6 курс / Гастроэнтерология / Российский_журнал_гастроэнтерологии,_гепатологии,_колопроктологии (49)

эластометрию, фибро- и акти-тест в широкой клинической практике как скрининг-тесты фиброза печени у больных ХВГ.

6.Эластометрия может применяться для неинвазивной диагностики динамики фиброза печени на фоне проведения курса противовирусной терапии.

7.Существенным ограничением использования фибро- и акти-теста служит наличие синдрома

Список литературы

1.Глушенков Д.В., Коновалова О.Н., Павлов Ч.С. и др. Неинвазивная диагностика фиброза печени на ранних стадиях его развития // Рос. журн. гастроэнтерол. гепатол. колопроктол. – 2008 (в печати).

2.Глушенков Д.В., Павлов Ч.С., Золотаревский В.Б.,

Ивашкин В.Т. Клиническое значение акти-теста в оценке активности хронического гепатита HCV/HBV

//Рос. журн. гастроэнтерол. гепатол. колопроктол.

– 2008. – Т. 18, № 1 (прил. 31). – С. 24.

3.Глушенков Д.В., Павлов Ч.С., Золотаревский В.Б.,

Ивашкин В.Т. Чувствительность и специфичность фибро-теста у больных ХГС/ХГВ на разных стадиях фиброза печени // Рос. журн. гастроэнтерол. гепатол. колопроктол. – 2008. – Т. 18, № 1 (прил. 31). – С. 25.

4.Глушенков Д.В., Павлов Ч.С., Маевская М.В.,

Ивашкин В.Т. Возможности эластометрии и фибротеста в диагностике цирроза печени // Рос. журн. гастроэнтерол. гепатол. колопроктол. – 2008 – Т. 18, № 1 (прил. 31). – С. 9.

5.Ивашкин В.Т. Оценка функционального состояния печени // Болезни печени и желчевыводящих путей / Под ред. В.Т. Ивашкина. – 2-е изд., испр. и доп. – M.: Изд. дом «М-Вести», 2005. – C. 66–84.

6.Павлов Ч.С. Принципы диагностики и подходы к терапии фиброза и цирроза печени // Рос. мед. журн.

– 2007. – Т. 9, № 1. – С. 11–15.

7.Павлов Ч.С. Эластометрия или биопсия печени: как сделать правильный выбор? // Рос. мед. вести. – 2008.

– Т. 12, № 1. – С. 31–37.

8.Павлов Ч.С., Галимова С.Ф., Ивашкин В.Т. и др. Динамика гистологической активности хронического гепатита В (ХВГ-В) у больных, леченных ламивудином

//Рос. журн. гастроэнтерол. гепатол. колопроктол. – 2006. – Т. 16, № 1 (прил. 27). – С. 39.

9.Павлов Ч.С., Глушенков Д.В., Золотаревский В.Б. и

др. Диагностическая точность эластометрии у больных ХГС/ХГВ на разных стадиях фиброза печени // Рос. журн. гастроэнтерол. гепатол. колопроктол. – 2007.

– Т. 17, № 5 (прил. 30). – С. 90.

10.Павлов Ч.С., Глушенков Д.В., Золотаревский В.Б.

и др. Эластометрия у больных ХГС на ранних стадиях фиброза печени // Рос. журн. гастроэнтерол. гепатол.

колопроктол. – 2007. – Т. 17, № 5 (прил. 30). – С. 90.

11.Павлов Ч.С., Глушенков Д.В., Золотаревский В.Б.,

Ивашкин В.Т. Оценка фиброза печени у больных НАСГ с использованием метода эластометрии // Рос. журн. гастроэнтерол. гепатол. колопроктол. – 2008.

– Т. 18, № 1 (прил. 31). – С. 65.

12.Павлов Ч.С., Глушенков Д.В., Коновалова О.Н. и др. Результаты первого Российского сравнительного исследования чувствительности и специфичности эластометрии и фибро-теста у больных хроническими вирусными гепатитами // Рос. журн. гастроэнтерол. гепатол. колопроктол. – 2008. – Т. 18, № 1 (прил. 31). – С. 36.

13.Павлов Ч.С., Золоторевский В.Б., Томкевич М.С. и

др. Возможность обратимости цирроза печени (клинические и патогенетические предпосылки) // Рос. журн.

