5 курс / Инфекционные болезни / Доп. материалы / Хоффман,_Кампс_Лечение_ВИЧ_инфекции,_2009

1 Базовые сведения

ной передачи ВИЧ требуется не менее двух отрицательных результатов ПЦР. Первую ПЦР на ВИЧ необходимо выполнить после первого месяца жизни (чувствительность 96%, специфичность 99%), затем еще раз после исполнения трех месяцев, поскольку в этом возрасте чувствительность и специфичность ПЦР на ВИЧ достигают почти 100%. Необходимо подчеркнуть, что вертикальную передачу ВИЧ можно исключить только в случае отсутствия риска заражения ребенка после родов через грудное вскармливание.

Даже при получении отрицательных результатов ПЦР на ВИЧ необходимо убедиться в исчезновении материнских антител хотя бы однократно. В случае получения положительного результата необходимо повторить тестирование на ВИЧ с другим образом крови.

Диагностика ВИЧ-инфекции после опасного контакта с ВИЧ на рабочем месте

После укола иглой или другого опасного контакта необходимо проверить пациента, с чьей биологической жидкостью произошел контакт, на наличие гепатитов В и С, а также ВИЧ-инфек- ции (безусловно, только после получения согласия этого пациента). Учитывая необходимость быстрого начала постконтактной профилактики (ПКП), любой укол иглой следует рассматривать как ситуацию, требующую неотложных действий. Чем раньше начинается ПКП, тем больше шансов предотвратить возможное заражение (Puro, 2004; Panlilio, 2005). ПКП лучше всего начинать в первые 24 часа после опасного контакта с ВИЧ. При невозможности быстрого получения результата скринингового теста на ВИЧ по транспортным причинам следует выполнить экспресс-тест на ВИЧ. Для того чтобы не упустить время, ПКП можно начать немедленно, а в случае получения отрицательного результата тестирования на ВИЧ сразу отменить.

Если у пациента, с чьей биологической жидкостью произошел контакт, нет симптомов, характерных для острой ретровирусной инфекции, то отрицательный результат скринингового теста на ВИЧ с достаточно высокой степенью надежности свидетельствует об отсутствии у него ВИЧинфекции. К ПЦР на ВИЧ прибегают только в случае наличия у пациента проявлений острой ВИЧ-инфекции.

Если пациент, с чьей биологической жидкостью произошел контакт, инфицирован ВИЧ или его ВИЧ-статус неизвестен, необходимо немедленно выполнить скрининговый тест на ВИЧ пострадавшему. Первое тестирование на ВИЧ должно быть проведено сразу после укола иглой; это необходимо для официального подтверждения отсутствия ВИЧ-инфекции у пострадавшего на момент несчастного случая, что имеет юридическое значение. Повторные тестирования проводят через 6 недель, затем через 3 и 6 месяцев. Если пациент, с чьей биологической жидкостью произошел контакт, инфицирован ВИЧ, рекомендуется провести дополнительное тестирование через 12 месяцев (Ridzon, 1997; Ciesielski, 1997)

Практические вопросы

Юридические аспекты. Перед тестированием на ВИЧ требуется получить информированное согласие пациента, поскольку его результаты могут иметь важные медицинские, социальные и юридические последствия. Тестирование на ВИЧ против воли пациента представляет собой вторжение в частную жизнь с возможными юридическими последствиями для врача. Письменное согласие не требуется, однако выражение согласия должно быть отражено в медицинских документах. Согласие на выполнение тестирования на ВИЧ ребенку следует получить у его родителей или законных опекунов. Особый статус тестирования на ВИЧ сейчас подвергается критике. В настоящее время указывается на необходимость «устранения стигматизации» и «присвоения тесту на ВИЧ статуса обычного медицинского анализа» (Manavi, 2005; Beckwith, 2005). Зачастую из-за сложных требований к получению информированного согласия медработникам проще не проводить тестирование на ВИЧ. Действующие рекомендации CDC позволяют во многих ситуациях пользоваться методом «тестирования на ВИЧ при отсутствии отказа пациента»: пациента уведомляют о проведении тестирования на ВИЧ в числе остальных лабораторных анализов, но без подробных объяснений, и выполняют его, если пациент явно не выразил свое нежелание проходить тестирование на ВИЧ (CDC, 2006).

40

Консультирование. Ни одно тестирование на ВИЧ не должно проводиться без консультирования и предоставления информации. Пациенту следует рассказать о порядке тестирования на ВИЧ, возможностях и ограничениях применяющихся диагностических тест-систем. В частности, необходимо указать на ограничения использования ПЦР на ВИЧ в первичной диагностике ВИЧинфекции: несмотря на чувствительность метода, его применение ограничено только определенными клиническими ситуациями (быстрое исключение наличия острой ВИЧ-инфекции или вертикальной передачи ВИЧ). По причине стрессовой ситуации, в которой находится пациент, высокая стоимость ПЦР редко служит для него сдерживающим фактором. Во время консультирования необходимо подробно рассказать обо всех возможных результатах тестирования на ВИЧ и, особенно, о «диагностическом окне». Желание пациента пройти тестирование на ВИЧ также служит поводом для обсуждения с пациентом риска передачи различных инфекций половым путем и обсуждения подходящих методов профилактики.

