6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Организация_и_проведение_учебного_процесса_по_подготовке_специалистов

•Приготовление суспензии из печени и селезенки (до 10 мышевидных грызунов в пробу).

•Посев 2- 3 капель суспензии на чашку ПА и ПА с генцианвиолетом.

•Постановка РПГА-РНАт на обнаружение F1 чумного микроба с суспензией органов.

•Постановка биопробы на белых мышах.

3анятие 18.

Исследование мокроты больного. Идентификация выделенной культуры.

•Учетпробысчумнымидиагностическимибактериофагами.

•Учет ферментативной активности культур на средах Гисса, ЦДС.

•Учет теста на подвижность.

•Учет чувствительности выделенной культуры к антибиотикам.

Исследованиеблохначуму.Идентификациявыделенной культуры.

•Изучение морфологии роста культуры на ПА и в бульоне.

•Приготовление и просмотр мазков, окрашенных по Граму.

•Постановка пробы с диагностическими чумными бактериофагами.

Исследование грызунов. Выделение культуры.

•Просмотр посевов на пластинчатом агаре под малым увеличением микроскопа.

•Обработка части мазков-отпечатков люминесцирующей чумной сывороткой и части - по Граму.

•Серологические исследования материала.

•Постановка РПГА и РНАг на выявление антител против F1 с высушенными образцами крови.

367

•Постановка РПГА и РНАт на выявление F1 в обработанных формалином суспензиях.

3анятие 19.

Исследование мокроты больного. Идентификация выделенной культуры.

•Регистрация ферментации углеводов на средах Гисса.

•Постановка пробы на пестициногенность (приложение).

•Постановка реакции на нитриты с реактивом Грисса (приложение).

Исследование блох. Идентификация выделенной культуры.

• Учет пробы с чумным фагом.

Исследованиегрызунов.Выделениечистойкультуры.

•Просмотр посевов от грызунов на пластинчатом агаре.

•Отсев похожих на рост возбудителя чумы колоний на сектора чашки ПА и в бульон.

•Серологическоеисследованиематериалаотгрызунов.

•Учет серологических реакций.

3анятие 20.

Окончание исследования мокроты больного.

•Просмотр пробы на пестициногенность.

•Вскрытие биопробных животных.

•Изучени патологоанатомической картины.

•Приготовление мазков-отпечатков из органов и лимфоузлов биопробных животных.

•Обработка мазков-отпечатков люминесцирующей чумной сывороткой, окрашивание по Граму и синькой Леффлера.

•Посев печени, селезенки, лимфоузелов на чашку ПА, кровь - в бульон.

368

•Заключение по анализу, заполнение паспорта на культуру, выделенную из мокроты.

Окончание исследования блох.

•Вскрытие биопробных животных.

•Описание патологоанатомической картины.

•Приготовление мазков-отпечатков из органов и лимфоузлов.

•Посев печени, селезенки, лимфоузелов на чашку ПА, кровь - в бульон.

•Заключение по анализу.

Исследование грызунов. Идентификация выделенной культуры.

•Просмотр роста выделенной культуры на секторах пластинчатого ПА.

•Проверка отобранной культуры на чистоту роста мазком, окрашенным по Граму.

•Постановка пробы с диагностическим чумным бактериофагом Л-413С.

•Посев на среды Гисса с глюкозой, лактозой, арабинозой, рамнозой, глицерином; ЦДС и в 0,3% ПЖА.

Занятие 21. Окончание исследования грызунов.

•Изучение морфологии роста выделенной культуры на ПА и ПБ.

•Учет результатов постановки пробы с диагностическим чумным бактериофагом Л- 413С.

•Учет биохимической и уреазной активности, подвижности.

•Заключение по исследованию, обеззараживание по-

севов.

Выделение культуры из фагированного материала.

