2 курс / Гистология / Золотухина_И_А_Функциональная_морфология_эпителия_ворсин_плаценты

полудесмосом эпителиоцитов вглубь этой пластинки, пересекая ее,

направляются тонкие якорные филаменты.

Темная пластинка — толщина 50-60 нм, представляет собой мелкозернистый или фибриллярный слой, который расположен под светлой пластинкой и обращен в сторону соединительной ткани. В

пластинку вплетаются якорные фибриллы, имеющие вид петель

(образованы коллагеном VII типа). Темная пластинка состоит из коллагена

IV, энтактина, а также гепарансульфата. Коллаген IV типа обеспечивает механическую прочность мембраны. Энтактин связывает между собой ламинины, они представляют собой гликопротеиды состоящие из α1, α2,

α3, α5, β1, β2, γ1 цепей, и находятся на протяжении всей беременности в базальной мембране, за исключением периода формирования новых ворсин [25, 108]. Также ламинины базальной мембраны трофобласта обеспечивают связь с экстравиллезным ЦТ [109]. Гепарансульфат участвует в клеточной адгезии и обладает ангигенными свойствами.

Ретикулярная пластинка — состоит из ретикулярных волокон соединительной ткани, которые связанны с якорными фибриллами.

В гестационном сроке 3-4-и недели базальная мембрана представлена коллагеном IV типа, в виде тонкой, прерывистой нити неравномерной толщины, которая в среднем составила 0,17±0,007 мкм [8].

На 5-6-й неделях ее толщина составляет 0,21 ±0,013 мкм., в 7 - 9 недель гестации - это волокнистая линия, состоящая из коллагена IV типа,

толщиной составляет 0,23±0,21 мкм. [8]. К концу второго триместра беременности базальная мембрана эпителия составляет 0,30±0,022 мкм.. В

доношенной плаценте происходит слияние базальных мембран трофобластического эпителия и базальной мембраны эндотелия капилляра.

В зоне синцитио-капиллярных мембран толщина базальной мембраны составляет 0,21 ±0,017, а вне зоны синцитио-капиллярных мембран - 0,46±0,024 мкм. [8].

31

1.7. Современные представления о различных типах питания

эмбриона и плода

У всех млекопитающих питание бластоцисты вначале осуществляется гистиотрофно, когда трофобласт фагоцитирует секрет,

продуцируемый маточными железами примерно до 8-й недели [44]. После имплантации и становления хориоаллантоисной плаценты налаживается транзит гемохориального питания, который устанавливается между матерью и плодом. У человека этот процесс инвазивной природы реализуется только в конце I триместра. Во время ранней беременности материнские белки избирательно аккумулируются в жидкость экстраэмбрионального целома, которая в дальнейшем транспортируется плоду через вторичный желточный мешок. Гистиотрофный тип питания обеспечивает плод во время I триместра, причем этот обмен происходит при низкой концентрации кислорода. Показано, что в сроке до 10-12

недель гестации напряженность кислорода в материнской плазме,

окружающей хориальные ворсинки, менее

20 mm Hg, что уменьшает риск ранних оксидантных повреждений во время ответственного периода органогенеза. Затем напряженность кислорода повышается до 40-80 mm Hg и остается таковой в течение следующих двух триместров [91, 105, 167]. Эти данные согласуются с более ранними работами, авторы которых с помощью кислородного электрода измерили парциальное давление в плацентарной ткани I

триместра беременности и установили, что в сроке 8-10 недель гестации уровень кислорода в плаценте низкий, к 12-13 неделям увеличивается, что,

по-видимому, связано с началом непрерывного маточно-плацентарного кровотока [152]. Гемохориальный тип питания становится главным во II

триместре беременности, когда маточно-плацентарная циркуляция стабилизируется [44]. Несмотря на достоверность приведенных фактов,

32

они не сопоставлены с динамикой развития ворсинчатого дерева плаценты и строением эпителия ворсин.

Анализ литературных данных показал, что изучению плаценты посвящено множество работ как отечественных, так и зарубежных ученых. Но все эти исследования имеют фрагментарный характер:

изучаются отдельные компоненты плаценты, чаще всего без ссылок на гестационный возраст, либо указывается постменструальный срок беременности даже для плацент I триместра, что требует его перевода в постовуляционный срок, часто используют ограниченное количество методик, что не дает полного представления о морфологической дифференцировке эпителия ворсин плаценты в связи с меняющимися потребностями эмбриона, а впоследствии и плода. Это в значительной мере затрудняет создание целостного представления об особенностях морфологической структуры эпителия ворсин плаценты в разные периоды физиологической беременности, и не позволяет точно оценить патологию плацент при различных акушерских осложнениях. Все вышеперечисленные аспекты обусловили наш интерес к данной проблеме.