Сообщение результатов. Об отрицательном результате теста можно сообщить по телефону, если было проведено консультирование и пациент знает, насколько можно доверять результату этого теста. Диагноз ВИЧ-инфекции следует сообщать во время личной беседы; это должен делать только врач или специалист-вирусолог. При сообщении о положительном результате тестирования по телефону невозможно в полной мере оценить реакцию пациента. У некоторых пациентов после получения такого известия возникают мысли о самоубийстве. Кроме того, отрицательный результат подтверждающего теста после реактивного результата скринингового теста необходимо обсудить с пациентом в частной беседе, поскольку в такой ситуации нельзя исключить возможность острой ВИЧ-инфекции. Пациентов с положительными результатами тестирования следует направлять в учреждения, оказывающие помощь ВИЧ-инфицированным. Кроме того, пациенту должна быть предоставлена информация о местных центрах консультирования и помощи. Нельзя сообщать пациенту результат реактивного скринингового теста на ВИЧ до получения результата подтверждающего теста на ВИЧ.

Интернет-ресурсы о тестировании на ВИЧ

§Отдел основных технологий здравоохранения (Department of Essential Health Technologies): http://www.who.int/eht/en/

§Диагностика ВИЧ/СПИДа: http://www.who.int/hiv/amds/diagnostics/en/index.html

§Диагностические и лабораторные технологии: http://www.who.int/diagnostics_laboratory/en/index.html

§Европейская комиссия. Предприятия и индустрия. Медицинские принадлежности: http://europa.eu.int/comm/enterprise/medical_devices/index.htm

Содержит информацию о Директиве о медицинских средствах для лабораторной диагностики in vitro (IVDD)

§Центры по контролю и профилактике заболеваний (CDC), США: http://www.cdc.gov/hiv/testing.htm, http://www.cdc.gov/hiv/rapid_testing

§Управление по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств (FDA), Центр биологических исследований (CBER), США: лицензированные и одобренные тесты на ВИЧ, Т-лимфотропный вирус человека (HTLV) и вирусные гепатиты: http://www.fda.gov/cber/products/testkits.htm

Литература

Beckwith CG, Flanigan TP, del Rio C, Simmons E, Wing EJ, Carpenter CCJ, Bartlett JG. It is time to implement routine, not risk-based, HIV testing. Clin Infect Dis 2005; 40:1037–1040.

Berger A, Preiser W, Doerr HW. The role of viral load determination for the management of human immunodeficiency virus, hepatitis B virus and hepatitis C virus infection. J Clin Virol 2001, 20: 23–30.

Branson BM. Patientennahe Schnelltests für den Nachweis von HIV-Antikörpern. Point-of-Care Rapid Tests for HIV Antibodies. J Lab Med 2003; 27:288–295.

Brust S, Duttmann H, Feldner J, Gürtler L, Thorstensson R, Simon F. Shortening of the diagnostic window with a new combined HIV p24 antigen and anti-HIV-1/2/O screening test. J Virol Meth 2000; 90:153–165.

Busch MP, Satten GA. Time course of viremia and antibody seroconversion following human immunodeficiency virus exposure. Am J Med 1997; 102(suppl 5B): 117–24.

41

1 2. Тестирование на ВИЧ

1 Базовые сведения

CDC. Interpretation and use of the Western-Blot assay for serodiagnosis of HIV type 1 infections. MMWR 1989, 38: 1–7.

CDC. Protocols for confirmation of reactive rapid HIV tests. MMWR 2004; 53: 221–222. http://www.cdc.gov/mmwr/preview/mmwrhtml/mm5310a7.htm

CDC. Revised recommendations for HIV testing of adults, adolescents, and pregnant women in health-care settings. MMWR 2006, 55:1–17. http://www.cdc.gov/mmwr/PDF/rr/rr5514.pdf

Ciesielski CA, Metler RP. Duration of time between exposure and seroconversion in healthcare workers with occupationally acquired infection with human immunodeficiency virus. Am J Med 1997; 102 (suppl 5B):115–116.

Claassen M, van Zyl GU, Korsman SN, Smit L, Cotton MF, Preiser W. Pitfalls with rapid HIV antibody testing in HIV-infected children in the Western Cape, South Africa. J Clin Virol 2006; 37: 68–71.

Connick E. Incomplete antibody evolution and seroreversion after treatment of primary HIV type 1 infection: What is the clinical significance? Clin Infect Dis 2005; 40:874–875.

Deutsches Institut für Normung e.V. (DIN). DIN-Norm 58969-41. DIN-Taschenbuch 222: Medizinische Mikrobiologie und Immunologie, Diagnostische Verfahren, 3. Auflage, Stand 2000. Berlin, Wien, Zürich: Beuth-Verlag.

European Collaborative Study. Children born to women HIV-1 infection: natural history and risk of transmission. Lancet 1991; 337:253260.

