5 курс / Инфекционные болезни / Доп. материалы / Патогенез,_диагностика_и_терапия_урогенитального_хламидиоза_Исаков

Глава 2. Лабораторная диагностика урогенитального хламидиоза

(Roche Amplicor PCR assay, Abbott LCR kit). Среди заведомо позитивных образцов 79 (97,5 %) были выявлены как позитивные (31–227,648 ко пий/мкл, M=4219 копий/мкл), но ни разу среди заведомо негативных образцов. Предложенный быстрый количественный РТ-ПЦР метод мо жет улучшить диагностику инфекций, вызванных C. trachomatis.

В сентябре 2007 г. в США была опубликована крайне интересная работа, в которой авторы предложили быстрый и чувствительный ме тод генотипирования вместе с микроэреем для диагностики бактери альных и вирусных инфекций верхних дыхательных путей (ИВДП) на основе стандартных методов амплификации и гибридизации, с при менением электрохимической детекции (ЭХД) на полупроводнико вом олигонуклеотидном микроэрее. Метод был разработан для обна ружения 4 бактериальных патогенов (Bordetela pertussis, Streptococcus pyogenes, Chlamydia pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae) и 9 вирусных (аденовирус 4, коронавирус OC43, 229E и HK, вирус гриппа A и B, па рагриппа тип 1, 2, 3, а также РС-вирус). Этот новый диагностический чип может служить основой для проведения полностью автоматизиро ванной диагностики, крайне гибкой и модифицируемой в зависимости от задач исследования, с возможностью определения дополнительных возбудителей. Большое количество зондов на гибкой основе позволяет сначала протестировать их эмпирически, с тем чтобы отобрать наибо лее специфические для последующего прицельного анализа. Поскольку в основе ЭХД лежит применение ферментативной реакции для появле ния электросигналов, которые затем непосредственно считываются с микроэрея, отсутствует необходимость в проведении анализа получен ных картин микроэрея или в применении дорогостоящей оптической сканирующей техники. Авторы показали высокую чувствительность и специфичность нового метода, достаточные для мультиплексного ана лиза (Lodes M. J. et al., 2007). Этот же метод ЭХД может быть использо ван для диагностики возбудителей ИППП.

По результатам сравнительного исследования эффективности куль турального метода и ПЦР (Cobas Amplicor, Roche) среди мужчин хлами дии были выявлены в уретре при отсутствии симптомов заболевания

41

Патогенез, диагностика и терапия урогенитального хламидиоза

в 10,3 % культуральным методом и в 11,6 % — в ПЦР. У мужчин с вы раженными симптомами за­болевания — в 13,7 % в культуральном тесте

ив 18,5 % — в ПЦР. Следовательно,­ чувствительность культурального теста у мужчин в уретре при невыраженных симптомах заболевания оказалась на 11 % меньше по сравнению с ПЦР; при выраженных сим птомах — на 26 % меньше. Раз­личия в показателях чувствительности указанных методов при взятии проб мочи существенно не отличались от уретральных соскобов (Van der Pol B. еt al., 2000).

ВНовом Южном Уэльсе (Австралия) при обследовании мазков из УГТ на хламидиоз количество мужчин с диагностированным обнару жением C. trachomatis на основании генетических методов (ПЦР) воз росло с 36 % в 1999 до 90 % в 2002 г., а женщин с 42 % в 1999 г. до 92 %. Образцы мочи подтверждали эти данные у двух третей мужчин и одной трети женщин (Majchrzak M. J., Stańczak G. P., 2005).

У женщин при невыраженных симптомах инфекции при анализе цервикальных соскобов с помощью культурального метода хламидии выявлены в 81 % случаев, с помощью ПЦР — в 98 %; при выраженных симптомах — соответственно в 84 и 96 %. Пробы мочи дали положи­ тельные результаты культурального метода и ПЦР соответственно в 87 и 91 % случаев. Следовательно, исследование проб мочи и церви кальных мазков одинаково эффективно для выявления хламидии, од нако по отдельности­ они не выявляют все случаи заболевания. Первая порция мочи предпочтительнее для анализа, чем вторая и последую щие, при этом перерыв­ с момента предыдущего мочеиспускания менее важен (Chernesky М. et al., 2003). Исследование проб мочи становится более популярным и у женщин, особенно в случаях, когда взять церви кальный мазок невозможно­. Комбинированный анализ цервикального

иуретрального мазков представляется более эффективным, чем анализ только одного из них. Результаты исследований свидетельствуют, что проведение комбинированного­ анализа уретрального и цервикального мазков или пробы­ мочи и цервикального мазка для определения хлами дий лучше, чем взятие только пробы мочи, при чувствительности ука занных тестов 98,4, 97,9 и 93,3 % соответственно. Авторами также было

42

Глава 2. Лабораторная диагностика урогенитального хламидиоза

сделано предположение,­ что цервикальный мазок может быть помещен в пробу мочи. С недавнего времени мазки из влагалища или вуль­вы так же стали использоваться для диагностики хламидий. Имеются данные, что чувствительность LCR (Abbot) для анализа цервикальных проб со ставляет 85,2 %, уретральных — 92,6 %, мазков из вульвы — 85,2 %, проб мочи — 85,2 % (Airell A. et al., 2000).

