6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Организация_и_проведение_учебного_процесса_по_подготовке_специалистов

Патогенность эшерихий для людей связана с определенными серогруппами.

Лабораторная диагностика эшерихиозов основа-

на на бактериологическом анализе биоматериала (испражнений, рвотных масс, желчи, мочи, дуоденальногосодержимого,кровиидр.).Исследованиепроводится по стандартной схеме с целью выделения культуры, ее идентификации по морфологическим и биохимическим признакам и определения серовара возбудителя. Для посева исследуемого материала используют се- лективно-дифферен-цирующие среды: Плоскирева, Левина, Эндо, Аселя-Либермана. С целью вы-деления и идентификации энтерогеморрагической кишечной палочки E. coli О157:Н7 материал от больных неос - ложненными диареями, острыми кишечными инфекциями с гемоколитом и гемолитико-уремическим синдромом засевают на питательную среду Сорбитол E. coli О157:Н7 (агар) и в соотношении 1:5 - в среды накопления (бульон лактозный с бриллиантовым зеленым и желчью). Посевы инкубируют при 37○С в течение 18-20 ч. Колонии патогенных и непатогенных эшерихий не различаются и имеют на среде Эндо круглую форму, ровный край, матовую поверхность и малино- во-красный цвет; на среде Левина - темно-синий цвет; на среде Аселя-Либермана - розовую окраску при неизменности других признаков. Из 10 подозрительных колоний берут часть материала для оксидазной пробы, микроскопии и ориентировочной РА с поливалентными ОК-антисыворотками, Ig и адсорбированными О-сыворотками. При положительных результатах колонии пересевают на среду Клиглера (Олькеницкого, Ресселя) для выделения и дальнейшего изучения чистой культуры.

При просмотре посевов исследуемого материала на

197

чашках с Сорбитол E. coli О157:Н7 агаром отбира - ют колонии средней величины, выпуклые, круглые, влажные, прозрачные, бесцветные (сорбитолотрицательные колонии). Если на чашках выросли 1-2 сорбитолотрицательные колонии, то серологические реакции ставят после посева на одну из сред первичной дифференциации (Клиглера, Олькеницкого, Ресселя). В случае роста однотипной культуры материал с 3-5 колоний серологически идентификацируют на стекле

сО- и Н-сыворотками к антигенам E. coli О157:Н7 и не менее 5 сорбитол-отрицательных колоний пересевают на среду первичной дифференциации для последующего изучения.

Биохимическую активность выделенной культуры определяют с помощью стандартных наборов или проводят идентификацию на минимальном дифференцирующем ряду. Изучают образование индола, ставят реакции с метиловым красным и Фогеса-Проскауэра, определяют характер роста на цитратных агарах Симонса или Кристенсена, среде с малонатом, агаре с фенилаланином, средах с аминокислотами, на среде

с10% лактозы. Характерной особенностью энтерогеморрагических кишечных палочек E. coli О157:Н7, в отличие от других E. coli, является отсутствие способности продуцировать ß-D-глюкуронидазу (95% штаммов) и расщеплять сорбитол. По другим биохимическим свойствам штамм E. coli О157:Н7 практически не отличается от E. coli (табл. 8).

Таблица 8 Основные биохимические свойства E. coli

198

Примечание:

+ положительный ответ - отрицательный ответ

± признак непостоянный

(±) – признак непостоянный, реакция замедленная

Кроме изучения биохимической активности, проводят определение подвижности, антигенной структуры бактерий и вирулентности выделенной культуры.

Токсигенность E. coli изучают на клетках почек мы -

199

шей линии Y-1 или методом иммунопреципитации, инвазивность - на культурах клеток Hep-2, адгезивные свойства - на культурах клеток Hep-2, HeLa. Для обнаружения патогенных E. coli используются метод ДНКДНК гибридизации и полимеразная цепная редакция.

При выделении E. coli О157 или E. coli О157:Н7 определяют способность их продуцировать веротоксины (VT-1, VT-2). Для выявления веротоксинов предложен ряд методов: реакция пассивной латексной агглютинации, иммуноферментный анализ, биологическая проба на белых мышах, цитопатическая активность в отношении культуры клеток HeLa или почечных клеток Vero, полимеразная цепная реакция.

6.3. Шигеллезы

Бактерии рода Shigella являются возбудителями дизентерии, или шигеллеза, поражающей, главным образом, толстый кишечник. Дизентерия характеризуется общей интоксикацией организма и «кровавым поносом».