Fiebig EW, Wright DJ, Rawal BD, et al. Dynamics of HIV viremia and antibody seroconversion in plasma donors: implication for diagnosis and staging of primary infection. AIDS 2003, 17: 1871-1879.

Giles RE, Perry KR, Parry JV. Simple/rapid test devices for anti-HIV screening: Do they come up to the mark? J Med Virol 1999; 59:104–109.

Greenwald JL, Burstein GR, Pincus J, Branson B. A rapid review of rapid HIV antibody tests. Current Infectious Disease Reports 2006, 8:125– 131.

Gürtler L. Difficulties and strategies of HIV diagnosis. Lancet 1996; 348:176–179.

Gürtler L, Mühlbacher A, Michl U, et al. Reduction of the diagnostic window with a new combined p24 antigen and human immunodeficiency virus antibody screening assay. J Virol Meth 1998; 75:27–38.

Kassutto S, Johnston MN, Rosenberg ES. Incomplete HIV type 1 antibody evolution and seroreversion in acutely infected individuals treated with early antiretroviral therapy. Clin Infect Dis 2005; 40:868-73.

Ly TD, Laperche S, Couroucé AM. Early detection of human immunodeficiency virus infection using third-and fourth-generation screening assays. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2001; 20:104–110.

Manavi K, Welsby PD. HIV testing: Should no longer be accorded any special status. Brit Med J 2005; 330:492–493.

Moodley D, Coovadia HM, Bobat RA et al. The relationship between maternal-infant antibody levels and vertical transmission of HIV-1 infection. J Trop Pediatr 1997; 43:75-79.

Panlilio AL, Cardo DM, Grohskopf LA, Heneine W, Ross CS. Updated U.S. Public Health Service guidelines for the management of occupational exposures to HIV and recommendations for postexposure prophylaxis. MMWR Recomm Rep 2005; 54: 1–17. http://www.cdc.gov/mmwr/preview/mmwrhtml/rr5409a1.htm

Perry KR, Ramskill S, Eglin RP et al. Improvement in the performance of HIV screening kits. Transfus Med 2008; 18(4): 228-240.

Puro V, Cicalini S, De Carli G, et al. Post-exposure prophylaxis of HIV infection in healthcare workers: recommendations for the European setting. Eur J Epidemiol 2004; 19: 577–584.

Ridzon R, Gallagher K, Ciesielski C, et al. Simultaneous transmission of human immunodeficiency virus and hepatitis C virus from a needlestick injury. N Engl J Med 1997; 336:919–922.

Robert-Koch-Institut. HIV-Infektionen und AIDS-Erkrankungen in Deutschland. Epidemiologisches Bulletin.

Rossi P et al. Report of a consensus workshop, Siena, Italy, January 17-18, 1992. Early diagnosis of HIV infection in infants. JAIDS 1992, 5: 1169-1178.

Scarlatti G, Lombardi V, Plebani A, et al. Polymerase chain reaction, virus isolation and antigen assay in HIV-1-antibody-positive mothers and their children. AIDS 1991, 10: 1173–1178.

Sickinger E, Stieler M, Kaufman B, et al. Multicenter evaluation of a new, automated enzyme-linked immunoassay for detection of human immunodeficiency virus-specific antibodies and antigen. J Clin Microbiol 2004; 21-29.

Skidmore S, Devendra S, Weaver J, et al. A case study of delayed HIV-1 seroconversion highlights the need for Combo assays. Int J STD AIDS 2009, 20: 205-206.

Tamashiro H, Constantine NT. Serological diagnosis of HIV infection using oral fluid samples. Bull World Health Organ 1994; 72:135–143.

UNAIDS (1997a): Blood safety and HIV. UNAIDS Technical Update (UNAIDS Best Practice Collection. Geneva: UNAIDS, October 1997. WC 503.3

UNAIDS (1997b): HIV testing methods. UNAIDS Technical Update (UNAIDS Best Practice Collection. Geneva: UNAIDS, November 1997. WC 503.1

UNAIDS (2001): Guidelines for using HIV testing technologies in surveillance: selection, evaluation, and implementation. WHO/CDS/CSR/EDC/2001.16. UNAIDS/01.22E.

UNAIDS / WHO. Recommendations for the selection and use of HIV antibody tests. Weekly Epidemiological Record 1992; 67:145–149. UNAIDS / WHO. Revised recommendations for the selection and use of HIV antibody tests. Weekly Epidemiological Record 1997;72:81–87.

Weber B, Gürtler L, Thorstensson R, et al. Multicenter evaluation of a new automated fourth-generation human immunodeficieny virus screening assay with a sensitive antigen detection module and high specificity. J Clin Microbiol 2002; 1938-1946.

WHO / UNAIDS. The importance of simple/rapid assays in HIV testing. Weekly Epidemiological Record 1998;73:321–326. http://www.who.int/docstore/wer/pdf/1998/wer7342.pdf

WHO. Rapid HIV tests: Guidelines for use in HIV testing and counselling services in resource-constrained settings. Geneva 2004. http://www.who.int/hiv/pub/vct/rapidhivtests/en/

WHO. Global programme on AIDS. Recommendations for the selection and use of HIV antibody tests. Wkly Epidemiol Rec 1992; 67: 145– 152.