Влаборатории иммунологии СПб НИИЭМ имени Пастера в 2005– 2006 гг. было проведено исследование, направленное на изучение эф фективности трех классических методов при различных заболеваниях репродуктивной сферы. Анализировали результаты обследования 2641 женщины и 2410 мужчин в возрасте от 18 до 45 лет с различными за болеваниями урогенитального тракта (УГТ) и клинически здоровых. Исследование проводили с помощью следующих методик: прямая им мунофлюоресценциия (ПИФ), выделение на культуре клеток McCoy, иммуноферментный анализ — определение уровня специфических Ig G

иIgA и полимеразная цепная реакция (ПЦР). Первую группу составили пациенты с острыми воспалительными заболеваниями УГТ: острыми цервицитами, аднекситами, уретритами, простатитами, эпидидимита ми. В эту группу были включены 851 женщина и 730 мужчин. Вторая группа состояла из 1960 человек: 1020 женщин и 940 мужчин с хрони ческими заболеваниями — аднекситами, сальпингитами, уретритами, простатитами. В отдельную группу были выделены пациенты с диа гнозом бесплодия (450 женщин и 380 мужчин). Четвертая была пред ставлена людьми, которые считали себя здоровыми и обследовались по контакту (320 женщин и 360 мужчин) (табл. 8).

Впервой группе специфический антиген Chlamidia trachomatis был обнаружен у 16 % женщин и 23 % мужчин. Наличие антител выявлено у женщин в 8,3 %, у мужчин — в 3,2 % случаев. Культуры C. trachomatis были выделены у 2 % женщин и 12,6 % мужчин.

При хронических воспалительных заболеваниях у женщин хламидийный антиген выявлен у 20 % обследованных, выделено 179 культур (17,5 %), обнаружены специфические антитела в диагностических титрах у 34 % пациенток. У мужчин с хроническими уретритами

43

Патогенез, диагностика и терапия урогенитального хламидиоза

44

Глава 2. Лабораторная диагностика урогенитального хламидиоза

и простатитами положительные результаты ПИФ наблюдали в 8 % случаев, выделено 176 штаммов хламидий, а специфические антитела определялись у 12 % больных. Максимальную частоту выделения хламидийных штаммов наблюдали у женщин с диагнозом бесплодия (23 %). Антитела обнаружены у 38 % пациенток из этой группы. У мужчин с аналогичным диагнозом хламидии выделены в 17 % случаев, обнаружены антитела в 14 %. В группе людей, обследующихся по контакту или в связи с профилактическим осмотром, специфический антиген выявлен в 9 % проб у женщин и 10 % у мужчин, культуры хламидий выделены в 0,6 и 0,9 % случаев соответственно.

49 человек было обследовано параллельно ПИФ, ПЦР и культуральным методом. Абсолютное совпадение результатов было установлено в 34 случаях (69,4 %). У 8 пациентов (16,3 %) молекулярно-генетический метод дал положительный результат, антиген обнаружен у одного человека из этой группы, а роста бактерий на культуре клеток не было. При этом один эпизод являлся контролем лечения, а в другом случае имела место инфекция, сочетанная с хроническим трихомонозом.

У 7 (14,3 %) человек, наоборот, метод ПЦР не выявил инфекцию, но отмечали рост хламидий на культуре клеток и наличие антигена с помощью иммунофлюоресцентного метода. У одной пациентки из этой группы, возможно, имела место персистенция хламидий, так как выделенные бактерии не накапливались при двукратных пассажах на клетках McCoy. В шести других случаях штаммы хламидий были выделены после второго пассажа на клеточной культуре, в то время как для молекулярно-генетического исследования отбирали материал после первого пассажа. У трех человек этой группы в ПИФ выявлен хламидийный антиген.

Изучение сравнительной эффективности диагностических методов подтверждает необходимость комплексного исследования. Если это невозможно — следует выбирать методы, более информативные для данной нозологической формы. Например, при острых формах заболевания возможно широкое применение ПИФ, в то время как при хроническом течении возрастает эффективность культурального

45

Патогенез, диагностика и терапия урогенитального хламидиоза

метода и определения специфических антител. Преимущество ПЦР не вызывает сомнений при диагностике хронических бессимптомных форм, которые играют главную роль в распространении хламидийной инфекции.