На агаровую пластинку перед посевом наносят 1-2 капли цельной антифаговой сыворотки (0,05-0,1 мл),

369

тщательно растирают ее стеклянным шпателем по всей поверхности агара и дают постоять 15-30 мин, чтобы сыворотка впиталась. Посевы на такой агар производят общепринятым способом.

Посев органов грызунов на чашку ПА, обработанную и не обработанную антифаговой сывороткой.

Занятие 22.

Выделение культуры из фагированного материала.

•Просмотр роста культуры на чашках ПА, обработанной и не обработанной антифаговой сывороткой.

•Пересев выросшей культуры с чашки ПА, обработанной антифаговой сывороткой на две новые чашки ПА, обработанные и не обработанные антифаго-

3анятие 23.

Выделение культуры из фагированного материала.

•СравнениеростакультурначашкахПА,обработанных и не обработанных антифаговой сывороткой.

•Выделение культуры закончено, если рост на той

или другой чашке идентичен.

Экспрессные и ускоренные методы обнаружения чумного микроба в исследуемом материале (исследование смыва с объектов внешней среды)

Люминесцентно - серологический метод.

•Приготовлениемазковизисследуемогосмыва,фиксация, обработка люминесцирующей чумной сывороткой с альбумином, меченым родамином.

•Просмотр мазков.

Реакции с эритроцитарным чумным диагностикумом.

•Постановка РПГА в трех лунках с обеззараженным кипячением в течение 5 мин исследуемым материалом и антительным эритроцитарным чумным диа-

370

гностикумом.

•Постановка РТПГА в трех лунках с антительным эритроцитарным чумным диагностикумом.

•ПЦР-анализ.

•Исследование материала иммунохроматографическим методом.

10.3. Приложение Определение пестициногенности

На поверхность чашки 1,5% агара Хоттингера посеять 1-2 суточные агаровые культуры исследуемых штаммов бляшками диаметром 0,5 см. Для контроля на один из секторов засеять заведомо пестициногенный штамм. Посевы инкубировать при 28°С в течение 48-72 ч. На крышку чашки Петри положить ватный тампон, смоченный хлороформом, для стерилизации колоний. Через 1 ч тампоны удалить, чашку приоткрыть и выдержать до исчезновения запаха хлороформа 20-30 мин. Затем на поверхность агаровой пластины вылить 4,5 мл расплавленного и остуженного до 40-45°С 0,7% агара, содержащего 0,5 мл 3-4-часовой бульонной культуры индикаторного штамма. В качестве индикаторных штаммов могут быть использованы культуры бактерий псевдотуберкулеза (1серовара) и чумы (рамнозоположительные). Посевы инкубировать при 37°С. Учет результатов через 24-48 ч. У пестициногенных культур вокруг бляшек отсутствует рост индикаторного штамма.

Определение чувствительности к бактериофагам двухслойным методом

В пробирку с 4,5мл 0,7% агара (любая питательная основа) рН 7,2±0,1, предварительнорасплавленного и остуженного до температуры 47±1°С, добавить 0,1 мл 1x109 м.к./мл (по ОСО в 10 ед) 18-19-часовой агаровой культу-

371

ры исследуемого штамма и после равномерного перемешивания вылить на пластину с1,5-2,0%-ным агаром Хоттингера. Чашку подсушить 20 мин с полузакрытой крышкой при комнатной температуре и нанести по одной капле (0,02-0,03 мл) или одной петле диаметром 2 мм бактериофаги: чумной Покровской, чумной Л-413С и псевдотуберкулезный. После подсыхания капель чашки перевернуть агаром вверх и инкубировать при температуре 28±1 ºС. Результаты учитывают через 18 ч, в экстренных случаях - через 12 ч.

Наличие лизиса в виде одного стерильного пятна или четко контурированного «мутного» пятна, или группы мелких пятен на месте нанесения бактериофагов оценивают как положительный результат.