Wittek M, Stürmer M, Doerr HW, Berger A. Molecular assays for monitoring HIV infection and antiretroviral therapy. Exp Rev Mol Diagn 2007,7: 237–46.

42

3. Патогенез ВИЧ-1-инфекции

Андреа Рубберт, Джордж Беренс и Марио Островски

После появления первых описаний вируса иммунодефицита человека 1-го типа (ВИЧ-1) в 1983 году (Barré-Sinoussi, 1983; Gallo, 1983) и ВИЧ-2 в 1986 году (Clavel, 1986) было установлено, что эти два вируса вызывают синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД). Поскольку на сегодняшний день подавляющее большинство случаев СПИДа во всем мире вызвано ВИЧ-1, в основном разговор будет идти о ВИЧ-1-инфекции. Число инфицированных ВИЧ-1 на земном шаре, по данным ЮНЭЙДС, превышает 33 млн человек; большинство из них проживает в развивающихся странах Африки южнее Сахары, Азии и Южной Америки.

Несмотря на все успехи в области лечения ВИЧ-инфекции за последнее десятилетие, включая развитие стратегии «ВААРТ», после заражения ВИЧ полное избавление от вируса невозможно. Более того, появились новые проблемы, связанные с краткосрочной и долгосрочной токсичностью антиретровирусных препаратов и формированием мутаций резистентности как среди штаммов, циркулирующих в организме отдельных больных, так и среди штаммов, передающихся во время заражения. В большинстве стран Юго-Восточной Азии и Африки показатели заболеваемости и распространенности ВИЧ-1-инфекции выше, чем в Европе и Северной Америке, и продолжают расти.

Вследствие высокой стоимости схем антиретровирусной терапии и низкого уровня развития системы здравоохранения в развивающихся странах применение ВААРТ ограничено. Дальнейший рост пандемии ВИЧ-1-инфекции во многом зависит от того, в какой мере развивающиеся страны с высокой распространенностью ВИЧ-1-инфекции смогут воспользоваться достижениями стран Европы и Северной Америки, а также от того, появится ли в ближайшем будущем вакцина для профилактики этой инфекции.

Главное условие, без которого невозможно дальнейшее улучшение стратегий лечения, основанных на рациональном применении антиретровирусных препаратов, разработка методов иммунотерапии и создание профилактических вакцин — это понимание иммунопатогенеза ВИЧ- 1-инфекции. Как и при других вирусных заболеваниях, течение ВИЧ-1-инфекции зависит от особенностей как возбудителя, так и организма ВИЧ-1-инфицированного.

Течение ВИЧ-1-инфекции может быть очень разным, даже в случае заражения от одного и того же источника (Liu, 1997). У некоторых пациентов с длительным отсутствием прогрессирования ВИЧ-1-инфекции (т. е., при отсутствии снижения количества лимфоцитов CD4 или при наличии хронической инфекции продолжительностью не менее 7 лет без перехода в стадию СПИДа) были обнаружены дефектные вирионы (Kirchhoff, 1995). Таким образом, при наличии в организме дефектного вируса (со сниженной способностью к репликации) ВИЧ-1-инфекция прогрессирует медленнее. Однако у большинства ВИЧ-1-инфицированных вирус активно реплицируется с высокой степенью обновления популяции вирусных частиц в крови за сутки.

Вероятность быстрого развития клинических проявлений иммунодефицита также зависит от особенностей организма ВИЧ-1-инфицированного, в частности, его принадлежности к группе «длительных непрогрессоров», которая составляет примерно 5% от всего числа инфицированных. С более глубоким пониманием особенностей человеческого организма, влияющих на течение ВИЧ-инфекции, в том числе механизмов иммунной защиты и генетических факторов, связывают перспективы дальнейшего изучения патогенеза ВИЧ-инфекции и разработки методов иммунотерапии и профилактики.

1. Структура ВИЧ-1

ВИЧ относится к подсемейству лентивирусов семейства ретровирусов. Для лентивирусных инфекций характерно хроническое течение с длительным латентным периодом, персистирующей репликацией вируса и поражением центральной нервной системы (ЦНС). Типичными примерами возбудителей лентивирусных инфекций служат вирус висны, вызывающий заболевание

43

1 3. Патогенез ВИЧ-1-инфекции

1 Базовые сведения

у овец, вирус иммунодефицита обезьян (SIV или ВИО) и вирус иммунодефицита кошек (FIV или ВИК).

С помощью электронной микроскопии было обнаружено, что ВИЧ-1 и ВИЧ-2 очень похожи по структуре. В то же время белки этих вирусов отличаются по молекулярному весу; кроме того, найдены различия в структуре вспомогательных генов. Филогенетически ВИЧ-2 ближе к обнаруженному у дымчатых мангобеев (Cercocebus atys) вирусу иммунодефицита обезьян (SIVsm), чем к ВИЧ-1. Предполагается, что ВИЧ-2 перешел к человеку от обезьян. Репликация как ВИЧ- 1, так и ВИЧ-2 происходит в лимфоцитах CD4; оба вируса патогенны, хотя ВИЧ-2-инфекция, как правило, протекает легче.