Состояние местного иммунитета при хламидиозе довольно интенсивно изучается. Так, под наблюдением находилось 106 женщин репродуктивного возраста (20–35 лет) с выявленными ИППП (хламидиоз у 59 больных), а также 10 здоровых женщин в качестве контрольной группы. У всех женщин наряду с общепринятым набором общеклинических методов исследования, а также повторным обследованием на ИППП для выявления смешанных инфекций определяли концентрацию sIgA в секрете цервикального канала. Предварительно проводилась стандартизация метода определения концентрации sIgA(Могилевец Т. Л., 2002).

С целью изучения роли sIgA в местной защите при урогенитальном хламидиозе у женщин предварительно была проведена стандартизация метода определения концентрации sIgAв секрете цервикального канала с помощью твердофазного ИФА. В результате проведения данного исследования в группе здоровых женщин были получены результаты, используемые нами в дальнейшем как показатели нормы. При сравнении содержания sIgA в цервикальном секрете при различных ИППП без учета фазы менструального цикла достоверных различий выявлено не было. Это объясняется нестабильностью данного биологического субстрата у женщин. Учет функционального состояния организма выявил достоверные различия между показателями sIgA у здоровых женщин и женщин с выявленной хламидийной инфекцией (табл. 8). Концентрация sIgA в пробе, полученной в первую фазу менструального цикла, при хламидийной инфекции оказалась достоверно ниже (196±14,9 мкг/мл), чем в группе здоровых женщин (499±46 мкг/мл), а также при прочих ИППП (387±7,2 мкг/мл) (p <0,05).

Исследование цервикального секрета в экссудативную фазу достоверных различий между указанными группами не выявило. В связи с этим более целесообразно забор материала проводить в первую фазу менструального цикла. При сравнении содержания sIgA в первую фазу

46

Глава 2. Лабораторная диагностика урогенитального хламидиоза

менструального цикла при некоторых вариантах микст-инфекций с участием хламидий выявлена наиболее низкая концентрация IgAпри сочетании хламидийной инфекции и инфекции, вызванной ВПГ (123±27,7 мкг/мл). Достоверно выше в сравнении с данным вариантом сочетания концентрация IgA при монохламидиозе (202±16,9 мкг/мл), а также при хламидийно-уреаплазменной инфекции (218±44 мкг/мл) и хламидийнотрихомонадной (180±21,2 мкг/мл) (p < 0,05). Эти данные позволяют сделать вывод о том, что при хламидийной инфекции, в том числе в составе сложного паразитоценоза, иммунобиологическая реактивность цервикального секрета страдает более выраженно, чем при других ин фекциях урогенитального тракта (Могилевец Т. Л., 2002).

* Достоверные различия между показателями группы 2 и групп 1,3 (p < 0,05).

Известно, что одним из основных моментов в жизненном ци кле хламидий является процесс адгезии на мембране клетки-хозяина (Stamm W. E., Holmes K. K., 1984). Основная роль sIgA заключается в предотвращении этого процесса. Поэтому низкая концентрация sIgA при хламидиозе может объясняться тем, что sIgA, препятствуя адгезии хламидий к клеткам эпителия, со временем расходуется. Это приводит к беспрепятственному внедрению возбудителя в клетку и может спо собствовать развитию восходящей инфекции. Подтверждением этому

47

Патогенез, диагностика и терапия урогенитального хламидиоза

служит снижение содержания sIgA при отсутствии возбудителя во входных воротах инфекции, но его наличие в вышележащих органах, подтверждаемое результатами серологических исследований.

Эти данные согласуются с мнением о том, что местный иммуни тет может нейтрализовать инфекционную активность C. trachomatis, поскольку уровень секреторных IgA в цервикальной слизи обрат но пропорционален количеству хламидийных телец в половых путях (Коэн Р. К., Брунем Р. К., 1999). При сравнительном анализе динамики показателей секреторного иммунитета при эффективном и неэффек тивном лечении (табл. 10) выяснилось, что содержание sIgA в секрете цервикального канала при эффективной терапии достоверно повыша ется от 174±14,6 до 234±15,2 (p <0,05). При неэффективной терапии со держание sIgA продолжает снижаться (p>0,05). Следовательно, содер жание sIgA в секрете цевикального канала может быть использовано в качестве дополнительного критерия оценки эффективности терапии (Могилевец Т. Л., Чеботкевич В. Н., 2001; Могилевец Т. Л., 2002). Однако следует обратить внимание на то, что восстановление уровня sIgA идет медленно по причине иммуносупрессивного действия антибактериаль ной терапии и показатели sIgA длительно остаются даже при условии эффективной терапии на низком уровне.

