисленные выше, и необходимо, чтобы все измерения эякулята были четкие.

Эти переменные и большинство неконтролируемых факторов объясняют хорошо известную внутрииндивидуальную вариацию качества семени (Baker & Kovacs, 1985; Alvarez et al., 2003). Рис. 2.1. показывает изменения во времени показателей эякулята, оцененные методами, рекомендуемыми ВОЗ, от пяти здоровых молодых добровольцев, участвующих в группе плацебо в эксперименте по изучению мужской контрацепции. Такая вариабельность должна быть учтена при интерпретации семиологического анализа.

10ЧАСТЬ I Исследование эякулята человека

Впериод с 30 до 60 мин после получения:

•Оценка разжижения и внешнего вида эякулята.

•Измерение объема эякулята.

•Измерение рН (если требуется).

•Подготовка нативного препарата для оценки микроскопических параметров, подвижности сперматозоидов и разведение образца, требуемое для подсчета количества половых клеток.

•Оценка «живые-мертвые» (если процент подвижных клеток низок).

•Приготовление мазка для оценки морфологии сперматозоида.

•Приготовление разведения эякулята для расчета концентрации сперматозоидов.

•Оценка количества сперматозоидов.

•Выполнение смешанной антиглобулиновой реакции (MAR-тест) (если требуется).

•Подсчет пероксидаза-положительных клеток (если округлые клетки присутствуют).

•Приготовление сперматозоидов для теста с иммунными шариками (если необходимо).

•Центрифугирование эякулята (если необходимо оценить биохимические маркеры).

В течение 3 часов после сбора эякулята:

•Доставка образцов в микробиологическую лабораторию (если необходимо).

После 4 часов после сбора эякулята:

•Фиксация, окраска и оценка мазков на предмет морфологии сперматозоидов.

Позднее в тот же день (или на следующий день, если образец заморозить)

•Оценка маркеров желез дополнительной секреции (если необходимо).

•Выполнение непрямого теста с иммунными шариками (если необходимо).

2.2Сбор образцов

2.2.1Подготовка

•Образцы следует собирать в специальной комнате вблизи лаборатории для того, чтобы исключить колебания температуры и контролировать время между сбором и анализом (см. Раздел 2.2.5 и 2.2.6).

•Образцы следует собирать при половом воздержании от 2 до 7 дней. Если необходимы дополнительные образцы, число дней половой абстиненции следует сохранять при каждом визите.

ГЛАВА 2 Стандартные тесты 11

•Мужчине следует дать четко написанные и устные инструкции, касающиеся сбора образца эякулята. В них следует подчеркнуть, что образец эякулята должен быть полностью собран, и что пациенту следует сообщить о любых потерях какой-либо фракции образца.

•Следующую информацию необходимо зафиксировать в сопроводительной форме (см. Приложение 6, раздел А6.1.): имя пациента, дата рождения и номер карты, период полового воздержания, дату и время сбора образца, потеря эякулята, любые трудности при получении семени, а также временной интервал между сбором семени и началом семиологического анализа.

2.2.2Сбор эякулята для диагностических или исследовательских целей

•Образец следует получать путем мастурбации и семяизвержения в чистый, с широким горлом контейнер из стекла или пластика, проверенного на нетоксичность для сперматозоидов (см. Бокс 2.1).

•Контейнер с образцом следует держать при температуре от 20° С до 37° С для того, чтобы избежать резких перепадов, которые могут по-

вредить сперматозоиды после эякуляции. Контейнер должен быть промаркирован фамилией пациента и идентификационным номером, а также датой и временем сбора образца.

•Контейнер с образцом помещают на стол или в инкубатор (37° С) для разжижения семени.

•Следует отметить в отчете, если образец собран не полностью, особенно, если первая, богатая сперматозоидами порция, была утеряна. Если образец собран не полностью, второй образец следует собирать после периода полового воздержания от 2 до 7 дней.

Бокс 2.1 Подтверждение возможности сбора образца семени в контейнер

Отберите несколько образцов семени с высокой концентрацией сперматозоидов и хорошей их подвижностью. Поместите половину каждого образца в контейнер с доказанной нетоксичностью (контроль), а другую половину образца в тестируемый контейнер. Оцените подвижность сперматозоидов (см. Раздел 2.5) через каждый час в течение 4 часов при комнатной температуре или при 37о С. Если никаких различий в каждой временной точке между контролем и тестируемым образцом не будет обнаружено (P<0,05 согласно парному t-тесту), тестируемый контейнер можно считать нетоксичным для

сперматозоидов и удовлетворяющим требованиям по сбору эякулята.

2.2.3 Стерильный сбор эякулята для вспомогательных репродуктивных технологий

Сбор эякулята выполняют аналогично получению семени для диагностических целей (см. Раздел 2.2.2), но контейнер с образцами, наконечники пипеток и пипетки для смешивания должны быть стерильными.