холестаза, проявляющегося повышением уровня билирубина и ГГТП у больных хроническими диффузными заболеваниями печени.

8. Дальнейшее расширение показаний к применению неинвазивных тестов возможно только после сравнительных исследований с сопоставлением полученных результатов с данными биопсии у больных хроническими заболеваниями печени другой этиологии.

гастроэнтерол. гепатол. колопроктол. – 2006. – Т. 16,

№ 1. – С. 20–29.

14.Павлов Ч.С., Золоторевский В.Б., Ивашкин В.Т. и

др. Динамика показателей воспаления и фиброза печени у больных хроническим вирусным гепатитом С (ХВГ-С) на фоне комбинированной терапии (интерфероном-α + рибавирином) // Рос. журн. гастроэнтерол. гепатол.

колопроктол. – 2006. – Т. 16, № 1 (прил. 27). – С. 45.

15.Павлов Ч.С., Золоторевский В.Б., Ивашкин В.Т. и

др. Современные методы ранней диагностики фиброза печени // Клин. мед. – 2005. – Т. 83, № 12. – С. 58– 60.

16.Павлов Ч.С., Ивашкин В.Т. Биопсия печени: методология и практика сегодня // Рос. журн. гастроэнтерол. гепатол. колопроктол. – 2006. – Т. 16, № 4. – С. 65– 78.

17.Павлов Ч.С., Ивашкин В.Т. Как оценить и уменьшить риск фиброза, цирроза и гепатоцеллюлярной карциномы у пациентов с хронической инфекцией вирусами гепатитов В и С // Рос. журн. гастроэнтерол. гепатол. колопроктол. – 2007. – T. 17, № 5. – C. 16–23.

18.Павлов Ч.С., Котович М.М. Место биопсии и морфологического исследования ткани печени у детей и взрослых в практике клинициста // Клин. мед. – 2007.

– Т. 85, № 9. – С. 72–77.

19.Павлов Ч.С., Ондос Ш.А., Глушенков Д.В., Иваш­ кин В.Т. Эластометрия в оценке динамики фиброза печени у больных хроническим гепатитом С (ХГС), леченных Пег-интерфероном-α и рибавирином // Рос. журн. гастроэнтерол. гепатол. колопроктол. – 2008. – Т. 18, № 1 (прил. 31). – С. 37.

20.Barreiro P., Martin-Carbonero L., Nunez M. et al. Predictors of liver fibrosis in HIV-infected patients with chronic hepatitis C virus (HCV) infection: assessment using transient elastometry and the role of HCV genotype 3 // Clin. Infect. Dis. – 2006. – Vol. 42, N 7. – P. 1032– 1039.

21.Beaugrand M. How to assess liver fibrosis and for what

purpose? // J. Hepatol. – 2006. – Vol. 44, N 3. –

P. 444–445.

22.Beaugrand M. Liver stiffness measerement: new tool to assess liver fibrosis // EASL Single Topic Conference on The role of liver biopsy in diagnosis and menagement of chronic liver disease. June 14–15, 2004, Torino, Italy.

23.Blanc F., Bioulac-Sage P., Balabaud C., Desmouliere A.

Investigation of liver fibrosis in clinical practice // Hepatol. Res. – 2005. – Vol. 27.

24. Castera L., Foucher J., Bertet J. et al. FibroScan and FibroTest to assess fibrosis in HCV with normal aminotransferases // Hepatology. – 2006. – Vol. 43, N 2. – P. 373–374.

25.Castera L., Vergniol J., Foucher J. et al. Prospective comparison of transient elastography, Fibrotest, APRI and liver biopsy for the assessment of fibrosis in chronic hepatitis C // Gastroenterology. – 2005. – Vol. 128. – P. 343–350.

26.Colloredo G., Guido M., Sonzogni A., Leandro G.

Impact of liver biopsy size on histological evaluation of chronic viral hepatitis: the smaller the sample, the milder

the disease // J. Hepatol. – 2003. – Vol. 39. – P. 239– 244.

27.Ferard G., Piton A., Messous D. et al. Intermethod calibration of alanine aminotransferase (ALT) and gammaglutamyltransferase (GGT) results: application to FibroTest and ActiTest scores // Clin. Chem. Lab. Med.

