Частная бактериология

621

выделением возбудителя из испражнений и нарастанием титра специфических антител в сыворотке крови.

Микробиологическая диагностика кампилобактериоза осуществляется в соответствии с Методическими указаниями №01/15702-8-34 от 26.12.2008 г. Определение бактерий рода Campylobacter в пищевых продуктах и в кормах для животных осуществляется в соответствии с МУК 4.2.2321-08 и ГОСТ Р ИСО 10272- 1-2010.

При диагностике кампилобактериоза применяют бактериоскопический, культуральный и серологический методы. Исследуемым материалом служат фекалии, мазки и смывы из прямой кишки, кровь, вода, молоко и другие подозрительные пищевые продукты. Пробы транспортируют в среде с консервантом (тиогликолевый бульон, щелочная пептонная вода) при температуре 4ºС.

Бактериоскопический метод предусматривает микроскопию мазков, окрашенных раствором фуксина или кристаллического фиолетового в течение 10-30 секунд. Однако бактериоскопический метод обладает низкой чувствительностью. Этот метод может быть достоверным при наличии в исследуемом материале микробных клеток не менее 105 КОЕ/мл.

Культуральный метод основан на выделении чистой культуры возбудителя. Исследуемый материал доставляют в лабораторию в короткие сроки, используя транспортные среды (тиогликолевая среда, мясопептонный бульон, среда Эймса и др.). Вначале исследуемый материал высевают на обогатительные среды (пептонную воду, тиогликолевую среду), а затем проводят пересев на плотные селективные питательные среды (кровяной эритрит агар, угольный эритрит агар, кампилобакагар).

Для дифференциации вида кампилобактерий посевы инкубируют при различных температурах в атмосфере азота, углекислого газа и кислорода в соотношении 85:10:5. Микроаэрофильные условия лучше всего достигаются при использовании коммерческих анаэростатов с химическими газогенерирующими пакетами (рисунок 9.10).

Рисунок 9.10 – Анаэростаты с газогенерирующими пакетами.

Для идентификации выделенных культур используют следующие тесты: подвижность, образование уреазы, сероводорода, оксидазы и каталазы, гидролиз гиппурата натрия, способность к росту при разных температурах, редукция нитратов и нитритов, чувствительность к налидиксовой кислоте.

622

Подвижность бактерий выявляют фазово-контрастной или темнопольной микроскопией раздавленной капли.

Гидролиз гиппурата характерен для C. jejuni. Этот признак выявляют после 2- часового инкубирования исследуемой культуры в 1%-ном растворе гиппурата натрия и последующего добавления к суспензии нингидринового реактива. Появление темно-фиолетового окрашивания свидетельствует о выделении C. jejuni

(рисунок 9.11).

Рисунок 9.11 - Гидролиз гиппурата. Стрелкой указан положительный результат. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Идентификация культур рода Campylobacter по 12 тестам возможна с помощью системы API Campy французской фирмы bio Merieux (рисунок 9.12).

Рисунок 9.12 – Системы API для идентификации бактерий. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Образование уреазы, сероводорода, оксидазы и каталазы, восстановление нитратов, гидролиз гиппурата натрия и другие признаки с помощью этой системы выявляются по изменению цвета среды после 24-часового инкубирования.

Первичная идентификация культур возможна с помощью латексной агглютинации. Для этой цели применяют коммерческие наборы (например, Campylobacter test kit фирмы OXOID). Этот метод основан на взаимодействии латексных частиц на тест-слайде с поверхностными антигенами кампилобактерий и образовании агглютината.

Серологическая диагностика при кампилобактериозе проводится в случаях отсутствия выделения возбудителя, при эпидемиологических исследованиях и с

623

целью изучения патогенеза заболевания. Для серологической диагностики используют РА, РНГА, РСК.

Методами экспресс-диагностики служат РИФ со специфическими люминесцентными сыворотками, ИФА и ПЦР. В частности, тест-системы на кампилобактериоз в режиме реального времени для медицинских и ветеринарных целей выпускают несколько коммерческих организаций (рисунок 9.13).

Рисунок 9.13 – Тест-система ПЦР на кампилобактериоз в режиме реального времени. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Для выявления кампилобактерий в пищевых продуктах фирма Merck (Германия) выпускает экспресс-тест Singlepath-Campylobacter, представляющий собой иммунохроматографический тест на основе меченных золотом антител

(рисунок 9.14).