1.1. Морфология ВИЧ-1

Диаметр вириона ВИЧ-1 составляет 100 нм. Снаружи вирион окружен липидной мембраной, содержащей 72 гликопротеиновых комплекса, каждый из которых образован тремя молекулами трансмембранного гликопротеина (gp41), служащими «якорем» комплекса, и тремя молекулами поверхностного гликопротеина (gp120). Силы связывания между gp120 и gp41 довольно слабые, поэтому поверхностный гликопротеин может спонтанно отсоединяться от вирусной частицы. По этой причине gp120 обнаруживается в сыворотке крови и лимфатической ткани ВИЧ-ин- фицированных. В результате отпочковывания вириона от клетки в его липопротеиновую оболочку попадают белки клеточной мембраны, в том числе антигены HLA классов I и II и молекулы адгезии, в частности ICAM-1, которые облегчают процесс адгезии вируса к новой клетке-мишени. Изнутри липопротеиновая оболочка выстлана матриксным белком p17. В капсиде, состоящем из белка p24, заключены две копии РНК ВИЧ-1. Каждая нить РНК ВИЧ входит в состав белково-нуклеинового комплекса, состоящего из нуклеопротеина p7 и фермента обратной транскриптазы p66 (ОТ). Вирусная частица содержит все необходимые ферменты для репликации: обратную транскриптазу (p66), интегразу (p32) и протеазу (p11) (Gelderbloom, 1993) (рис. 3.1).

p9-gag

Рис. 3.1. Схема строения вирусной частицы ВИЧ (пояснения в тексте)

1.2. Организация генома ВИЧ

Процесс репликации большинства ретровирусов определяется тремя генами: gag, pol и env: «gag» означает «group-antigen» (групповой антиген), «pol» — сокращение от «polymerase» (полимераза), а «env» означает «envelope» (внешняя оболочка) (Wong-Staal, 1991) (рис. 3.2). Классическая схема структуры генома ретровирусов записывается как 5’LTR-gag-pol-env-LTR 3’. На обоих концах каждой молекулы РНК есть длинные концевые повторы (LTR, long terminal repeats), ко-

44

Рис. 3.2. Структура генома ВИЧ (пояснения в тексте)

торые обеспечивают интеграцию в геном клетки-мишени и не кодируют вирусные белки. Гены gag и env кодируют белки капсида и внешней оболочки, ген pol — обратную транскриптазу и другие ферменты. Кроме того, геном ВИЧ-1, состоящий из приблизительно 9000 пар нуклеотидов, содержит еще шесть генов — vif, vpu, vpr, tat, rev и nef, что увеличивает сложность строения его генома. Гены nef, vif, vpr и vpu раньше называли вспомогательными, поскольку репликация вируса in vitro возможна и без их участия. Однако за последние годы механизмы регуляции и функциональные роли этих генов и кодируемых ими белков стали более понятны. Установлено, что продукты генов nef, tat и rev синтезируются уже на ранней стадии репликации ВИЧ.

Регуляторные белки Tat и Rev накапливаются в ядре и связываются с определенными участками вирусной РНК: первый с трансактивируемыми регуляторными элементами (transactivation-res- ponse elements, TAR) на участке длинных концевых повторов, а второй — с Rev-чувствитель- ными регуляторными элементами (rev response elements, RRE) в области гена env. Белок Tat активирует транскрипцию промоторной области длинных концевых повторов (LTR) и необходим для репликации вируса in vitro почти во всех культурах клеток. Он нуждается в клеточном кофакторе — циклине T1 (Wei, 1998). Белки Tat и Rev стимулируют транскрипцию провирусной ДНК ВИЧ-1 в РНК, обеспечивают элонгацию РНК и транспорт РНК из ядра в цитоплазму, а также необходимы для процесса трансляции. Белок Rev обеспечивает также транспорт компонентов вируса из ядра и переключает процесс белкового синтеза с образования регуляторных белков на образование структурных белков.

Белок Nef выполняет несколько функций. Он подавляет экспрессию рецепторов CD4 и антигенов HLA класса I (Collins, 1998) на поверхности ВИЧ-1-инфицированных клеток, и тем самым позволяет вирусу уклоняться от атаки цитотоксических T-лимфоцитов CD8 и от распознавания лимфоцитами CD4. Белок Nef может также угнетать активацию T-лимфоцитов, связываясь с различными белками, участвующими в процессе внутриклеточной передачи сигнала (подробнее см. в публикации Peter, 1998). У инфицированных вирусом иммунодефицита обезьян макак-резусов активная репликация вируса и прогрессирование болезни возможны только при условии интактности гена nef. Делеции гена nef были обнаружены в штаммах ВИЧ- 1, выделенных от группы австралийцев с длительным непрогрессирующим течением инфекции (Kirchhoff, 1995). Однако у некоторых из них со временем появились признаки прогрессирования инфекции, в том числе снижение числа лимфоцитов CD4. Таким образом, хотя делеции гена nef и могут замедлять репликацию вируса, их наличие не гарантирует защиту от наступления стадии СПИДа.