–2006. – Vol. 44. – P. 400–406.

28.Foucher J., Castera L., Bernard P.H. et al. Prevalence and factors associated with failure of liver stiffness measurement using FibroScan in a prospective study of 2114 examinations // Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. – 2006. – Vol. 18, N 4. – P. 411–412.

29.Ghany M., Doo E. Assessment of liver fibrosis: palpate, poke or pulse? // Hepatology. – 2005. – Vol. 42, N 4. – P. 759–761.

30.Guechot J., Laudat A., Loria A. et al. Diagnostic accuracy of hyaluronan and type III procollagen aminoterminal peptide serum assays as markers of liver fibrosis in chronic viral hepatitis C evaluated by ROC curve analysis // Clin. Chem. – 1996. – Vol. 42. – P. 558– 563.

31.Kelleher T.B., Afdhal N. Noninvasive assessment of liver fibrosis // Clin. Liver Dis. – 2005. – Vol. 9, N 4.

–P. 667–683.

32.Laharie D., Zerbib F., Adhoute X. et al. Diagnosis of liver fibrosis by transient elastography (FibroScan) and non-invasive methods in Crohn’s disease patients treated with methotrexate // Aliment. Pharmacol. Ther. – 2006. – Vol. 23. – P. 1621–1628.

33.Luo J.W., Shao J.H., Bai J. et al. Using non-invasive transient elastography for the assessment of hepatic fibrosis // Zhonghua Gan Bing Za Zhi. – 2006. – Vol. 14, N 5. – P. 395–397.

34.Maida I., Nunez M., Jose Rios M. et al. Severe liver disease associated with prolonged exposure to antiretroviral drugs // J. Acquir. Immune Defic. Syndr. Hum. Retrovirol. – 2006. – Vol. 42, N 2. – P. 177– 182.

35.Mendoza J., Gomez-Dominguez E., Moreno-Otero R.

Transient elastography (Fibroscan), a new non-invasive method to evaluate hepatic fibrosis // Med. Clin. (Barc). – 2006. – Vol. 126, N 6. – P. 220–222.

36.Myers R.P., de Torres M., Imbert-Bismut F. et al. Biochemical markers of fibrosis in patients with chronic hepatitis C: a comparison with prothrombin time, platelet

count and the age-platelet index // Dig. Dis. Sci. – 2003. – Vol. 48. – P. 146–153.

37.Myers R.P., Ratziu V., Charlotte F. et al. Biochemical markers of liver fibrosis: a comparison with historical features in patients with chronic hepatitis C // Am. J. Gastroenterol. – 2002. – Vol. 97. – P. 2419–2425.

38.Paradis V., Mathurin P., Ratziu V. et al. Binding of apolipoprotein A-I and acetaldehyde-modified apolipoprotein A-I to liver extracellular matrix // Hepatology. – 1996. – Vol. 23. – P. 1232–1238.

39.Poynard T. A prospective assessment of the interlaboratory variability of biochemical markers of fibrosis (FibroTest) and activity (ActiTest) in patients with chronic liver disease // Comp. Hep. – 2002. – Vol. 2. – P. 3–7.

40.Poynard T. Cost effectiveness of pegylated interferon alpha 2b and ribavirin combination in chronic hepatitis C // Gut. – 2003. – Vol. 52. – P. 1532.

41.Poynard T., Bedossa P., Mathurin P. et al. Apolipoprotein A1 and hepatic fibrosis // J. Hepatol. – 1995. – Vol. 22.

– P. 107–110.

42.Poynard T., Imbert-Bismut F., Ratziu V. et al. Bioche­ mical markers of liver fibrosis in patients infected by hepatitis C virus: longitudinal validation in a randomized trial // J. Viral Hep. – 2002. – Vol. 9. – P. 128–133.

43.Poynard T., Imbert-Bismut F., Ratziu V. et al. Fibro­

Test even better than liver biopsy? // Clin. Chem.

Vol. 14. – P. 543–548.

45.Ratziu V., Charlotte F., Heurtier A. et al. for the LIDO Study Group. Sampling variability of liver biopsy in nonalcoholic fatty liver disease // Gastroenterology. – 2005. – Vol. 128. – P. 1898–1906.