12ЧАСТЬ I Исследование эякулята человека

2.2.4 Стерильный сбор эякулята для микробиологического анализа

В данной ситуации микробиологическая контаминация от источников не семенного происхождения (то есть организмы-симбионты с кожи человека) должна быть исключена. Контейнер с образцами, наконечники пипеток и пипетки для смешивания должны быть стерильными.

Обследуемый должен:

•Помочиться.

•Вымыть руки и пенис с мылом для того, чтобы снизить риск контаминации образца организмами-симбионтами с кожи.

•Сполоснуть мыло.

•Высушить руки и пенис свежим одноразовым полотенцем.

•Собрать эякулят в стерильный контейнер.

Важно: Время между сбором образца семени и началом исследования в микробиологической лаборатории не должно превышать 3 ч.

2.2.5Сбор семени в домашних условиях

•Образец может быть собран в домашних условиях в исключительных случаях, таких как доказанная неспособность получить эякулят путем мастурбации в клинике или недостаточно соответствующие условия вблизи лаборатории.

•Мужчине следует дать четкие письменные и устные инструкции относительно сбора и транспортировки образца семени. Следует обратить внимание на то, чтобы весь эякулят был собран в контейнер, включая первую, богатую сперматозоидами фракцию, и что обследуемый должен сообщить о любых потерях какой-либо фракции эякулята. Следует отметить в отчете, если образец собран не полностью.

•Мужчине необходимо выдать предварительно взвешенный контейнер, с его именем и номером его медицинской карты.

•Пациент должен записать время получения образца и доставить его в лабораторию в течение 1 ч после эякуляции.

•Во время транспортировки в лабораторию образец следует хранить при температуре от 20о С до 37о С.

•В отчете следует отметить, что образец был собран в домашних условиях или в другом месте вне лаборатории.

2.2.6Сбор эякулята с помощью презерватива.

•Образец может быть собран в презерватив во время сексуального контакта только в исключительных случаях, таких как доказанная невозможность сбора семени посредством мастурбации.

•Только специальные нетоксичные презервативы, разработанные для сбора эякулята, могут быть использованы; такие презервативы коммерчески доступны.

ГЛАВА 2 Стандартные тесты 13

•Обследуемому следует дать информацию от производителя по использованию кондома, его закрытию и транспортировке в лабораторию.

•Пациенту следует записать время эякуляции и доставить образец в лабораторию в течение 1 ч после сбора.

•Во время транспортировки в лабораторию образец следует хранить при температуре от 20о С до 37о С.

•В отчете следует отметить, что образец был собран с помощью специального презерватива по время полового контакта в домашних условиях или в другом месте вне лаборатории.

Важно: Обычные латексные презервативы нельзя использовать для сбора образца, так как они содержат реагенты, которые влияют на подвижность сперматозоидов (Jones et al., 1986).

Комментарий 1: Прерванный половой акт является ненадежным способом сбора эякулята, так как первая порция эякулята, которая содержит максимальное число сперматозоидов, может быть утеряна. Более того, возможна клеточная и бактериологическая контаминация образца, а низкий рН влагалища может негативно отразиться на подвижности сперматозоидов.

Комментарий 2: Если мужчина не способен собрать эякулят, некоторую информацию о сперматозоидах можно получить, выполняя посткоитальный тест (см. Раздел 3.3.1)

2.2.7 Меры безопасности при работе с образцами

Образцы эякулята могут содержать возбудителей опасных инфекционных заболеваний (например, ВИЧ, гепатит, герпес), поэтому работа с ними требует предельной осторожности. Если образец должен быть использован для биоанализа, внутриматочной инсеминации (ВМИ), экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) или интрацитоплазматической инъекции в цитоплазму ооцита (ИКСИ) (см. Раздел 5.1) или если необходимо выполнить культивирование сперматозоидов для микробиологического анализа (см. Раздел 2.2.4), должны быть использованы стерильные материалы и методы. Следует строго придерживаться техники безопасности, описанной в Приложении 2; хорошая лабораторная практика (good laboratory practice) является основным принципом для безопасности лаборатории (ВОЗ, 2004).

2.3 Первоначальная макроскопическая оценка эякулята

Семиологический анализ следует начинать с простого осмотра эякулята после разжижения, желательно через 30 мин, но не более чем через 1 ч после семяизвержения для того, чтобы предотвратить дегидратацию или изменения температуры, которые могут влиять на качество эякулята.