Белок Vpr, по-видимому, необходим для репликации вируса в непролиферирующих клетках, например, макрофагах. Этот белок наряду с другими клеточными и вирусными промоторами активирует длинные концевые повторы (LTR) генома ВИЧ. Недавно было установлено, что

45

1 3. Патогенез ВИЧ-1-инфекции

1 Базовые сведения

белок Vpr играет важную роль в переносе провируса в ядро (подробнее см. в публикации Miller, 1997) и способен блокировать жизненный цикл клетки в фазе G2.

Белок Vpu играет важную роль в процессе отпочковывания вируса из клетки, поскольку мутации гена vpu приводят к накоплению вирусных частиц у поверхности клетки. Молекулы клеточной мембраны, такие, как тезерин (CD317), способны связываться с вирионами ВИЧ-1 с дефектным геном vpu, препятствуя высвобождению вируса. Поэтому можно рассматривать ген vpu и белок Vpu как важнейшие звенья механизма высвобождения вируса из клетки и искать возможности блокировать их действие (Neil, 2009). Белок Vpu участвует также в разрушении комплексов CD4-gp160 в эндоплазматическом ретикулуме, позволяя тем самым gp160 включаться в формирование новых вирионов (Cullen, 1998).

Согласно последним публикациям белок Vif играет важную роль в процессе репликации вируса (Mariani, 2003). Штаммы ВИЧ-1 без гена vif не способны реплицироваться в лимфоцитах CD4, некоторых линиях T-лимфоцитов («недоступных клетках») и макрофагах. Такие штаммы способны проникать в клетки-мишени и начинать обратную транскрипцию, однако синтез провирусной ДНК остается незавершенным. In vitro слияние «доступных» и «недоступных» клеток приводит к «недоступному» фенотипу; это наблюдение позволило предположить, что репликация ВИЧ зависит от наличия или отсутствия некоего клеточного ингибитора. Этот эндогенный ингибирующий фактор был выявлен и получил название «APOBEC3G» (Sheehey, 2002). APOBEC3G (apolipoprotein B mRNA editing enzyme catalytic polypeptide-like 3G [полипептид типа 3G, каталитический фермент, корректирующий мРНК аполипопротеина B]) принадлежит к семейству внутриклеточных ферментов, превращающих цитозин в урацил в составе мРНК или ДНК путем деаминирования, что приводит к накоплению мутаций гуанин/аденозин и распаду провирусной ДНК. Образуя комплекс с APOBEC3G, белок Vif блокирует ингибиторную активность APOBEC3G (рис. 3.3(a).

а

б

Рис. 3.3. Инфекция ВИЧ дикого типа: белок Vif взаимодействует с APOBEC3G, связывается с APOBEC3G и препятствует его встраиванию в новые вирусные частицы (рис. 3a). Штаммы ВИЧ с делецией гена vif не способны ингибировать внутриклеточный APOBEC3G, который встраивается в образующиеся вирусные частицы и блокирует процесс обратной транскрипции в инфицируемых ими клетках–мишенях (рис. 3б)

46

Примечательно, что противовирусная активность APOBEC3G обнаруживается у разных видов животных, в то время как ингибирование APOBEC3G белком Vif высокоспецифично для ВИЧ. Белок Vif ВИЧ-1 не связывается с APOBEC3G мышей и макак-резусов. В отсутствие гена vif APOBEC3G встраивается в образующиеся вирусные частицы и блокирует синтез провирусной ДНК в инфицированных ими клетках-мишенях (рис. 3.3(б). При наличии белка Vif APOBEC3G связывается с ним, распадается и не встраивается в новые вирусные частицы. APOBEC3G синтезируется в лимфоцитах и макрофагах — основных клетках–мишенях для ВИЧ. В дендритных клетках количество APOBEC3G зависит от состояния активности клетки. По мере созревания дендритной клетки экспрессия APOBEC3G увеличивается (Pion, 2006).

Внастоящее время остается много вопросов о механизмах регуляции внутриклеточного APOBEC3G. Например, существует ли пороговое количество внутриклеточного APOBEC3G, при котором блокировалось бы распространение ВИЧ с белком Vif, и существуют ли генетические полиморфизмы APOBEC3G, способные влиять на течение ВИЧ-инфекции. Кроме того, ферментативная функция внутриклеточного APOBEC3G в лимфоцитах, возможно, зависит от состояния клеточной активации (Chiu, 2005). В то же время уже описаны эпитопы, с помощью которых происходит взаимодействие белков Vif и APOBEC3G, и пути внутриклеточного распада комплекса APOBEC3G-Vif. Следует заметить, что поиск специфических ингибиторов, блокирующих взаимодействие белков Vif и APOBEC3G или препятствующих внутриклеточному распаду APOBEC3G, крайне перспективен с точки зрения разработки новых методов лечения ВИЧ-инфекции, поскольку теоретически риск развития устойчивости вируса к блокатору клеточных структур минимален.

Вцелом эти данные объясняют не только то, почему белок Vif необходим для репликации ВИЧ, но также почему репликация ВИЧ видоспецифична. Помимо APOBEC3G, был открыт и другой клеточный фактор (см. ниже), который также объясняет видоспецифичность репликации вируса.