Рисунок 9.14 - Экспресс-тест Singlepath-Campylobacter для обнаружения кампилобактерий в пищевых продуктах. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Исследуемый материал вносится в круглую лунку, где антиген адсорбируется подложкой и часть его взаимодействует с меченными антителами. Комплекс “антиген+антитело” мигрирует в тестовую зону (Т), где связывается с антителами к этому комплексу. В результате взаимодействия образуется четкая красная полоса. Оставшаяся часть образца мигрирует далее в контрольную зону (С), где образует четкую красную полосу, указывающую на специфичность теста.

Для установления клинического диагноза достаточно определить родовую принадлежность выделенной культуры, а при эпидемиологическом анализе заболевания требуется видовая и внутривидовая идентификация возбудителя.

Иммунитет. После заболевания развивается видо- и типоспецифический иммунитет, который не защищает от повторного заражения возбудителем другого серотипа или биовара.

624

Лечение. В большинстве случаев заболевание заканчивается спонтанным излечением, поэтому химиотерапия не проводится. Антибиотики применяют при угрозе развития тяжелых осложнений. С этой целью используют макролиды (эритромицин, макропен, азитромицин и др.), тетрациклины, хинолоны (ципрофлоксацин). Для лечения кампилобактериоза применяют регидрационные средства, сорбенты, пробиотики, пребиотики, ферменты.

Профилактика. Профилактика кампилобактериоза среди людей проводится в соответствии с СП 3.1.7.2816-10. Средств специфической профилактики кампилобактериоза не разработано. Осуществляют комплекс санитарноветеринарных, санитарно-гигиенических и противоэпидемических мероприятий (ликвидация инфекции среди животных, соблюдение санитарно-гигиенических норм забоя животных, защита продуктов от загрязнения, соблюдение правил транспортировки, хранения и реализации пищевых продуктов, тщательная термическая обработка мясных продуктов, соблюдение правил личной гигиены).

Вопросы для контроля усвоения материала

1.Расскажите об истории открытия кампилобактерий.

2.Расскажите о таксономии кампилобактерий.

3.Морфологические, тинкториальные, культуральные и биохимические свойства кампилобактерий.

4.Охарактеризуйте антигенную структуру кампилобактерий.

5.Расскажите о резистентности кампилобактерий.

6.Факторы патогенности кампилобактерий и патогенез заболевания.

7.Опишите клинические формы и симптомы кампилобактериоза.

8.Каковы принципы лечения кампилобактериоза.

9.В чем заключается профилактика кампилобактериоза.

Тренировочные тесты

1.Кампилобактерии, наиболее часто вызывающие заболевание у человека, относятся к виду (один правильный ответ):

1.1 C. coli

1.2 C.fetus

1.3 C. anaedi

1.4 C.jejuni

1.5 C. hyointestinalis

2.Микроорганизмы рода Campylobacter являются (несколько правильных ответов): 2.1 анаэробными грамотрицательными палочками 2.2 микроаэрофильными грамотрицательными палочками

2.3 S-образными бактериями

2.4 грамположительными кокками

2.5 спорообразующими палочками

3.Кампилобактерии хорошо растут на (несколько правильных ответов):

625

3.1МПА

3.2кровяном агаре

3.3мясо-пептонном печеночном агаре

3.4среде Эндо

3.5МПБ

4. Кампилобактеры являются (несколько правильных ответов):

4.1микроаэрофилами

4.2анаэробами

4.3факультативными анаэробами

4.4облигатными аэробами

4.5капнофилами

5. К факторам патогенности кампилобактерий относится (несколько правильных ответов):

5.1экзотоксин

5.2жгутики

5.3адгезины

5.4энтеротоксины

5.5капсула

6. Основным природным резервуаром кампилобактерий является (несколько правильных ответов):

6.1дикие животные

6.2домашние животные

6.3птицы

6.4человек

6.5членистоногие

7. Температура, оптимальная для культивирования кампилобактерий (один правильный ответ):

7.110ОС

7.215ОС

7.320ОС

7.442ОС

7.550ОС

8. Основным методом диагностики кампилобактериоза является (один правильный ответ):

8.1молекулярно-генетический

8.2культуральный

8.3серологический

8.4биологический

8.5бактериоскопический

626

9. Для выделения чистой культуры кампилобактеров применяют (несколько правильных ответов):

9.1посев на селективные питательные среды

9.2посев с использованием фильтров

9.3посев в МПБ

9.4посев в селенитовый бульон

9.5посев на висмут-сульфитный агар

10. Основной тест, позволяющий дифференцировать C. jejuni от других видов кампилобактерий (один правильный ответ):