Дизентерия - полиэтиологическое заболевание. Род Shigella включает четыре вида: S. dysenteriae (серогруппа А), S. flexneri (серогруппа В), S. boydii (серогруппа С), S. sonnei (серогруппа D). Три первых вида подразделены на серовары, а S. flexneri - еще и на подсеровары.

Морфология и физиология. По морфологическим свойствам шигеллы мало отличаются от эшерихий, неподвижны, клетки некоторых штаммов имеют пили. Возбудителя дизентерии - хемоорганотрофы, не требовательны к питательным средам. Температурный оптимум – 37°С. При выделении из организма больных микроб на плотных средах формирует, как правило, S-формы колоний. Шигеллы вида S. sonnei образуют два типа колоний: мелкие круглые выпуклые

200

- S-формы (I фаза) и крупные плоские - R-формы (II фаза). Характер колоний зависит от наличия (I фаза) или отсутствия (II фаза) плазмиды м.м. 120 мДа, которая определяет также вирулентность шигелл Зонне. Бактерии I фазы при пересевах образуют колонии обоих типов. Шигеллы разлагают углеводы с образованием кислоты, в некоторых случаях - кислоты и газа, но не ферментируют лактозу (за исключением S. sonnei). Не образуют лизиндекарбоксилазу и аргининдигидролазу. Дифференциальные признаки рода Shigella представлены в таблице 9.

Таблица 9 Основные биохимические свойства бактерий родаShigella

Примечание:

+ положительный ответ; - негативный ответ

± признак непостоянный

Антигены. Шигеллы имеют сложную антигенную

201

структуру. В составе их клеточных стенок имеется О-, а у бактерий некоторых видов (S. flexneri) и К-антигены. О-антигены различаются по специфичности: общие для семейства Enterobacteriaceae, родовые, видовые, групповые, типоспецифические. В классификации учитываются только групповые и типоспецифические О-ан-тигены. В соответствии с этим род Shigella подразделяется на 4 подгруппы и включает 44 серотипа.

В подгруппу А (вид S. dysenteriae) включены шигеллы, не ферментирующие маннит. Вид включает 12 серотипов (1-12).

К подгруппе В (вид S. flexneri) относятся шигеллы, обычно ферментирующие маннит, содержащие типоспецифические антигены (I-VI), по которым подразделяются на серотипы (1-6). Кроме того, они содержат групповые антигены, по которым серотипы подразделяются на подсеротипы. Этот вид включает два антигенных варианта - X и Y. Серотип S. flexneri 6 не имеет подсеротипов, но его разделяют на 3 биохимических типа по особенности ферментации глюкозы, маннита и дульцита (биотипы Бойд 88, Манчестер, Ньюкасл).

К подгруппе С (вид S. boydii) относятся шигеллы, обычно ферментирующие маннит. Вид включает 18 серотипов (1-18), каждый из которых имеет свой главный типовой антиген.

В подгруппу Д (вид S. sonnei) входят шигеллы, обычно ферментирующие маннит и способные медленно (через 24 ч и позже) разлагать лактозу и саха - розу. Вид S. sonnei включает один серотип, однако колонии I и II фаз обладают своими типоспецифическими антигенами. Для внутривидовой классификации шигелл Зонне предложено два метода: а)

202

деление их на 14 биохимических типов и подтипов по способности ферментировать мальтозу, рамнозу и ксилозу; б) деление на фаготипы по чувствительности к набору соответствующих фагов.

Эти способы типирования имеют, главным образом, эпидемиологическое значение.

Серологическая идентификация шигелл

Исследование антигенной структуры культуры начинают с ОРА на стекле со смесью № 1, в которую входят адсорбированные поливалентные сыворотки к S. flexneri 1-5, S. sonnei, S. flexneri 6. При положительной РА со смесью № 1 выделенную культуру агглютинируют отдельно каждой моносывороткой. Положительная реакция агглютинации с адсорбированной сывороткой к S. sonnei дает право дать ответ. Для установления серотипа и подсеротипа S. flexneri необходимо дополнительно поставить РА с серотипоспецифическими (к антигенам I, II, III, IV, V, VI), а затем с групповыми (3, 4, 6, 7, 8) сыворотками.

При отсутствии агглютинации со смесью № 1 ставят реакцию агглютинации с другими адсорбиро - ванными поливалентными сыворотками, при этом учитывают отношение изучаемой культуры к манниту. Так, культуры, не расщепляющие маннит, исследуют с адсорбированными поливалентными сыворотками к S. dysenteriae; расщепляющие маннит

– с адсорбированными поливалентными сыворотками к S. boydii.