Определение чувствительности к бактериофагу Покровскойметодомдифференциальногорабочеготитра

ДРТ бактериофага чумного - наибольшее разведение бактериофага, одна капля которого способна образовывать «стерильное» пятно на газоне со штаммами чумного микроба и не образовывать в этом разведении «стерильных» пятен со штаммами псевдотуберкулезного микроба.

Дно чашки с1,5-2% питательным агаром рН 7,2±0,1 расчертить на 8 квадратов. В пробирку с 4,5 мл 0,7%- ного агара расплавленного и остуженного до температуры 46-47 ºС добавить 0,2 мл 18-20 часовой бульонной культуры испытуемого штамма, и после перемешивания вылить на подготовленную чашку. На застывший агар с культурой нанести петлей диаметром 2 мм капли цельного и разведения чумного бактериофага 10−1, 10−2, 10−3, 10−4, 10−5, 10-6 и 10−7. После подсыхания капель чашки перевернуть и инкубировать при температуре 28±1 ºС в течение 19+1 ч.

Исследуемая культура является чумным микробом,

372

если она лизируется в ДРТ и выше бактериофагом чумным Покровской. Если исследуемая культура лизируется бактериофагом в разведении ниже ДРТ, то вопрос о принадлежности ее к чумному и псевдотуберкулезному микробу должен быть решен с помощью дифференциальных тестов.

Ускоренный метод пробы с чумным бактериофагом

Исследуемый материал нанести на 3 чашки со средой Туманского:

-на 1 чашку – одну каплю исследуемого материала и одну каплю чумного фага, растереть шпателем;

-на 2 чашку засеять материал, а затем у края чашки нанести каплю фага и дать ей стечь в виде «дорожки»;

-на 3 чашку (контрольную) внести только материал и сделать его рассев.

При наличии в исследуемом материале возбудителя чумы отмечают: на 1чашке - стерильные пятна, на 2- стерильную «дорожку» на месте нанесения фага, на 3- типичныеколонии возбудителя чумы.

Определение фибринолитической активности

Нативную плазму (человеческую) или цитратную кроличью предварительно оттитровать с культурой штамма Y. Pestis EV в разведениях 1:6, 1:8, 1:10. Плазмуврабочемразведенииразлитьпо0,5млвпробирки. Затем приготовить взвесь бактерий из односуточной культуры, содержащую 109 м.к./мл, и внести 0,25 мл взвеси в пробирку с плазмой, перемешать и добавить 0,1 мл 0,5% стерильного раствора хлористого кальция.

Вкачестве контролей используют:

1)0,5 мл плазмы в рабочем разведении, 0,25 мл 0,9% раствора хлористого натрия рН 7,2 и 0,1 мл 0,5% хлористого кальция (отрицательный);

2)0,5 мл плазмы, 0,25 мл взвеси одно-двух суточной агаровой культуры Y. рestis EVи 0,1 мл 0,5% стериль-

373

ного раствора хлористого кальция (положительный). Посевы инкубируют при 37°С. Через 40-60 мин проверяют образование сгустка. Если за 60 мин сгусток не образовался, реакцию следует повторить. Учет результатов произвести через 18-20 ч. В положительном случае наблюдается различная степень расплавления сгустка.

Определение плазмокоагулазной активности

Цельную нативную человеческую или цитратную кроличью плазму разлить по 0,5 мл в пробирки и затем в каждую из них засеять полную петлю диаметром 1 мм одно-двух суточной культуры исследуемых штаммов.

Вкачестве контролей использовать:

1)0,5 мл плазмы и петлю агаровой культурыY. pestis

EV (положительный);

2) 0,5 мл плазмы без каких-либо добавлений (отрицательный).

Посевы инкубировать при 28°С. Учет производить через каждый час с просмотра контролей. Плазма без культуры должна быть жидкой, а в пробирке с Y. Pestis EV через 1-2 ч образуется сгусток. Если через 2-3 ч сгусток не образовался, наблюдение продолжать до 24 ч, после чего, в случае отсутствия сгустка, пробу на плазмокоагулазу надо считать отрицательной.