46.Sandrin L., Fourquet B., Hasquenoph J.M. et al.

47.Ziol M., Handra-Luca A., Kettaneh A. et al. Non-invasive assessment of liver fibrosis by stiffness measurement: a prospective multicentre study in patients with chronic hepatitis C // Hepatology. – 2005. – Vol. 41, N 1. – P. 48–54.

Цель исследования. Комплексный анализ спектра соматических мутаций в генах TP53, APC, k-Ras и BRAF у российских пациентов со злокачественными новообразованиями, полипами и воспалительными заболеваниями толстой кишки (ТК), оценка диагностической информативности такого анализа.

Материал и методы. Проведен анализ соматических мутаций генов APC, k-Ras, TP53 и BRAF в биоптатах или операционном материале у больных с аденокарциномой (n=24), аденоматозными полипами (n=37), гиперпластическими полипами (n=17) и воспалительными заболеваниями ТК (n=69), а также у пациентов контрольной группы с синдромом раздраженного кишечника (n=25). Определение нуклеотидной последовательности генов осуществляли с использованием набора ABI Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit на автоматическом секвенаторе ABI Prism 3100 Genetic Analyzer («Applied Biosystems», США; «Hitachi»,

Япония) в соответствии с инструкцией производителя, a также с использованием оригинального метода масс-спектрометрического минисеквенирования.

Результаты. Охарактеризовано 50 патогенных вариантов соматических мутаций: 31 – в гене APC, 5

– в гене k-Ras и 14 – в гене TP53. Мутаций в гене BRAF обнаружено не было. Выявлено 12 новых, неопубликованных ранее вариантов мутаций гена APC и одна протяженная делеция в гене TP53. Общая выявляемость мутаций у пациентов с аденокарциномами составила 66%, при аденоматозных и гиперпласти-

Aim of investigation. Complex analysis of a spectrum of somatic mutations in TP53, APC, k-Ras and BRAF genes in Russian patients with malignant neoplasms, polyps and inflammatory diseases, evaluation of diagnostic information value of such analysis.

Stuff and methods. Analysis of somatic mutations of APC, k-Ras, TP53 and BRAF genes in biopsy samples or surgical specimens in patients with adenocarcinoma (n=24), adenomatous polyps (n=37), hyperplastic polyps (n=17) and inflammatory bowel diseases (n=69), as well as for patients with irritable bowel syndrome, that formed a control group (n=25) was carried out. DNA sequencing was performed with the ABI Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit on the ABI Prism 3100 Genetic Analyzer («Applied Biosystems», USA; «Hitachi», Japan) according to the manufacture manual as well as with use of original mass-spectrometry minisequencing method.

Results. 50 pathogenic somatic mutations were determined: 31 – in APC gene, 5 – in k-Ras gene and 14 – in TP53 gene. Mutations in BRAF gene were not revealed. 12 novel somatic mutations of APC gene and one extended deletion in gene TP53 were revealed. General detectability of mutations in adenocarcinoma patients was 66%, in adenomatous and hyperplastic polyps – 49 and 59% respectively. Mutations were not found in patients with inflammatory bowel diseases and control group patients. Potential diagnostic sensitivity of these mutations for diagnostics of colorectal neoplasms was

ческих полипах – 49 и 59% соответственно. У больных с воспалительными заболеваниями кишечника и пациентов контрольной группы мутаций не найдено. Потенциальная диагностическая чувствительность при использовании охарактеризованных мутаций для выявления новообразований ТК составляет 58% (95% доверительный интервал 47–69%) при 100% специфичности метода.

Заключение. Показано статистически достоверное различие в частоте мутаций гена TP53 у больных с аденокарциномами и пациентов с доброкачественными новообразованиями ТК (p=0,02). Обсуждается информативность использования исследованных генетических маркеров для ранней диагностики рака толстой кишки и оценки клиникоморфологических особенностей заболевания.

Ключевые слова: рак толстой кишки, соматиче-

ские мутации, APC, k-Ras, TP53.

58% (95%-confidence interval was 47–69%) at 100%- specificity of the method.

Conclusion. Statistically significant difference in TP53 gene mutation frequencies in patients with adenocarcinomas and patients with benign colorectal neoplasms (p=0,02) was demonstrated. Information value of the studied genetical markers for early diagnostics of colorectal cancer and evaluation of clinical and morphological features of disease is discussed.