Ключевая роль APOBEC3G и других цитидиновых деаминаз, возможно, не ограничивается ВИЧ-1. Накопление мутаций гуанин/аденозин было обнаружено у различных штаммов вируса гепатита B (ВГВ). In vitro рост уровня ДНК вируса гепатита B резко снижался в присутствии белка APOBEC3G, однако ко-трансфекция vif устраняла ингибиующий эффект APOBEC3G.

2. Цикл репликации ВИЧ

2.1. Проникновение ВИЧ в клетку

CD4 — основной клеточный рецептор для ВИЧ

Рецептор CD4 представляет собой мономерный гликопротеин массой 58 кДа, который обнаруживается на поверхности примерно 60% T-лимфоцитов, на поверхности клеток-предше- ственников T-лимфоцитов, находящихся в костном мозге и тимусе, а также на поверхности моноцитов, макрофагов, эозинофилов, дендритных клеток и клеток микроглии ЦНС. Внеклеточный участок рецептора CD4 на T-лимфоцитах состоит из 370 аминокислот; гидрофобный трансмембранный домен состоит из 25 аминокислот, а внутриклеточный участок — из 38 аминокислот. Внеклеточный участок содержит четыре иммуноглобулиноподобных домена D1-D4 и область V2 (аминокислоты 40-55), играющую важную роль в присоединении gp120 к CD4. Эта область перекрывается с участком связывания молекул HLA класса II, которые являются естественными лигандами рецептора CD4.

Идентификация участка связывания gp120 на рецепторе CD4 подтолкнула к попыткам использования свободных молекул CD4 (sCD4) для нейтрализации циркулирующего вируса и предотвращения заражения новых клеток. Однако эти попытки не увенчались успехом; несмотря на то, что лабораторные штаммы вируса легко нейтрализовывались sCD4, нейтрализации штаммов, выделенных непосредственно от больных, добиться не удалось.

Более того, оказалось, что sCD4 способны вызывать конформационные изменения внешней оболочки вируса, которые облегчали заражение клеток-мишеней.

47

1 3. Патогенез ВИЧ-1-инфекции

1 Базовые сведения

Молекулы CD4 соединены с Т-клеточным антигенраспознающим рецепторным комплексом (T-cell receptor, TCR) на поверхности Т-лимфоцитов и связываются с молекулами HLA класса II на поверхности антигенпредставляющих клеток (АПК). Связывание gp120 с CD4 не только служит ключевым моментом в проникновении вируса в клетку, но также нарушает внутриклеточную передачу сигнала и стимулирует апоптоз лимфоцитов CD4 (Banda, 1992). В последние годы возобновился интерес к идее блокирования рецептора CD4 как основного клеточного рецептора для ВИЧ. PRO542 представляет собой полученный генно-инженерными методами тетравалентный белок слияния CD4-IgG2, который не только подавляет репликацию вируса in vitro, но и продемонстрировал впечатляющую противовирусную активность у пациентов с высокой вирусной нагрузкой в первых клинических испытаниях (см. главу 6 «АРТ в 2009 году»).

О том, что молекула CD4 является основным и незаменимым клеточным рецептором для связывания ВИЧ-1, ВИЧ-2 и вируса иммунодефицита обезьян, стало известно уже в 1984 году (Dalgleish 1984). Однако позже с помощью экспериментов, в которых выполнялась трансфекция человеческого гена CD4 в клеточные линии животных, было установлено, что для проникновения ВИЧ в клетку наличия только человеческого рецептора CD4 на ее поверхности недостаточно. Был сделан вывод о существовании на человеческих клетках дополнительных рецепторов — корецепторов, необходимых для проникновения ВИЧ. С другой стороны, было обнаружено, что некоторые лабораторные штаммы ВИЧ-1, а также штаммы ВИЧ-2 и вируса иммунодефицита обезьян могут проникать в клетки, лишенные молекул CD4. Примечательно, что моноклональные антитела к конформационно измененным в результате взаимодействия с рецептором CD4 эпитопам gp120 связываются также с gp120 CD4-независимых штаммов вирусов. Это позволило предположить, что у gp120 CD4-независимых штаммов уже есть области, необходимые для распознавания корецепторов и связывания с ними, поэтому связывание с рецептором CD4 для проникновения этих штаммов в клетку не обязательно. CD4-независимые штаммы легко нейтрализуются сывороткой ВИЧ-инфицированных, поэтому можно сделать вывод о том, что иммунный ответ препятствует размножению этих штаммов, обеспечивая селективный отбор (Edwards, 2001).