10.1продукция нитратредуктазы

10.2гидролиз гиппурата

10.3температурный тест

10.4продукция эндотоксина

10.5синтез каталазы

11. При диагностике кампилобактериоза используют (несколько правильных ответов):

11.1фекалии

11.2кровь

11.3воду

11.4пищевые продукты

11.5мочу

12. Для лечения кампилобактериоза используют (один правильный ответ):

12.1сыворотку реконвалесцентов

12.2противовирусные препараты

12.3антибиотики

12.4иммуноглобулин

12.5сыворотку животных

13. Для профилактики кампилобактериоза используют (несколько правильных ответов):

13.1живые вакцины

13.2убитые вакцины

13.3иммуноглобулины

13.4защиту продуктов от инфицирования

13.5термическую обработку продуктов

Правильные ответы: 1.4; 2.2, 2.3; 3.2, 3.3; 4.1, 4.5; 5.2, 5.3, 5.4; 6.1, 6.2, 6.3; 7.4; 8.2;

9.1, 9.2; 10.2; 11.1, 11.2, 11.3, 11.4; 12.3; 13.4, 13.5.

627

9.2. Хеликобактерии

Хеликобактериоз - это инфекционное заболевание, при котором поражается желудок или двенадцатиперстная кишка в виде язвенного дефекта в слизистой оболочке. Однако очень часто у лиц, инфицированных Helicobacter pylori, не обнаруживается никаких симптомов заболевания.

Впервые спиралевидные бактерии в желудке собак обнаружил в 1874 г. G. Bottcher, а в желудке человека в 1906 г. W. Kreinitz. Однако эти наблюдения длительное время оставались неподтвержденными. В период с 1979 по 1981 гг. австралийский патологоанатом Д.Р. Уоррен, изучая биопсийный материал пациентов с признаками гастрита, описал спиралевидные бактерии, похожие на Campylobacter jejuni. Он назвал их кампилобактер-подобными организмами (CLO - Campylobacter-like organism). В 1982 г. австралийские врачи гастроэнтеролог Б.Д. Маршалл и патоморфолог Д.Р. Уоррен (рисунок 9.15) сообщили о выделении этой спиралевидной бактерии при язвенной болезни желудка.

А Б

Рисунок 9.15 – А - Барри Джеймс Маршалл (Barry James Marshall, род. в 1951 г.); Б – Джон Робин Уоррен (John Robin Warren, род. в 1937 г).

В 1984 г. путем самозаражения Б. Маршалл установил роль этого микроба в патологии человека. Микроб получил название Campylobacter pylori. В 1989 г. бактерия была окончательно идентифицирована и получила название Helicobacter pylori. В 2005 г. за открытие H. pylori и установление ее роли при гастрите и язвенной болезни желудка Б.Д. Маршалл и Д.Р. Уоррен были удостоены Нобелевской премии по физиологии и медицине.

Таксономическое положение. Хеликобактерии относятся к типу (филуму)

Proteobacteria, классу Epsilonproteobacteria, порядку Campylobacterales, семейству

Helicobacteraceae, роду Helicobacter. В настоящее время описано более 30 видов хеликобактерий. Для человека патогенными являются Н. pylori, H. heilmannii, H. cinaedi, H. fennelliae, H. rappini, вызывающие гастриты, энтериты, септицемии.

628

Основное значение в патологии человека имеет вид Н. pylori – этиологический агент гастрита, язвы желудка и 12-перстной кишки. Н. pylori преимущественно выделяется из пилорической части желудка (привратника), отсюда и название микроба (лат. helix - спираль, pyloris - привратник). Виды рода Helicobacter являются единственными известными на сегодняшний день микроорганизмами, способными длительное время выживать и размножаться в кислом содержимом желудка. Многие виды хеликобактерий обитают в ротовой полости, желудке, различных отделах кишечника человека и животных.

Морфологические и тинкториальные свойства. Хеликобактерии представляют собой мелкие палочки S-образной формы. Микроб подвижный (лофотрих) - на одном из полюсов он имеет от 1 до 6 жгутиков с колбовидными утолщениями на концах. Спор и капсул не образует (рисунок 9.16).

Рисунок 9.16 – Хеликобактерии, сканирующая электронная микроскопия. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Хеликобактерии по Граму окрашиваются в красный цвет (грамотрицательные). В мазках бактерии располагаются попарно, образуя форму запятой или “летящей ласточки” (рисунок 9.17).