14 ЧАСТЬ I Исследование эякулята человека

2.3.1 Разжижение

Сразу же после семяизвержения в специальный контейнер эякулят представляет собой обычно полутвердую коагулированную массу. В течение нескольких минут при комнатной температуре семенная жидкость обычно начинает разжижаться (становится водянистой), и со временем превращается в гетерогенную смесь с взвесями. По мере разжижения эякулят становится гомогенным и довольно водянистым, а в финальной стадии остаются только небольшие области коагуляции. Весь образец обычно разжижается в течение 15 мин при комнатной температуре, хотя редко разжижение может занимать до 60 мин и более. Если полного разжижения не произошло за 60 мин, это следует записать. Семиологические образцы, собранные в домашних условиях или посредством презерватива, нормально разжижаются за время доставки их в лабораторию.

В норме эякулят может содержать желеобразные гранулы (желатиновые тельца), которые не разжижаются; они не имеют никакого клинического значения. Присутствие в эякуляте волокон слизи, при этом, может повлиять на показатели семиологического анализа.

Важно 1: Разжижение можно видеть как макроскопически, как описано выше, так и микроскопически. Неподвижные сперматозоиды начинают двигаться, когда эякулят разжижен. Если неподвижные сперматозоиды наблюдают при микроскопической оценке, необходимо выделить больше времени для завершения процесса разжижения.

Важно 2:Во время разжижения аккуратное постоянное помешивание или вращение контейнера с образцом на двухмерном шейкере либо при комнатной температуре, либо в условиях инкубатора при 37оС может помочь достигнуть гомогенизации образца.

Важно 3: Если эякулят не разжижается в течение 30 мин, не следует приступать к семиологическому анализу, а следует подождать еще 30 мин. Если разжижение не произошло в течение 60 мин, продолжайте процедуру, как описано в Разделе 2.3.1.1.

2.3.1.1 Медленное разжижение

Иногда образцы могут не разжижаться, что делает оценку эякулята затруднительным. В этих случаях может быть необходимо механическое перемешивание либо воздействие ферментами.

1.Некоторые образцы можно подвергнуть разжижению с помощью добавления равного объема физиологического раствора (например, фосфатного буфера Дульбекко; Dulbecco’s phosphate-buffered saline; см. Приложение 4, раздел А4.2.) с последующим непрерывным пипетированием.

2.Неоднородность можно снизить многократным (6–10 раз) аккуратным пипетированием эякулята через иглу с тупым концом диаметром G18 (внутренний диаметр 0,84 мм) или G19 (внутренний диаметр 0,69 мм), прикрепленную к шприцу.

3.Добавление бромелайна, протеолитического фермента (ЕС 3.4.22.32), может способствовать разжижению (см. Бокс 2.2.).

ГЛАВА 2 Стандартные тесты 15

Бокс 2.2 Приготовление бромелайна

Подготовьте 10МЕ/мл бромелайна на фосфатном буфере Дульбекко (см. Приложение 4, раздел А4.2.); его достаточно трудно растворить, но с помощью помешивания большая часть частиц растворится в течение 15–20 мин. Разведите эякулят 1+1 (1:2) в 10 МЕ/мл бромелайна, перемешайте наконечником пипетки и инкубируйте при 37о С в течение 10 мин., смешайте образец тщательно перед дальнейшим анализом.

Комментарий: Эти процедуры могут влиять на биохимические показатели семенной плазмы, подвижность сперматозоидов и их морфологию, поэтому их использование должно быть записано. Разведение 1+1 (1:2) эякулята бромелайном должно быть учтено при расчете концентрации сперматозоидов.

2.3.2 Вязкость эякулята

После разжижения вязкость образца можно оценить с помощью аккуратной аспирации эякулята в одноразовую пластиковую пипетку с широким горлом (приблизительно 1,5 мм в диаметре), позволяя ему капать и наблюдая длину формирующейся нити. В норме эякулят выходит из пипетки небольшими дискретными каплями. Если вязкость аномальная, капля будет формировать нить более 2 см в длину.

Альтернативно, вязкость можно оценить с помощью введения стеклянной палочки в образец и наблюдать длину нити, которая формируется при выведении палочки из семени. Вязкость следует считать аномальной, когда длина нити превышает 2 см.

В отличие от частично не разжиженного образца, вязкость эякулята с гомогенной структурой не будет изменяться со временем. Высокую вязкость можно распознать по эластичным качествам образца, который сильно слипается при попытке его пипетирования. Методы снижения вязкости являются теми же самыми, что и при медленном разжижении (см. Раздел 2.3.1.1).

Комментарий: Высокая вязкость может препятствовать правильному определению подвижности сперматозоидов, их концентрации, определению сперматозоидов, покрытых антителами, и измерению биохимических маркеров.

2.3.3Внешний вид эякулята

Внорме разжиженный семиологический образец должен быть гомогенным, сероватого цвета, слегка опалесцирующим. Он может быть менее прозрачным, если концентрация сперматозоидов очень низкая; цвет может также быть различным, например, красно-коричневым, если в эякуляте присутствуют эритроциты (гемоспермия) или желтым, если мужчина болен желтухой или принимает некоторые витамины или лекарственные препараты.