Key words: colorectal cancer, somatic mutations, APC, k-Ras, TP53.

Вобщей структуре онкологической заболеваемости в последние десятилетия отмечается характерная тенденция роста доли новообразований толстой кишки (ТК). Так, в России в период с 1990 по 2005 г. доля рака ободочной кишки увеличилась на 5%, а прирост доли рака прямой кишки составил у мужчин 15,6%, у женщин – 7,4%. По распространенности среди других онкологических заболеваний в России рак толстой кишки (РТК) занимает третье место после рака легкого и рака желудка у мужчин и рака молочной железы и новообразований кожи у

женщин [1].

В большинстве случаев РТК диагностируется слишком поздно, когда возможности эффективного лечения оказываются невысокими. Во многом этому способствует разнообразие клинических форм заболевания, скудность их проявлений на ранних стадиях и низкая эффективность методов диагностики. Использование в скрининговых исследованиях сывороточных маркеров РТК, таких как раковый эмбриональный анти-

ген (РЭА), гликопротеин СA19-9, карбогидратный антиген CA-242, не оправдывает себя из-за их низкой специфичности и чувствительности. В большей степени информативны современные эндоскопические методы, которые дают возможность достаточно рано выявлять новообразования дистального отдела толстой кишки. Однако высокие требования к квалификации специалистов, условия подготовки пациентов к исследованию ограничивают их широкое применение.

В последнее время активно изучается возможность использования в диагностике онкологических заболеваний генетических маркеров. Возникновение большинства опухолей вызвано локальными генетическими изменениями в онкогенах и генах опухолевой супрессии. Несмотря на относительную случайность мутагенеза в сома-

тических тканях, охарактеризован ряд генов, мутации в которых тесно связаны с развитием РТК. К таковым, в первую очередь, относят ген аденоматозного полипоза APC, ген супрессора опухолевого роста TP53, онкогены k-Ras и BRAF [4, 8, 9, 21]. Выявляемость мутаций в генах k-Ras и APC на самых ранних стадиях опухолевого процесса позволяет рассматривать эти гены как перспективные маркеры для ранней диагностики колоректального рака, когда патологические изменения эпителия толстой кишки морфологически еще трудно дифференцировать. Мутации в гене TP53 чаще выявляются на более поздних этапах онкогенеза. Таким образом, активно обсуждается возможность использования генетических маркеров не только для ранней диагностики, но и для оценки клинико-морфологических особенностей заболевания. Особый интерес представляет перспектива анализа этих генов в ДНК колоноцитов, слущиваемых и выделяемых с калом, что позволит отказаться от инвазивных эндоскопических исследований.

Тем не менее большинство пилотных исследований по анализу соматических мутаций у пациентов с РТК пока ограничено исследованием определенного гена или даже выбранных вариантов его мутаций [3, 5, 21]. Известно, что реальная распространенность многих медицински значимых генетических детерминант может существенно варьировать в различных этнических и популяционных группах, что требует предварительных исследований и детальной характеристики максимально полного спектра возможных генетических изменений. Таких данных по российским пациентам с РТК пока недостаточно. Не менее значимым представляется и вопрос о специфичности генетических маркеров по отношению к воспалительным заболеваниям толстой кишки – неспецифический язвенный

2 – образец слизистой оболочки без видимых изменений (как правило, на 20–30 см проксимальнее патологически измененного участка) для исключения геномного характера исследуемых мутаций. Полученные образцы замораживали при –20 °C и передавали в лабораторию для генетического исследования.

Генетическое исследование

ДНК из образцов ткани выделяли при помо-

щи набора Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega, США) в соответствии с инструкцией производителя. Для ПЦР-амплификации фрагментов анализируемых генов использовали праймеры, приведенные в табл. 2.

Амплификацию проводили в реакционной смеси, содержащей 66 мМ ТрисHCl, рН 9,0,

16,6 мМ (NH4)2SO4, 2 мМ MgCl2, по 100 мкМ каждого дНТФ, 1 Ед Taq-полимеразы (Promega, USA) и по 10 пмоль каждого праймера в объеме 10 мкл при едином температурном профиле: 94 °С – 15 сек, 59 °С – 15 сек, 72 °С – 15 сек в течение 37 циклов.