В ходе исследования не выявлено корреляционной зависимости между содержанием sIgA в цервикальном секрете и сывороточным не специфическим IgA (rxy=0,06, p <0,05), а также с другими показате лями общего иммунного ответа, что указывает на преимущественно локальный синтез sIgA и самостоятельное его значение в иммунологи ческой защите. Обнаруженная положительная корреляционная связь между sIgA цервикального секрета и специфическим антихламидий ным сывороточным IgA (rxy=0,72; p <0,05) обусловлена, очевидно, тем, что наиболее высокие показатели специфического иммунного ответа свойственны острой фазе инфекционного процесса, при которой уро вень sIgA снижается меньше. Таким образом, уровень sIgA в секрете цервикального канала отражает напряженность местных факторов иммунной защиты, характеризует течение инфекционного процесса

48

Глава 2. Лабораторная диагностика урогенитального хламидиоза

и может использоваться в качестве дополнительного критерия оценки эффективности терапии (Архипов Г. С., Могилевец Т. Л., 2001; Могилевец Т. Л., 2002).

Таблица 10

Динамика показателей sIgA в первую фазу менструального цикла при эффективном и неэффективном лечении хламидиоза

* Достоверные различия между показателями до и после лечения (p < 0,05).

Имеются данные о высокой частоте обнаружения местных IgA к хламидиям при хроническом простатите, по сравнению с другими ла бораторными показателями­. Высказывается­ предположение о том, что выработка секреторных Ig предшествует­ появлению сывороточных IgA и что последние — производные секреторных иммуноглобулинов (Tsunekawa T. еt al., 1991). Специфические­ IgG намного реже по срав нению с IgA определялись в эякуляте,­ однако достаточно часто в сыво ротке крови; по IgA наблюдается обратная тенденция. Имеются данные о том, что у 46–75 % мужчин с противохламидийными AT класса А в сперме в сыворотке указанная разновидность иммуноглобулинов не обнаруживалась (Eggert-Kruse W. et al., 2003). Появле­ние противохлами дийных антител часто сочетается с антителами к сперматозоидам, что приводит к снижению подвижности последних и формированию бес плодия. Это связано с выработкой перекрестных­ аутоантител к Chps60 и hps60 сперматозоидов. Однако имеются противоположные данные­ о том, что наличие секреторных IgA в эякуляте не приводит к нарушению­ спермограммы (Bollmann R. et al., 2001). He доказана корреляция между наличием диагностических титров секреторных IgA к хламидиям и об наружением самого возбудителя в половых путях у мужчин другими лабораторными тестами (культуральным, ПЦР и ИФА) (Gdoura R. et al.,

49

Патогенез, диагностика и терапия урогенитального хламидиоза

2001). Необходимо отметить, что установлена связь между обнаруже­ нием секреторных IgA у мужчин и трубным бесплодием у половых пар тнеров (Gdoura R., 2001), а также между их наличием у бессимптомных бесплодных мужчин и повышенным риском инфицирования­ половых партнеров (Penna V. S. еt al., 2001). Обобщая вышеизложенное, следует отметить, что вопрос о целесообразности и возможности поиска IgA в цервикальном секрете и сперме еще нуждается в дальнейшем изуче нии.

Как указывалось выше, состояние местного иммунитета при УГХ имеет диагностическую и прогностическую ценность. Так, снижение sIgA (секреторного IgA) в секрете цервикального канала женщин при УГХ и нормализация этого показателя после терапии позволяет исполь зовать данный тест для контроля эффективности лечения. Широко ис пользуется определение титра антител IgG в ИФА. Разовый результат, полученный таким образом, практически неинформативен, т. к. он не предоставляет возможность исключить анамнестические титры, кото рые могут быть как после встречи с возбудителем, не закончившейся инфекцией, так и после лечения. Титры антител могут держаться 6 мес. и более. На титр IgG можно ориентироваться лишь в случае исследова ния парных сывороток. Если происходит положительная сероконверсия (увеличение титра антител через 2 недели в 4 раза и более), то можно говорить о развитии инфекции. И наоборот, снижение титра антител в динамике свидетельствует о тенденции к выздоровлению или санации от хламидий.

Перспективнее определение в диагностических титрах хламидий ных антител IgA (≥1/8) и IgM (≥1/32), которые свидетельствуют о те кущей инфекции, но могут и отсутствовать в связи со слабой иммуно генностью хламидий и нарушениями иммунитета (Нуралова И. В. и др., 2007). Метод непрямой иммунофлуоресцении (НПИФ) имеет равную с ИФА чувствительность и специфичность, но не поддается автомати зации и связан с субъективной оценкой результатов анализа. Однако именно он позволил авторам в сопоставительном исследовании пока зать высокую информативность обнаружения специфического (хлами

50