6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Организация_и_проведение_учебного_процесса_по_подготовке_специалистов

* - методы и критерии оценки стандартизованы для холерного вибриона

Определение антибиотикограммы холерных вибрионов, выделенных от первых больных, необходимо проводить методом серийных разведений, поскольку этот метод позволяет диференцировать не только высокую чувствительность или высокую степень резистенстности культур к антибактериальным препаратам, но и выявлятьпромежуточныезначенияминимально-пода- вляющей концентрации (МПК) препарата. Дискодиффузионный метод используют как ориентировочный при изучении чувствительности к антибактериальным препаратам последующих культур холерных вибрионов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ЗАНЯТИЯ Занятие 1.

Изучение культурально-морфологических, биохимических и серологических свойств V. cholerae cholerae

и V. cholerae eltor

• Изучение характера роста культур на скошенном МПА.

• Посев агаровых культур секторами на одну чашку МПА, селективные среды (Монсура, СЭДХ и др.), пробирки со скошенным МПА, лактозо-сахароз-

237

ной средой, МПБ, 1% ПВ, 0,3% полужидким агаром (ПЖА), средами Гисса с сахарозой, маннозой, арабинозой, крахмальной средой с индикатором Андреде, средой Кристенсена и желатиной.

•Посев смеси культур холерного вибриона и кишечной палочки секторами на МПА и селективные среды (Монсура, СЭДХ и др.).

•Изучение культуры в слайд-агглютинации с холерными сыворотками О1, РО, Инаба и Огава.

•Слайд-агглютинацию ставят на обезжиренном стекле, помещенном в чашку Петри, используя подозрительную на холерный вибрион колонию и/или агаровую 12-18-часовую культуру и сыворотки О1 серогруппы в разведении 1:50-1:100, Инаба и Огава в разведениях 1:50. Сыворотку О139 разводят в соответствии с указанием на этикетке. Реакцию обязательно сопровождают контролями культуры в физиологическом растворе.

•Постановка с V.cholerae cholerae и V. cholerae eltor

развернутой реакции агглютинации (РА), исполь-

зуя холерные сыворотки О1, РО, Инаба и Огава. (приложение).

Примечание:

Все посевы поместить при 37 ºС, желатину - при комнатной температуре.

Занятие 2.

Изучение культурально-морфологических, биохимических и серологических свойствV. cholerae cholerae

и V. cholerae eltor

• Изучение характера роста культур на МПБ и 1% ПВ.

• Изучение морфологии колоний на МПА и селективных средах.

• Сравнение характера роста холерных вибрионов и

238

кишечной палочки на МПА и селективных средах.

•Изучение морфологии клеток в окрашенных по Граму мазках, приготовленных из агаровой (МПА) и бульонной культур.

•Изучение подвижность вибрионов:

•в 0,3% ПЖА.

•в препарате «раздавленная капля», приготовленном из агаровой и бульонной культур (в поле зрения светового и фазово-контрастного микроскопа).

•Определение у культур ферментативной группы Хейберга по результатам разложения сахарозы, маннозы, арабинозы.

•Определение характера изменения лактозо-сахароз- ной среды.

•Определение у культур диастатической активности по результатам ферментации крахмала.

•Определение у культур уреазной активности по результатам изменения среды Кристенсена.

•Провести предварительный учет протеолитической активности.

•Провести учет результата РА: установить принадлежность изучаемых культур к V. cholerae О1 серогруппе, определить серовар.

•Изучение дифференциальных признаков биова-

ров V. cholerae cholerae и V. cholerae eltor

•Постановка пробы с холерными диагностическими бактериофагами классическим и эльтор двухслойным методом.

•Посев 3-часовой бульонной культуры на МПА с 50 ед/мл полимиксина (приложение).

•Постановка гемагглютинации.

•Посев агаровых культур в бульон Кларка.

239

Занятие 3.

Изучение дифференциальных признаков биоваров V. cholerae cholerae и V. cholerae eltor

•Учет пробы с диагностическими холерными фагами классическим и эльтор (приложение).

•Учет пробы с полимиксином.

•Постановка реакции Фогес-Проскауэра.

•Посев культуры в 20-30 мл МПБ (для изучения чувствительности к антибиотикам).

•Изучение эпидемической значимости V. cholerae eltor комплексным методом

•Подготовка 3-часовой бульонной культуры

•Постановка пробы с фагами ctx+ и ctx-(приложение).

•Постановка пробы Грейга (приложение).

Занятие 4.

Изучение эпидемической значимости v. cholerae eltor комплексным методом

•Учет пробы Грейга.

•Учет пробы с фагами ctx+, ctx- и определение эпидемической значимости культуры по таблице.

•Определение оперона гена токсинообразования холерных вибрионов с использованием полимеразной цеп-

ной реакции (ПЦР).