Далее для характеристики спектра соматических мутаций осуществляли секвенирование нуклеотидной последовательности с 1286 по 1513 кодон гена APC (MRC кластер) и с 33 по 306 кодон гена TP53 соответственно. Для определения нуклеотидной последовательности использовали набор ABI Prism BigDye™ Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit на автоматическом секвенаторе ABI Prism 3100 Genetic Analyzer («Applied Biosystems»,

США; «Hitachi», Япония) в соответствии с прилагаемыми инструкциями (см. рис. 1).

Для анализа компактно расположенных вариантов мутаций генов k-Ras и BRAF применяли оригинальный метод масс-спектрометрического мини-

ферментативно достраиваемые в ходе реакции минисеквенирования на несколько нуклеотидных оснований в зависимости от нуклеотидного контекста в районе ожидаемой мутации. Аликвоты реакции минисеквенирования (0,2–1,0 мкл) после очистки сокристаллизовали с матричным веществом (3’-гидроксипиколиновая кислота; Fluka, Германия) на планшете AnchorChip (600 мкм; Bruker Daltonics, Германия) и анализировали на MALDI-времяпролетном масс-спектрометре

Reflex IV (Bruker Daltonics, Германия). Анализ и обработку масс-спектров осуществляли с использованием программного обеспечения FlexAnalysis

2.4 (Bruker Daltonics, Германия). По наличию в масс-спектрах продуктов реакции пиков, соответствующих ионам определенной ожидаемой молекулярной массы, судили о нуклеотидном контексте в данном положении (рис. 3).

Результаты исследования и их обсуждение

Спектр соматических мутаций генов APC,

TP53 и k-Ras

Спектр обнаруженных в ходе исследования патогенных соматических мутаций приведен в табл. 3. Всего в клинических группах было выявлено 50 вариантов патогенных мутаций: 31 – в гене

APC, 5 – в гене k-Ras и 14 – в гене TP53. Мутаций в гене BRAF не найдено. Для подтверждения соматического характера указанных мутаций для

Таблица 3

каждого пациента были дополнительно исследованы образцы морфологически неизмененной ткани ТК, взятые проксимальнее патологического участка. Ни в одном из таких образцов генетических нарушений не обнаружено. Это свидетельствует о том, что выявленные мутации не являются наследуемыми и локализованы исключительно в патологически измененной слизистой оболочке ТК. Все приведенные в табл. 3 генетические изменения представлены делециями или точечными нуклеотидными заменами, приводящими к изменению структуры белка с нарушением его функциональности. Потенциальную значимость выявленных генетических вариантов оценивали в ходе сравнительного анализа с материалами, размещенными в специализированных базах данных по патогенным мутациям в гене TP53 и APC (IARC TP53 mutation Database и UMD Lokus Specific DataBase соответственно) [12, 13].

Согласно полученным нами результатам, большинство вариантов генов APC и TP53 являлись патогенными и часто ассоциированными с онкопатологией, в том числе с РТК. Кроме известных патологических вариантов, занесенных в вышеуказанные базы данных, было выявлено 12 новых, неопубликованных ранее вариантов мутаций гена APC и одна протяженная делеция в гене TP53 (в табл. 3 выделено). Происходящий в ходе указанной делеции 19 нуклеотидов сдвиг рамки считывания приводит к преждевременной терминации трансляции гена TP53 через 6 кодонов. Таким образом, характер этой делеции является, безусловно, критическим для синтеза полноценного белка.

Патологический характер выявленных нами мутаций в 12 и 13 кодоне гена k-Ras был подтвержден ранее [7, 25]. Предполагается, что эти мутации препятствуют отщеплению фосфатной группы от кофактора данного белка,

гуанозинтрифосфата (ГТФ), и нарушают меха-

низм негативной авторегуляции его активности. Отсутствие мутаций в гене BRAF, возможно,

объясняется относительно небольшим составом проанализированных групп и изначально более низкой частотой встречаемости (от 4 до 10%) [6, 20].