Рост на ЦДС

Среда предназначена для дифференциации бактерий по их способности ферментировать глюкозу, лактозу и мочевину. Комплексный индикатор Андреде и бромтимоловый синий при кислой реакции окрашивает среду в оранжевый цвет, при щелочной – в синий. Незасеянная среда имеет темно-зеленый цвет.

В среде глюкоза содержится в малой концентрации (0,1%), поэтому в скошенной части агара (аэроб-

374

ные условия) бактерии утилизируют ее полностью в первые часы роста. К моменту учета реакции (24-48 ч) для своего питания микроорганизмы используют уже пептоны, имеющиеся в среде в качестве белковой питательной основы. При этом происходит образование аммиака и подщелачивание среды (синий цвет). В столбике (анаэробные условия) сохраняются кислые продукты расщепления глюкозы (оранжевый цвет). Таким образом, бактерии, ферментирующие глюкозу без газообразования и не ферментирующие лактозу и мочевину, через 24-48 ч изменяют столбик в оранжевый цвет без разрывов, а скошенную поверхность

– в сине-зеленый. Бактерии, сбраживающие глюкозу и лактозу, вызывают подкисление всей среды (столбик и скошенная часть оранжевые). Лактоза входит в состав среды в концентрации, превышающей в 10 раз концентрацию глюкозы (1%), вследствие чего кислая реакция через 24-48 ч сохраняется не только в столбике, но и в скошенной части среды.

Присутствие в среде мочевины позволяет определять наличие у бактерий фермента уреазы. Расщепление мочевины завершается выделением аммиака (NH3), под действием которого вся среда приобретает синий цвет. Учет ферментации углеводов при этом невозможен. Посев проводят вначале по скошенной части в виде прямой линии, затем в толщу агарового столбика и заканчивают по скошенному агару штрихом. Укол в толщу агарового столбика не должен достигать дна с тем, чтобы не нарушить условия для сбраживания глюкозы в относительно анаэробных условиях. Посевы инкубируют при 28°С. Результаты учитывают через 24-48 ч.

375

11. ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА БРУЦЕЛЛЕЗА

11.1. Биологические свойства возбудителя бруцеллеза

Возбудитель бруцеллеза относится к роду Brucella, который входит в группу грамотрицательных, аэробных/микроаэрофильных палочек и кокк­ ов к альфа 2 подгруппе класса Proteobacteria. Бруцеллы являются грамотрицательными, факультативными внутриклеточными патогенами, вызывающими заболевание у большого числа животных и человека. Род Brucella состоит из 7 самостоятельных видов, различающихся по биохимическим­ , метаболическим, антигенным и вирулентным характеристикам: Brucella melitensis (преимущественно поражает коз и овец), Brucella abortus (преимущественно вызывает заболевание у крупного рогатого скота), Brucella suis (преимущественно инфицирует свиней), Brucella neotomae (вызыв­ ает поражение кустарниковый крыс), Brucella ovis (вызывает эпидидимиты у баранов), Brucella canis (инфицирует собак) и недавно выделенный вид - Brucella maris (поражает морских млекопитающих). Некоторые виды бруцелл подразделяют на биовары. Для В. melitensis известны 3 биовара, для В. suis - 5 биоваров, и 7 биоваров для В. abortus. В. maris подразделяют на 2 биовара - cetaceae (выделяют от китообразных) и pinnipediae (выделяют от ластоногих).

Морфологически все виды и биовары бруцелл не отличаются друг от друга. Они имеют вид мелких нежныхпалочек,овоиднойилислегкаудлиненнойформы. При сравнительном изучении морфологии бруцелл в электронн­ ом микроскопе клетки В. melitensis преимущественно имеют кокковидную форму, В. abortus и В. suis - палочковидную. Размер бруцелл кокковидных форм 0,3-0,6 мкм, палочков­ идных - 0,6-1,5 мкм.

376