6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Организация_и_проведение_учебного_процесса_по_подготовке_специалистов

АТ индикаторной системы и произойдет гемолиз - в пробирке «лаковая кровь», осадка эритроцитов нет. Интенсивность РСК оценивают по четырехкрестной системе в зависимости от степени задержки гемолиза и наличия осадка эритроцитов. Реакция сопровождается соответствующими контролями: контроль сыворотки (без АГ) и контроль АГ (без сыворотки), так как некоторые сыворотки и некоторые АГ обладают антикомплементарным действием. Перед постановкой РСК все компоненты, участвующие в ней, за исключением исследуемой сыворотки или АГ, подвергаются тщательному титрованию. Особенно важно ввести в реакцию точную дозу комплемента, так как его нехватка или избыток могут привести к ложным результатам! Титром комплемента является то его минимальное количество, которое в присутствии рабочей дозы гемолитической сыворотки обеспечивает полное растворение эритроцитов. Для постановки основного опыта берут дозу комплемента, увеличенную на 20-25% по сравнению с установленным титром. Титром гемолитической сыворотки является то ее максимальное разведение, которое, будучи смешано с равным объемом 10% раствора комплемента, полностью гемолизирует соответствующую дозу эритроцитов в течение 1 ч при 37°С. В основной опыт берут сыворотку, разведенную до 1/3 своего титра.

Непрямая реакция гемолизаиспользуется как уско-

ренный метод обнаружения специфических АТ. В качестве носителя АГ используют эритроциты. При наличии в сыворотке больного специфических АТ сенсибилизированные эритроциты в присутствии комплемента лизируются.

187

5.1.8. Реакции нейтрализации

Этот тип иммунологических реакций основан на способности АТ специфически подавлять (нейтрализовать) биологическую активность возбудителя или его токсинов в различных тест-системах - организме животных, в куриных эмбрионах, культурах клеток или каким-то иным способом. Это зависит от природы возбудителя и цели исследования. Например, для оценки эффективности иммунизации против дифтерии и столбняка определяют уровни антитоксинов в сыворотке крови привитых по их способности нейтрализовать биологическое действие определенной дозы токсина (реакция Шика). Широкое применение они получили в диагностике ботулизма, в вирусологической практике как для серологической диагностики вирусных заболеваний, так и для идентификации вирусов. С этой целью используют реакции нейтрализации роста вирусов в культуре ткани, подавления бляшкообразования, гемадсорбции, торможения гемагглютинации (РТГА) и др.

6. ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ЭНТЕРОБАКТЕРИОЗОВ

Прежде, чем приступить к работе с возбудителями особо опасных инфекций (чума, туляремия, холера, сибирская язва, бруцеллез), слушателям предлагается изучение биологических свойств представителей родовых групп семейства Enterobacteriaceae, а также современных методов обнаружения, выделения и идентификации наиболее значимых в патологии человека микроорганизмов основных родов: Escherichia, Shigella и Salmonella.

6.1. Характеристика семейства Enterobacteriaceae

188

Названиесемейства Enterobacteriaceae (enteron - кишка) связано с тем, что средой обитания для большинства бактерий является кишечный тракт позвоночных животных и человека. В организме человека многие энтеробактерии находятся в состоянии микробных биоценозов толстой и тонкой кишок. При изменении условий существования они могут вызывать заболевания. Это так называемые условно-патогенные бактерии. Патогенные виды встречаются только у больных и бактерионосителей. С испражнениями людей и животных энтеробактериипопадают в окружающую среду, где могут сохраняться длительное время.

Микроорганизмы, принадлежащие к семейству энтеробактерий, многочисленны и разнообразны по биологическим свойствам. Их классификация и номенклатура многократно подвергались и подвергаются ревизии, дополнениям и изменениям.

Согласно определителю бактерий Берджи (1997 г., перевод 9-го американского издания 1994 г.), семейство Enterobacteriaceae включает в себя 31 род, среди которых Escherichia, Shigella, Salmonella, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter, Hafnia, Serratia, Morganella,

Proteus, Yersinia, Edwardsiella и другие. Основными свойствами, характеризующими семейство энтеробактерий, являются палочковидная форма (ширина - 0,3-1,0, длина - 1,0-6,0 мкм), наличие общего антигена Кунина, грамотрицательная окраска, расщепление глюкозы ферментацией, способность восстанавливать нитраты в нитриты (за исключением некоторых штаммов Yersinia, Erwinia), наличие каталазы (кроме S. dysenteriae серовара 1), отсутствие оксидазы и спо - собности к спорообразованию, содержание Г+Ц в ДНК

- 39-59 моль%.

Идентификация энтеробактерий по родам осущест-

189

вляется на основе морфологических, физиологических и биохимических признаков, а также генетического анализа микроорганизмов. Особое место отводят ферментативным свойствам, так как именно они служат первоочередной основой для идентификации в пределах семейства (табл. 7). Эти свойства признаны наиболее стабильными. Для бактерий каждого рода характерен определенный спектр биохимических признаков, выявление которых технически не сложно и позволяет получать достаточно наглядные результаты. Разработана схема, включающая минимум наиболее значимых тестов (минимальный дифференцирующий ряд), необходимых для получения достоверных результатов идентификации энтеробактерий.