Экстрагирование ДНК из выделенной культуры. Для этого прокипятить суспензию клеток вибрионов в дистиллированной воде (107 КОЕ/мл) 30 мин. При этом клеточная стенка холерного вибриона легко разрушается и освобождается ДНК, одновременно происходит обеззараживание образца. После кипячения использовать образец в ПЦР в количестве 3–5 мкл на 25 мкл амплификационной смеси.

Приготовлениеамплификационной смесиипоставкаПЦР.

240

На одну пробу необходимо:

-2 мкл 10х ПЦР-буфера;

-1,5 мкл 2,5 мМ раствора дНТФ;

-1,5 мкл 25 мМ MgCl2;

-по 10 pmol каждого праймера (обычно по 0,5-1 мкл). Для оценки эпидзначимости штаммов используют

два праймера для детекции ctxAB:

P1 5’- TGA AAT AAA GCA GTC AGG TG – 3’ P3 5’ - GGT ATT CTG CAC ACA AAT CAG - 3’

-для детекции tcpA:

В реакцию взять эквимолярное количество праймеров. Расчет концентрации провести в зависимости от оптической плотности и количества оснований в олигонуклеотидах по следующей формуле:

C (pmol/m1)= A260 / (0,01хN), где:

A260 - поглощение раствора праймера при 260 нм; N - число оснований в одном праймере;

0,2 мкл Taq-ДНК-полимеразы;

стерильной бидистиллированной воды до 22 мкл (в зависимости от количества вносимых праймеров). Приготовить общую амплифицированную смесь

идве пробы (положительный и отрицательные контроли), перемешать пипетированием и внести в амплификационные пробирки по 22 мкл в каждую. Исследуемые образцы в количестве 3 мкл внести в соответствующие пробирки с амплификационной смесью, используя отдельные наконечники для каждого образца, после чего смесь перемешать пипетированием

инаслоить 40-50 мкл вазелинового масла (три капли из наконечника объемом 200 мкл).

Вкачестве положительного контроля применить 3 мкл образца ДНК, экстрагированной методом кипячения из суспензии клеток штамма V.cholerae eltor

М-878, с концентрацией 1х107 КОЕ/мл. В качестве от -

241

рицательного контроля использовать 3 мкл дистиллированной воды.

Амплификацию проводить в термоциклере по следующей программе:

стартовая денатурация 94 ºС - 2 мин далее 35 циклов 94 оС - 45 сек

57 оС - 45 сек

72 оС - 45 сек заключительная элонгация 72 оС - 10 мин

Примечания: Солевой ПЦР-буфер, раствор дНТФ, раствор MgCl2, праймеры, Taq-ДНК-полимеразу хранят при -10 оС или -20 оС и размораживают (кроме Taq-ДНК-полимеразы) только перед приготовлением амплификационной смеси; Учет результата амплификации.

По окончании программы амплификации анализируемые образцы смешать с 2-2,5 мкл раствора для нанесения проб и внести в лунки горизонтального агарозного геля плотностью 1,3%. Электрофорез проводить в 1х ТВЕ-буфере в присутствии бромистого этидия в концентрации 0,5 мкг/мл, при напряженности 6 В/см в течение 1 ч, не допуская выхода красителя бромфенолового синего из геля. Затем - просмотр геля в ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе.

Амплифицированные фрагменты идентифицируют по размеру, сравнивая флюоресцирующие в геле полосы анализируемых образов с полосами положительного контроля или в соответствии с маркерами молекулярного веса.

Оценка результатов:

В случае обнаружения в одной пробе амплифицированных фрагментов размером 777 н.п. (ctxAB оперон), соответствующий штамм расценивается как эпидемически опасный. Проба с отрицательным контролем не

242

должна иметь флюоресцирующих фрагментов в геле.

Занятие 5.

Изучение чувствительности V. cholerae cholerae и V. cholerae eltor к антибиотикам

•Опредение чувствительности культур к антибиотикам методом диффузии в агаре, используя 18-20-ча- совую бульонную культуру.

•Определение чувствительности культур к тетрациклину методом серийных разведений в жидкой питательной среде, используя 18-часовую бульонную культуру.

Занятие 6.

Изучение чувствительности V. cholerae cholerae и V. cholerae eltor к антибиотикам

•Учет результата изучения чувствительности культур к антибиотикам по зонам задержки роста вокруг дисков антибиотиков.

•Определение чувствительности (устойчивости) культур к антибиотикам методом диффузии в агаре по таблице 16.

•Учет результата изучения чувствительности культур к тетрациклину методом серийных разведений в жидкой среде. Определение МПК антибиотика в отношении изучаемых культур. Оценка результата по таблице 16.

Занятие 7.

Дифференциация некоторых представителей семей-

ства Vibrionaceae (Vibrio,Aeromonas, Plesiomonas)

•Изучение морфологии колоний на МПА V. cholerae

не О1, Aeromonas, Plesiomonas.