33

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Группы исследуемого материала

Для решения поставленных задач были собраны материалы медицинских абортов у здоровых женщин, пожелавших прервать беременность на разных сроках. Особое внимание обращали на уточнение гестационного срока. Подбор женщин осуществляли в соответствии с клиническими показаниями и противопоказаниями. Для уточнения гестационного срока перед медицинским абортом у женщин с помощью УЗИ определяли темя-копчиковые размеры эмбриона (КТР) и

рассчитывали менструальный срок минус 2 недели.

1 группа – 10 наблюдений раннего лекарственного аборта с помощью введения женщинам препарата «Мифегин» в 4 недели (нед.)

после оплодотворения (п.о.); выкидыш происходил через 1-2 суток обычно в виде целого хориального мешка.

2 группа – 10 наблюдений раннего лекарственного аборта с помощью введения женщинам препарата «Мифегин» в 5 нед. п.о. после предварительного УЗИ эмбриона.

3 группа – 9 наблюдений медицинских абортов путем вакуум -

экстракции и соскоба из полости матки у здоровых женщин на 6 нед. п.о.

Уточнение срока проводили по выявлению эритробластов (ядерных эритроцитов) в узких капиллярах [10].

4 группа – 8 наблюдений аналогичных медицинских абортов на 7

нед. п.о. Уточнение сроков по выявлению первых безъядерных эритроцитов в капиллярах [10].

5 группа – 9 наблюдений аналогичных медицинских абортов на 8

нед. п.о. Срок уточняли по преобладанию безъядерных эритроцитов в капиллярной сети ворсин.

6 группа – 10 наблюдений на 9-10 нед. п.о. Срок уточняли по УЗИ

размеров эмбриона.

34

7 группа – 11 наблюдений поздних медицинских абортов на 18-24

неделях беременности (постменструальный срок, п.м.) у здоровых женщин по медицинским показаниям с помощью введения препарата «Энзапрост» в околоплодные воды.

8 группа – 9 наблюдений самостоятельных родов в сроке 39-40

недель, протекавших без осложнений.

2.2. Особенности взятия материала

Каждая из 8 представленных групп характеризовалась некоторыми особенностями взятия материала. В частности, в 1-ой и 2-ой группах целые хориальные мешки помещали в физиологический раствор в чашках Петри,

где визуально выявляли гладкий хорион с небольшим количеством генераций отходящих ворсин и ветвистый хорион – противоположный сегмент мешка с более разветвленной сетью ворсин. Из двух указанных сегментов вырезали небольшие кусочки ворсин с соответствующей маркировкой. С 3 по 7-ую группы материал соскоба предварительно отмывали от крови и выборочно забирали фрагменты, напоминающие

«икру», т.е. ворсины плаценты. В 7- 8-ой группе выделяли целые плаценты, из которых забирали ткань из разных участков не менее 7-8

кусочков. Забор кусочков ткани плаценты, размером 1,0х 0,5х 0,5 см,

осуществляли из центральной, парацентральной и краевой частей. Кроме того, один кусочек брали с хориальной пластинкой, другой – с

материнской поверхности.

2.3. Гистологический и электронно-микроскопический методы

Взятые образцы фиксировали 10% нейтральным формалином,

проводили по спиртам восходящих концентраций и ксилолу, заливали в парафин. Из парафиновых блоков готовили срезы толщиной 5-6 мкм и окрашивали их гематоксилином и эозином.

35

Для электронно-микроскопического исследования отбирали по 5

случаев из каждой группы плацент. Вырезали кусочки 1мм³,

префиксировали их в 2,5% растворе глутарового альдегида на фосфатном буфере, промывали и дофиксировали в 1% растворе четырехокиси осмия,

контрастировали в кусочках уранилацетатом и после обезвоживания заливали в смесь эпона с аралдитом. Ультратонкие срезы контрастировали цитратом свинца по методу Рейнольдса и просматривали в электронном микроскопе «Jem – 100B» при различных увеличениях.

2.4. Иммуногистохимический метод

Иммуногистохимическое исследование выполняли на депарафинизированных срезах непрямым иммунопероксидазным методом.

Для характеристики отдельных компонентов эпителия ворсин использовали следующие антитела и технологические детали:

1.Антитело против плацентарной щелочной фосфатазы (ПЩФ) для выявления щеточной каймы (Novocastra, клон RTU - PLAP-8А9).

2.Антитело против β субъединиц хорионического гонадотропина человека (β-ХГЧ) в синцитиотрофобласте ворсин (Novocastra NCLHCGp) (после воздействия трипсина);.

3.Маркер (Ki67) для выявления пролиферации цитотрофобласта

(Novocastra, клон ММ1).

Для демаскирования антигена стекла со срезами нагревали в микроволновой печи с 0,01М (pH 6,0) цитратным буферным раствором в течение 10 минут при мощности 450Вт (ПЩФ), затем после доливки буфера еще 10 мин при мощности 300Вт (Ki – 67, β-ХГЧ). Для подавления активности эндогенной пероксидазы срезы инкубировали 10 мин. с 0,5%

раствором перекиси водорода, а для предотвращения неспецифической адсорбции первичных антител, срезы инкубировали с 5% лошадиной сывороткой в течение 10 мин. Инкубация с первичными моноклональными

антителами проводилась при комнатной температуре в течение 10 мин.