Хемокиновые рецепторы — корецепторы для проникновения ВИЧ в клетку

Важной вехой в изучении начальной стадии проникновения ВИЧ-1 в клетку стало открытие, сделанное в 1995 г. Cocchi и его коллегами: в совместных культурах лимфоциты CD8, полученные от ВИЧ-инфицированных, способны подавлять размножение ВИЧ в аутологичных и аллогенных лимфоцитах CD4, причем этот эффект не связан с цитотоксической активностью (Levy, 1996). В супернатантах культур лимфоцитов CD8, выделенных от ВИЧ-инфицированных, Cocchi обнаружил хемокины MIP-1α (macrophage inflammatory protein 1α [макрофагальный белок воспаления 1α]), MIP-1β (macrophage inflammatory protein 1β [макрофагальный белок воспаления 1β]) и RANTES (regulated upon activation T cell expressed and secreted [регулируемый процессами активации, экспрессируемый и секретируемый нормальными T-лимфоцитами]); он смог доказать, что эти хемокины способны дозозависимо подавлять репликацию некоторых из исследовавшихся штаммов вируса (Cocchi, 1995). MIP-1α, MIP-1β и RANTES представляют собой естественные лиганды хемокинового рецептора CCR5. Спустя несколько месяцев после публикации результатов группы Cocchi несколько групп исследователей смогли доказать, что CCR5 служит необходимым корецептором для моноцитотропных (M-тропных) штаммов ВИЧ- 1 (Deng, 1996; Doranz, 1996; Dragic, 1998). Несколькими неделями раньше было опубликовано сообщение о том, что корецептором для T-лимфоцитотропных (T-тропных) штаммов ВИЧ служит хемокиновый рецептор CXCR4 (фузин) (Feng, 1996). Моноцитотропные (M-тропные) штаммы ВИЧ-1 — это штаммы, которые хорошо размножаются в культурах макрофагов, не способные заражать T-клеточные линии (т. е. «бессмертные» или перевиваемые культуры T-лимфоцитов), однако легко инфицирующие T-лимфоциты, непосредственно выделенные из образцов периферической крови. T-тропные штаммы, наоборот, хорошо культивируются в T-клеточных линиях и плохо — в макрофагах, но также легко инфицируют T-лимфоциты, непосредственно выделенные из образцов периферической крови. Таким образом, как M-троп-

48

ные, так и T-тропные штаммы ВИЧ-1 легко заражают выделенные из периферической крови (не «бессмертные») T-лимфоциты человека in vitro.

Хемокины (хемотаксические цитокины) и их рецепторы изначально были описаны как факторы, усиливающие миграцию лейкоцитов (хемотаксис) и их провоспалительную активность. Хемокины представляют собой белки из 68-120 аминокислот; число аминокислот зависит от структуры общего для всех хемокинов цистеинового мотива. В зависимости от расположения цистеиновых остатков хемокины подразделяются на группы C-X-C (α-хемокины), C-C (β-хемокины) и C-хемокины (γ-хемокины). Большинство хемокинов высоко гомологичны между собой по структуре и могут связываться с одними и теми же рецепторами. Рецепторы к хемокинам принадлежат к семейству рецепторов с семью трансмембранными доменами и внутриклеточно сопряжены с G-белками.

Естественный лиганд хемокинового рецептора CXCR4 — фактор SDF-1 (stromal cell-derived fac- tor-1 [фактор, выделенный из стромальных клеток, 1]). Этот фактор предотвращает проникновение T-тропных штаммов ВИЧ-1 в активированные лимфоциты CD4. Хемокины RANTES и макрофагальные белки воспаления MIP-1α и MIP-1β являются естественными лигандами рецептора CCR5 и способны воспрепятствовать инфицированию T-лимфоцитов M-тропными штаммами ВИЧ-1. Роль корецепторов показана на рис. 3.4: T-тропные штаммы ВИЧ-1 заражают преимущественно активированные Т-лимфоциты CD4 периферической крови и клеточных линий, используя корецептор CXCR4 для проникновения в несущую рецептор CD4 клеткумишень. M-тропные штаммы способны заражать Т-лимфоциты CD4, моноциты и макрофаги; эти вирусам для проникновения в клетку нужны рецепторы CCR5 и CD4.

Этапы взаимодействия gp120 с клеточными рецепторами сегодня стали более понятны. Гликопротеин gp120 сначала связывается с определенными эпитопами рецептора CD4. После этого gp120 претерпевает конформационные изменения, обеспечивающие более эффективное взаимодействие его петли V3 с соответствующим корецептором. От связывания gp120 с корецептором зависит успешность слияния внешней оболочки вируса с клеточной мембраной. Гликопротеин gp41 (трансмембранная часть гликопротеина gp160 внешней оболочки вируса) играет ключевую роль в слиянии внешней оболочки вируса и клеточной мембраны. Предполагается, что gp41 действует подобно гемагглютинину вируса гриппа: после связывания gp120 с рецептором CD4 в gp41 происходят конформационные изменения, в результате которых гидрофобный N-концевой фрагмент gp41 внедряется в мембрану клетки-мишени. Предположение о том, что gp41 действует наподобие пружинной защелки, было подтверждено с помощью кристаллографического анализа его эктодоменных структур (Chan, 1997). После того, как были расшифро-

Рис. 3.4. Предотвращение проникновения в клетку М-тропных и Т-тропных штаммов ВИЧ путем связывания рецепторов хемокинов CCR5 и CXСR4 с их естественными лигандами

49

1 3. Патогенез ВИЧ-1-инфекции