Рисунок 9.17 – Хеликобактерии, окраска по Граму. Заимствовано из Интернетресурсов.

Бактериальная клетка окружена слоем геля (гликокаликсом), представляющим собой гликопротеиновый полианионный гель, состоящий на 99% из воды. Он служит своеобразным барьером, защищающим клетку. Кроме того, гликокаликс выполняет функцию депо для уреазы – фермента, защищающего микробную клетку от кислого содержимого желудка.

629

Стареющие бактериальные клетки утрачивают спиралевидную форму и переходят в кокковую (тип 1). Переход в кокковую форму возможен также при действии неблагоприятных факторов внешней среды: повышенной температуры, антибиотиков (тип 2). Кокковые формы типа 2 способны сохраняться во внешней среде и трансформироваться в исходные спиралевидные клетки при проникновении в желудок.

Культуральные и биохимические свойства. Хеликобактерии являются микроаэрофилами, растут в атмосфере, содержащей 5-10% кислорода. Оптимальная температура роста 37°С, рН – 5,5-8,5. Хеликобактерии требовательны к питательным средам, хорошо растут на сложных средах с добавлением сыворотки крови, крахмала, активированного угля, гидролизата белков. Для подавления роста посторонних микроорганизмов в среды добавляют антибиотики. Для выращивания хеликобактерий используют следующие среды:

-сердечно-мозговой агар;

-железо-эритритный кровяной агар (ЖЭКА);

-мясо-пептонный печеночный агар (МППА);

-сафранино-железо-новобиоциновую среду (СЖН).

Однако хеликобактерии растут медленно - колонии появляются на 3-5 день после посева. Колонии бесцветные, блестящие, выпуклые, диаметром 1-2 мм, окружены зоной слабого гемолизаКолониина агарехеликобактерийс эритроцитаминалошадиКА (рисунок 9.18).

Рисунок 9.18 – Рост хеликобактерий на кровяном агаре. Заимствовано из Интернетресурсов.

На средах, содержащих триметил-тетразолиум-хлорид, формируются пигментированные рубиново-красные колонии. При скученном расположении колоний рубиново-красный пигмент распространяется за пределы колоний в виде паутины (рисунок 9.19).

Колонии хеликобактерий

630

Рисунок 9.19 – Рост хеликобактерий на агаре с триметил-тетразолиум-хлоридом. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Хеликобактер продуцирует уреазу, является оксидаза- и каталазаположительным. Не ферментирует углеводы.

Геном хеликобактера представлен кольцевой двуцепочечной молекулой ДНК. Антигенная структура. Хеликобактер имеет О- и Н-антигены.

Факторы патогенности хеликобактерий: 1. Структурные компоненты клетки:

-спиралевидная форма клетки, гладкая поверхность (так называемая “гельдинамическая” или эластичная морфология) и наличие жгутиков позволяют возбудителю проникать под слой слизи и колонизировать клетки эпителия. Жгутики способствуют также агрегации бактерий на поверхности эпителия;

-липополисахарид, способствующий прикреплению возбудителя к клеткам эпителия и стимулирующий секрецию пепсиногена, что приводит к образованию избытка пепсина – одного из факторов риска в развитии язвенной болезни;

-системы секреции III и IV типа (T3SS, T4SS), “инжекционные системы” - пилеподобные структуры, способствующие введению внутрь эукариотической клетки белков - эффекторов;

-адгезины – белки поверхности микробной клетки, выполняющие функцию прикрепления к остаткам сиаловых кислот, гликолипидам, фосфолипидам, ламинину, коллагену, холестеролу клеток хозяина. В частности, белок адгезии BabA

(blood-group associated binding adhesion) связывается с одним из групповых антигенов крови Le(b), присутствующим на поверхности клеток эпителия желудка.

2. Экзоферменты:

-фермент адаптации – уреаза вызывает расщепление мочевины с образованием аммиака, нейтрализующего соляную кислоту желудка. Уреаза Н. pylori располагается не только в цитоплазме бактерии, но и на поверхности микробной клетки;

-протеаза, фосфолипаза, муциназа вызывают деполимеризацию и растворение защитного слизистого геля на поверхности эпителия и повреждение слизистой оболочки.

3. Экзотоксины - цитотоксины, повреждающие слизистую оболочку. Основными цитотоксинами являются CagA (цитотоксин, ассоциированный с геном cagA) и VacA (вакуолизирующий цитотоксин). Штаммы, имеющие эти маркеры вирулентности, относятся к штаммам первого типа, которые ассоциированы с