При наличии агглютинации выделенную культуру исследуют серотипоспецифическими сыворотками, обращая внимание на индолообразование. S. boydii сероваров 5, 7, 9, 11, 13, 15, 16, 17 и S. dysenteriae 2, 7, 8 сероваров способны образовать индол, у бактерий остальных серотипов это свойство отсутствует.

203

Таблица 10 Схема определения биоваров S. sonnei

(по Солодовникову Ю.П. и др., 1971)

Примечание:

+ ферментация (в скобках указанные сроки ферментации в днях); - отсутствие ферментации

Лабораторная диагностика. Основным материалом для бактериологического исследования на дизентерию служат испражнения больного, которые засевают на дифференциально-диагностические среды (Плоскирева, Левина и др.) с последующим выделением чистой культуры и ее идентификацией на средах пестрого ряда и по антигенным свойствам для определения вида и серовара. Посевы просматривают через 18-20 ч после первичного высева. На средах Плоскирева и Эндо шигеллы формируют бесцветные (не ферментируют лактозу) прозрачные или полупрозрачные круглые выпуклые с ровным краем (S-формы) колонии диаметром 1-4 мм. Для S. sonnei характерно наличие колоний в R-форме (с зазубренным краем). При микроскопии выявляют грамотрицательные короткие палочки. Подозрительные колонии пересевают в пробирки со средами Ресселя, Клиглера или Олькеницкого. С каждой чашки снимают не менее трех колоний.

204

При проведении массовых обследований лактозонегативные бесцветные колонии, выросшие на любой из используемых сред, исследуют в ориентировочной реакции агглютинации со смесью видовых дизентерийных сывороток.

На 3-й день учитывают изменения в комбинированных средах, проводят серологическую идентификацию. Отбирают культуры, не ферментирующие лактозу и мочевину, но разлагающие глюкозу, и засевают их на полужидкие среды Гисса с маннитом, мальтозой, лактозой, сахарозой, 1%-ную пептонную воду с индикаторными бумажками на индол и сероводород и в пробирку с 0,3%-ным питательным агаром для изучения подвижности. При необходимости проводят другие биохимические тесты. Ставят пробу с поливалентным дизентерийным бактериофагом и ориентировочную реакцию агглютинации с адсорбированными дизентерийными сыворотками. Если выделенная культура, обладающая биохимическими признаками шигелл, не реагирует с сыворотками, то ее следует прокипятить в течение 30 мин, т.к. многие шигеллы (особенно серогрупп А и С) обладают термолабильными антигенами, ингибирующими взаимодействие антител с О-антигенами. При необходимости определяют чувствительность выделенной культуры к антибиотикам.

На 4-й день исследования учитывают результаты посевов предыдущего дня.

Кроме проведения бактериологического анализа на дизентерию, для обнаружения антигенов возбудителя в крови, моче и испражнениях могут быть использованы следующие серологические реакции: РПГА, РСК, реакция коагглютинации, а также ИФА и ПЦР. Эти методы высокоэффективны, специфичны, пригодны

205

для ранней диагностики.

Для серологической диагностики используют РПГА с соответствующими эритроцитарными диагностикумами, НМФА, реакцию Кумбса. Диагностическое значение имеет также аллергическая проба.

6.4. Сальмонеллезы

Род Salmonella получил название в честь американского микробиолога Сальмона (Salmon). Заболевания, вызываемые сальмонеллами, развиваются преимущественно в результате употребления инфицированных пищи и воды. Природный резервуар большинства возбудителей - человек и различные животные, в том числе пресмыкающиеся, земноводные, рыбы и птицы. Сальмонеллы вызывают брюшной тиф, паратифы, гастроэнтероколиты, септицемию. Бактерии некоторых видов являются возбудителями внутрибольничного сальмонеллеза.

Внастоящее время род Salmonella включает два вида:

S. salamae и S. choleraesuis, два одноименных подвида,

из которых первый содержит около двух тысяч сероваров, а второй - четыре серовара: S. typhi, S. paratyphi A, S. gallinarum, S. pullorum.

Морфологияифизиология. Сальмонеллы-мелкие грамотрицательные палочки, окруженные микрокапсулой, подвижны за счет перитрихиально расположенных жгутиков. Температурный оптимум для их роста - 35-37 ºС. Оптимум рН - 7,2-7,4. На пита - тельных средах большинство сальмонелл образует мелкие (2-4 мм) прозрачные голубоватые S-формы колоний. На агаре Эндо они розоватые, прозрачные; на агаре Плоскирева - бесцветные и выглядят более плотными и мутноватыми; на висмут-сульфитном агаре - черные с металлическим блеском, окружены

206