Кроме описанных нами патогенных мутаций, в гене APC было выявлено два варианта нейтраль-

ных замен: (G4479A, Thr1493Thr) и (A4144C, Pro1381Pro), очевидно, не имеющих клинического значения как не приводящих к аминокислотной замене. Тем не менее эти варианты встречались только в патологических образцах биопсийного материала. Можно предположить, что хотя эти варианты и не приводят к функционально значимым нарушениям кодируемого геном продукта, сам факт возникновения мутации в соматических клетках может отражать явление повышенной генетической нестабильности в данном участке эпителия ТК.

Выявляемость соматических мутаций в исследованных клинических группах

Анализ распределения мутаций в исследованных клинических группах показал, что все охарактеризованные патогенные варианты выявлялись только у больных с новообразованиями ТК (аденокарцинома, аденома, гиперпластические полипы) и полностью отсутствовали в группах пациентов с воспалительными заболеваниями ТК

ибез ее патологических изменений (табл. 4).

Впроцентном соотношении больше всего пациентов с мутациями (66%) было в группе с аденокарциномами (в группах с аденомами и гиперпластическими полипами 49 и 59% соответственно). В целом в объединенной группе с новообразованиями ТК выявляемость соматических мутаций составила 58%, что является фактической диагностической чувствительностью метода [95% доверительный интервал 47–69%] при использовании данных маркеров. В то же время отсутствие каких-либо структурных изменений исследованных генов в группе с воспалительными

заболеваниями кишечника и группе без органической патологии ТК свидетельствует о высокой (100%) диагностической специфичности метода [95% доверительный интервал 95–100%].

На сегодняшний день большинство работ, посвященных изучению спектра соматических мутаций в генах TP53, k-Ras и APC, выполнено на образцах сформировавшихся злокачественных опухолей [3, 5]. В меньшей степени это касалось доброкачественных новообразований. Данных о вероятности выявления указанных генетических маркеров при диспластических изменениях, характерных для воспалительных заболеваний кишечника, еще меньше, и они достаточно противоречивы. Так, например, при исследовании биопсийного материала культи прямой кишки у больных с колостомой после хирургического лечения болезни Крона не было выявлено мутаций в гене TP53, хотя признаки умеренного воспаления оставались у 78% оперированных даже спустя длительное (~8 лет) время после вмешательства [24]. В другой работе при исследовании смывов кишечника соматические мутации в генах TP53 и k-Ras удалось зарегистрировать у части пациентов с длительным течением болезни Крона и язвенным колитом [11]. Результаты нашего исследования дают возможность с большей степенью уверенности говорить о специфичности выбранных нами маркеров по отношению к новообразованиям и подчеркивают их диагностический потенциал.

Полученные данные не позволяют выделить какие-либо преобладающие варианты мутаций. Большинство из них (за исключением трех мутаций в гене APC и четырех в гене k-Ras)

выявлялись однократно. Самыми частыми были нуклеотидные замены в 35 положении гена k-Ras, которые обнаруживались в 14 случаях (G35A – 12 раз и G35T – 2 раза), что составляет 20% (14/67) от общего количества мутаций. Сочетанные варианты мутаций в разных генах выявлены у 20 из 78 пациентов с новообразованиями, хотя в большинстве случаев (24/78) определялось не более одной мутации в исследуемом образце (см. табл. 4).

Для более точной оценки диагностической информативности рассматриваемых маркеров их распределение в исследованных группах было проанализировано как независимо по генам, так и в составе возможных комбинаций. Максимальная диагностическая чувствительность (58,6%) во всех клинических группах достигалась при выявлении, по крайней мере, одной соматической мутации при условии анализа трех генов (APC или TP53,

или k-Ras) – табл. 5.

При этом исключение из описанной панели гена TP53 лишь незначительно снижает как общую диагностическую чувствительность – 56% [95% доверительный интервал 45–68%]), так и диагностическую чувствительность в отдельных клинических группах. В то же время исключение гена APC или k-Ras из диагностической панели снижает чувствительность теста до 33% [95% доверительный интервал 23–44%] и 47% [95% доверительный интервал 37–58%] соответственно. Таким образом, формально для сохранения диагностической чувствительности теста на уровне 56–58% достаточно анализировать только гены

APC и k-Ras.