36

(ПЩФ, Ki – 67) и 30 мин. (β-ХГЧ). После каждой процедуры обработки срезы промывали в TBS (Трис-буфере) pH 7,6 в течение 2-5 мин.

Инкубация с вторичными биотинилированными антителами при комнатной температуре в течение 10 мин. Для визуализации иммунной реакции использовали 3,3 – диаминобензидиновую систему детекции

(Субстратная система DAB Плюс / DAB Plus Substrate System). Затем докрашивали срезы гематоксилином Майера.

Степень окрашивания оценивали в баллах (Рис. 2), как отрицательную (негативную) (0), слабую (1), умеренную (2) и выраженную

(3).

Рис.1. Шкала для оценки иммуноэкспрессии в баллах.

2.5.Морфометрический метод

Спомощью микроскопа Leica DM 2500 с цифровой фотокамерой изображение ворсин при увеличении х100 передавалось на экран компьютера. По программе Adobe Photoshop Cs3 Extended проводили морфометрическую оценку новых генераций ворсин в поперечном сечении, а именно ворсин небольшого диаметра, округлой или овальной формы, определяли: 1) по внешнему контуру эпителиального покрова –

площадь ворсин (мкм²); 2) по внутреннему его контуру – площадь стромы

(мкм²); 3) по их разнице – площадь эпителия (мкм²).

37

2эпителия.

Рис. 2. Схема. Ворсина плаценты в поперечном срезе.

2.6. Статистическая обработка

Полученные данные были проверены на нормальность распределения при помощи критерия Колмогорова-Смирнова в программе

Statistica 6,0 из расчета около 100 ворсин на каждый гестационный срок.

Количественные показатели площади ворсин, площади стромы и площади трофобластического эпителия, были обработаны параметрическими методами вариационной статистики, сравнение групп проводили с помощью t-критерия Стьюдента. В сравниваемых группах определяли среднюю арифметическую величину (М) и стандартную ошибку (m), при нормальном распределении статистический анализ проводили с помощью t-критерия Стьюдента, а при распределении, отличающемся от нормального, применяли критерий Манна-Уитни. Различия считали значимыми при пороговом уровне значимости р ≤ 0,05.

Расчет количества свободных симпластов, производили путем подсчета их количества на 100 ворсин в поле зрения. Учитывали только симпласты, находившиеся в межворсинчатом пространстве, с четкой щеточной каймой и конгломератом ядер, без каких-либо признаков стромы и капилляров, чтобы избежать включения тангенциальных срезов концевых отделов мелких ворсин.

Индекс пролиферации расчитывался, путем подсчета Ki – 67

иммунопозитивных ядер на 100 ядер в 10 полях зрения.

38

Глава 3. СОБСТВЕННЫЕ ДАННЫЕ

Структурно-функциональные изменения эпителия ворсин и его производных в течение неосложненной беременности

3.1. Ворсинчатое дерево плаценты на 4 неделе гестации после оплодотворения

На данном сроке хориальные мешки представляли собой центральную свободную полость со стенкой, состоящей из экстраэмбриональной мезенхимы в виде рыхлорасположенных клеток с длинными отростками, соединявшими эти клетки друг с другом. Изнутри к мезенхиме прилегала амниотическая мембрана, а также отдельные фрагменты желточного мешка и эмбриона. Снаружи стенка хориального мешка представлена отходящими выростами мезенхимы, которые покрыты двухслойным трофобластическим эпителием, то есть вторичными или мезенхимальными ворсинами (рис. 3А). При изучении хориона выявлена четкая разница в количестве генераций вторичных ворсин в гладком и ветвистом отделе мешка. Если в гладком хорионе ворсины были представлены лишь 2-3 генерациями, то в ветвистом хорионе насчитывалось 4-5 генераций вторичных ворсин с признаками васкулогенеза в строме (рис. 3Б). Особое внимание было обращено на структуру трофобластического эпителия ворсин в данном сроке, средняя площадь которого составила 4863±248 (р>0,05) (табл. 2).

В структурном отношении трофобласт ворсин имел двухслойное строение (Рис. 4А) со сплошным поверхностным слоем синцитиотрофобласта (СТ) и тесно расположенными клетками цитотрофобласта (ЦТ).

Важно отметить, что на 4-ой неделе гестации в СТ выявляются локальные скопления ядер, так называемые синтициальные почки. Также

нами обнаружены симпласты различной формы с большим количеством

39

А

Б

Рис.3. Ворсинчатое дерево плаценты на 4 неделе после оплодотворения. Окраска гематоксилином и эозином, х200:, А - стенка хориального мешка (→) с 2-3-я генерациями мелких ворсин в составе гладкого хориона;

Б - группа более крупных ворсин у стенки хориального мешка (→), составляющая ветвистый хорион. 200 200

40