Таблица 7 Дифференциация родовых групп Enterobacteriaceae

по биохимическим свойствам

190

Примечание: + положительная реакция; (+) замедленно положительная реакция (позже 24 ч); - отрицательная реакция; х - различные результаты реакции

При установлении родовой принадлежности культур используют серологические тесты с соответствующими поливалентными сыворотками. Достаточно полно изучена антигенная характеристика таких бактерий как сальмонеллы, шигеллы, эшерихии, цитробактеры, отчасти протеи и клебсиеллы. Из числа известных антигенов энтеробактерий для идентификации имеют значение: липополисахаридные (О), жгутиковые (Н) и капсульные полисахаридные (К) антигены.

Дополнительным тестом для подтверждения принадлежности культур к патогенным энтеробактериям служат пробы с соответствующими поливалентными родоспецифическими бактериофагами. Для внутривидовой дифференциации бактерий используют серологические признаки, анализ плазмидного состава, отношение к бактериофагам и колицинам и некоторые другие тесты.

В последние годы в практике бактериологических лабораторий для экспрессной идентификации энтеробактерий все большее применение находят API-тесты, биохимический экспресс-анализатор «ATB identification» фирмы Bio-Merieux (Франция), тест-система BBL

191

«Crystall» фирмы Becton Dickinson (Германия), а так-

же идентификатор микроорганизмов Micro Tax фирмы SY-LAB (Австрия) и микробиологический анализатор

Vitek-2 Compact (Bio-Merieux, Франция). В референс-

лабораториях и научно-исследовательских учреждениях эффективно применяют методы генетических зондов и полимеразую цепную реакцию.

Одним из эффективных методов диагностики ОКИ является иммунохроматографический анализ, который доступен для исполнения у постели больного, в кабинете врача, для самодиагностики в домашних условиях. Многие зарубежные компании (Merck, Merieux) предлагают набор компонентов для экспресс-об- наружения E. coli О157, сальмонелл, кампилобактера, веротоксинов и других.

Для бактериологического исследования на энтеробактерии пригоден самый разнообразный материал. Отбор проб из клинических образцов (испражнения, кровь, моча, желчь, дуоденальное содержимое, пунктаты органов, экссудат, спинномозговая жидкость, мокрота, слизь из зева, носа, уха, отделяемое ран, секционный материал) производится с учетом локализации, патогенеза патологического процесса и стадии заболевания. Пробы из объектов окружающей среды отбирают с учетом путей и факторов передачи инфекции, сроков сохранения этих микроорганизмов в тех или иных объектах. Взятый на исследование материал должен быть посеян в течение двух часов на питательные среды. Если это не представляется возможным, то его следует поместить в консервант (глицериновый, фосфатно-буферный, изотонический раствор хлорида натрия) в соотношении 1:3.

Посевы проб исследуемого материала производят в жидкие питательные среды и на чашки с плотными

192

селективно-дифференциальными средами.

Жидкие накопительные среды предназначены для посева материала, содержащего разнообразную микрофлору (испражнения, гнойное отделяемое, секционный материал и т.п.). Они содержат вещества, подавляющие рост сопутствующей микрофлоры. К средам, предназначенным для выделения сальмонелл, относятся селенитовый бульон, магниевая среда, среда Мюллера или Кауфмана. Исследуемый материал вносят в эти среды в соотношении 1:5 и тщательно перемешивают. Кровь засевают в среды в соотношении 1:10. Обогатительные среды для материалов, обычно не обсемененных микроорганизмами (кровь, спинномозговая жидкость), содержат только вещества, стимулирующие рост искомых возбудителей болезни. Для сальмонелл это - среда Рапопорта, желчный бульон.

Плотные высокоселективные среды (ВСА, агар Плоскирева и др.) целесообразно применять для посева испражнений и другого материала, содержащего сопутствующую микрофлору.

Для выделения условно-патогенных энтеробактерий используют слабоселективные питательные среды (среда Эндо, эозин-метиленовый агар и др.). Оптимальным является одновременное применение тех и других сред. Посевы инкубируют при 37°С в течение

18-20 ч (до 48 ч на ВСА).

6.2. Эшерихиозы

Эшерихиозы - группа инфекционных заболеваний, вызываемых микроорганизмами рода Escherichia, в большинстве случаев - E. сoli.

Заболевания протекают, главным образом, в виде инфекций желудочно-кишечного тракта, мочевыводящихпутей,бактериемииименингитановорожденных.