243

•Изучение морфологиии микробных клеток в мазках, окрашенных по Граму.

•Изучение подвижности:

•- в 0,3% ПЖА (посейте каждую культуру в пробирку ПЖА).

•- в препарате «раздавленная капля», приготовленном из агаровой культуры.

•Определение оксидазной активности.

•Посев культуры на среду Хью-Лейфсона.

•Посев культуры на среды Гисса с маннитом, инозитом, сахарозой, маннозой, арабинозой.

•Посев культуры на среду Биргер-Крушинской с лизином, орнитином и аргинином.

•Посев культуры на среду Кристенсена.

•Изучение лецитиназной активности. Посев культуры секторами на одну чашку желточного агара.

•Изучение протеолитической активности. Посев культуры уколом в столбик желатины.

Занятие 8.

Дифференциация некоторых представителей семей-

ства Vibrionaceae (Vibrio,Aeromonas, Plesiomonas)

•Учет характера роста культур в 0,3% ПЖА

•Определение типа утилизации глюкозы по результатам изменения среды Хью-Лейфсона.

•Просмотр результатов изменения сред Гисса с маннитом, инозитом, сахарозой, маннозой и арабинозой.

•Учет декарбоксилирования культурами аминокислот.

•Учет уреазной активности на среде Кристенсена.

•Просмотр результата изучения лецитиназной активности.

•Учет протеолитической активности.

•Сравнение полученных результатов с таблицей 14.

244

7.2.Бактериологический анализ

Всистемепротивохолерныхмероприятийсущественное значение имеют лабораторные методы исследования, среди которых основным является бактериологический, направленный на обнаружение возбудителей холеры – V. cholerae О1 и О139 серогрупп. Бактериоло-

гический анализ проводится с диагностической целью и по эпидемиологическим показаниям.

Объектами исследования могут быть испражнения, рвотные массы, желчь, трупный материал (отрезки тонкого кишечника, желчный пузырь), различные предметы, загрязненные выделениями больного, вода, пищевые продукты, обитатели водоемов и другие объекты окружающей среды.

Забор, доставка и порядок исследования материала проводятся в соответствии с действующими методическими указаниями МУ 4.2.2218-07 «Лабораторная диагностика холеры» (2007 г.)

Алгоритм бактериологического исследования на холеру основан на поэтапном использовании жидкой накопительной среды (1% ПВ, 1% ПВ с теллуритом калия) с последующим высевом из неё на плотные щелочные агары (мясо-пептонный, Мартена, Хоттингера), элективные дифференциально-диагностические среды (TCBS, СЭДХ, Монсура, Седук и др.) и набор сред для идентификации. Используемые для диагностики холеры питательные среды подлежат бактериологическому контролю в установленном порядке.

Агаровые среды перед использованием должны быть тщательно подсушены. Посев делают так, чтобы получить рост в виде изолированных колоний. Все посевы инкубируют при температуре 37,0 ±0,5°С. Посевы исследуемого материала на всех этапах выращивают в 1%-й пептонной воде 6 - 8 ч, в пептонной воде с теллу-

245

ритом калия - 12 - 18 ч, на щелочном агаре - не менее 14 - 16 ч, а на плотных элективных средах - 18 - 24 ч.

Исследование клинического материала.

НаIэтапебактериологическогоанализаиспражнений и рвотных масс больного, содержимого кишечника и желчного пузыря трупа лиц, умерших от холеры, исследуемый материал в количестве 0,5-1 мл засевают пипеткой в 50-100 мл 1% ПВ (I-ая среда накопления) и петлей на пластинку щелочного агара и одну из элективных сред. Целесообразно на этом этапе применить ускоренные методы исследования (МФА, РИВ и ПЦР со специфическими праймерами).

При исследовании материала от больных, подозрительных на заболевание холерой, не допускается в качестве накопительной среды использование 1% пептонной воды с теллуритом калия.

Материал от подозрительных на вибриононосительство засевают в 50 мл среды накопления при индивидуальных анализах и в 100 мл – при групповых, объединяя в один флакон по 0,5-1 мл пробы не более чем от 5 человек. К групповым посевам прибегают в редких случаях при проведении массовых обследований на вибриононосительство.

Материал, доставленный в 5 мл 1% пептонной воды, полностью используется для посева в 50 мл среды накопления. В случае поступления в лабораторию материала, забранного в 50 мл 1% пептонной воды во флаконе и доставки его не позже 2 ч после забора пробы, флакон помещают в термостат на 6 ч для накопления возбудителя. При доставке материала в более поздние сроки 5 мл его засевают в 50 мл 1% пептонной воды. В отдельных случаях при бактериологическом исследовании материала от лиц, принимавших антибио-

246