Таблица 5

Соматические мутации и клиникоморфологические особенности заболевания

Несмотря на спорную ценность мутаций гена TP53 как диагностических маркеров сам факт наличия мутаций в данном гене может быть информативен при дифференциальной диагностике новообразований. Так, полученные результаты свидетельствуют о значительном различии в частоте выявления мутаций в TP53 в различных типах опухолей (см. табл. 5). В группе с аденокарциномами мутации в TP53 выявлялись в 33% (8/24) случаев, тогда как у пациентов с аденомами они встречались лишь в 8% (3/37). Такое различие оказалось статистически значимым (p=0,02 по двухстороннему тесту Фишера). Статистически достоверное различие (χ2=5,308, р=0,02) сохраняется и при сравнении выявляемости мутаций в TP53 в группе с аденокарциномами и объединенной группе доброкачественных новообразований (аденоматозные и гиперпластические полипы). Полученные данные согласуются с результатами других исследований, свидетельствующих о корреляции мутаций в TP53 с более поздними стадиями рака [10, 17, 19]. Таким образом, мутации в гене TP53 могут служить не только маркерами для ранней диагностики РТК, но и быть информативными при оценке стадийности опухолевого роста.

Мутации в гене k-Ras также часто рассматривают в качестве маркеров прогрессирования опухоли по более злокачественному сценарию [23]. В исследованных группах наиболее распространенным их вариантом среди всех соматических мутаций была замена в 12 кодоне G12N (20%). Примечателен и тот факт, что такие замены были обнаружены только в группах с аденомами (7/37) или аденокарциномами (6/24) и отсутствовали в

Рис. 3. Типичная масс-спектрограмма продуктов реакции минисеквенирования гена k-Ras Отмечены масс-пики, соответствующие удлинению олигонуклеотидного зонда на очередной нуклеотид. Стрелкой показано место возникновения соматической мутации G35A в 12 кодоне гена k-Ras

группе с гиперпластическими полипами (0/17). Сравнение групп с гиперпластическими полипами

иаденокарциномами по данному признаку показало статистически достоверное различие (p=0,03 по двухстороннему тесту Фишера), в то время как для групп с гиперпластическими полипами и аденоматозными полипами статистически достоверного различия не установлено (p=0,08 по двухстороннему тесту Фишера). Отсутствие мутации G12N гена k-Ras у пациентов с гиперпластическими полипами не позволяет однозначно утверждать о ее связи со степенью онкологического процесса. Однако можно говорить о тенденции, которая, возможно, будет подтверждена на более крупной выборке. Кроме того, компактное расположение и достаточно высокая частота мутаций в гене k-Ras делает его удобным объектом для использования в скрининговых генетических тестах.

Современные представления о раке как генетическом заболевании, обусловленном последовательным накоплением соматических мутаций в онкогенах и генах-супрессорах опухолей, основаны на генетической модели колоректального канцерогенеза, предложенной в 1990 г. E.R. Fearon

иB. Vogelstein [10]. Авторами была продемонстрирована стадийность морфологической трансформации, которая, в свою очередь, обусловлена стадийностью накопления ассоциированных мутаций. Предполагается, что по мере прогрессирования опухолевого роста должно происходить накопление таких множественных соматических изменений в разных генах. Тем не менее это предположение не всегда подтверждается в ходе скрининга соматических мутаций у пациентов с РТК. По результатам нашего исследования число пациентов, имевших одновременные изменения в генах APC и k-Ras, и TP53 (см. табл. 5), было невелико даже в группе с аденокарциномами (2/24), хотя, безусловно, необходимо отметить отсутствие подобных случаев (0/17) у пациентов с гиперпластическими полипами. Низкая частота множественных мутаций по генам APC и k-Ras,

иTP53 была показана также при аналогичном обследовании пациентов с РТК в Корее [16].

Кроме ассоциаций со стадийностью опухолевого роста обсуждается возможная взаимосвязь между спектром соматических мутаций и локализацией опухолей в дистальных или проксимальных отделах толстой кишки [18]. В ходе настоящей работы большая часть клинического материала (159/174) была получена при эндоскопическом исследовании дистальных отделов ТК (прямая, сигмовидная и нисходящая ободочная кишка). Ввиду малого количества образцов из проксимальных отделов анализ зависимости локализации новообразования и выявленных мутаций нами не проводился.

Результаты последних исследований свидетельствуют о значимости определения соматических