193

Кишечные инфекции обусловлены диареегенными E. сoli пяти групп: энтеротоксигенными (ЭТКП), энтеропатогенными (ЭПКП), энтероинвазивными (ЭИКП), энтерогеморрагическими (ЭГКП) и энтероадгезивными (ЭАКП). Способность диареегенных E. сoli вызывать заболевания связана с наличием у них факторов патогенности:

•адгезии и колонизации (кодируется плазмидными генами);

•инвазии (белки наружной мембраны, кодируемые плазмидой м.м. 140 мДа);

•экзотоксинов (цитотонины, два типа цитотоксинов, синтез которых контролируется генами умеренных кон-

вертирующих фагов - 933 J (SLT-I) и 933 W (SLT-II);

•эндотоксинов (липополисахариды).

ЭТКП вызывают холероподобную инфекцию у детей и взрослых. Это связано с наличием белковых энтеротоксинов, напоминающих по механизму действия холероген. ЭТКП принадлежат к сероварам О6, О8, О15,

О20, О25, О27, О139 и др.

ЭПКП вызывают колиэнтериты преимущественно у детей первого года жизни. Адгезия патогена на эритроцитах происходит с участием белков наружной мембраны. В процессе развития инфекции бактерии разрушаются и освобождается эндотоксин - ЛПС, который вызывает развитие системной воспалительной реакции в тонком кишечнике больного. Колиэнтериты обусловлены ЭПКП преимущественно сероваров О44,

О55, О119, О142 и др.

ЭИКП вызывают дизентериеподобные заболевания у детей и взрослых. Адгезия на эритроцитах происходит за счет капсулоподобной оболочки. Аналогично шигеллам они пенетрируют и размножаются в эритроцитах. Это приводит к гибели эритроцитов и образо-

194

ванию язв в толстом кишечнике. ЭИКП вырабатывают токсин, подобный токсину шигелл. ЭИКП относятся к сероварам О29, О124, О143, О144 и др.

ЭГКП (например, E. coli О157:Н7) являются представителями микрофлоры крупного рогатого скота, овец. Они вызывают диарею с примесью крови и развитие гемолитико-уремического синдрома. Патогенез диареи связан с выработкой веротоксина двух типов, один из которых (VT-1) имеет структурное и антигенное сродство с токсином S. dysenteriae серовара 1, а другой (VT-2) является цитотоксином. Токсин связывается с субъединицей 60 S рибосом, блокирует синтез белка, разрушает эндотелий мелких кровеносных сосудов, вызывает поражение почек. В некоторых случаях это приводит к летальному исходу. К ЭГКП относятся бактерии сероваров О11, О145, О157.

ЭАКП (или аутоагглютинирующие E. coli) - плохо изученная группа. Идентификация ее представителей основывается на их способности к адгезии на поверхности клеток Hep-2. Роль ЭАКП в развитии инфекций желудочно-кишечного тракта до конца не выяснена. Кроме диареи, E. coli вызывает гнойно-воспалитель- ные заболевания различной локализации: пиелиты, циститы, холециститы, менингит новорожденных, нагноение ран и др. При выраженном иммунодефиците E. coli может вызывать сепсис.

Морфология и физиология. По морфологическим и тинкториальным свойствам E. coli напоминает другие энтеробактерии. Среди кишечных палочек встречаются подвижные и неподвижные варианты. Бактерии некоторых штаммов имеют капсулу или микрокапсулу и формируют на плотной среде колоний в S- и R-формах. E. coli - факультативный анаэроб, хорошо растет на обычных питательных средах при слабоще-

195

лочном значении рН и оптимальной температуре 37○С. Кишечная палочка обладает высокой ферментативной активностью, утилизирует ацетат в качестве единственногоисточникауглерода.Большинствоштаммов ферментируютлактозусобразованиемкислотыигаза, что является одним из основных признаков при конструировании дифференциально-диагностических сред. Антигены. E. coli имеет сложную антигенную структуру. Схема ее типирования основана на вариабельности соматических О-антигенов, жгутиковых Н-антигенов и капсульных (поверхностных) К-антигенов.

О-антигены имеют сходную химическую структуру и связаны с ЛПС клеточной стенки. О-антигены определяют серологическую группу эшерихий. В настоящее время описано около 170 О-серогрупп E. coli. Эшерихии разных О-серогрупп в большинстве своем характеризуются перекрестными антигенными связями. Около 100 серогрупп кишечной палочки имеют перекрестнореагирующие антигены с шигеллами, сальмонеллами и другими энтеробактериями.

У эшерихий описано 50 Н-антигенов, которые типоспецифичны. Н-ан-тигены имеются только у жгутиковых форм бактерий и состоят преимущественно из белка флагеллина.

Эшерихии содержат около 97 К-антигенов, которые подразделены на три типа - A, B и L. Они различаются чувствительностью к нагреванию и химическим веществам. К-антигены способны маскировать О-антигены, которые можно выявить только после разрушения первых кипячением культуры.

Антигены E. coli обозначают антигенными формулами, указывающими на серогруппу, например, E. coli

026:К 60 (В6), или серовар E. coli 026:К 60 (В6) : Н2.

196