Частная бактериология

521

Рисунок 7.54 – Альберт Кальметт (Leon Charles Albert Calmette, 1863-1933 гг., справа) и Камиль Герен (Jean-Marie Camille Guerin, 1872-1961 гг., слева).

Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Во Франции 18 июня 1921 г. вакцина БЦЖ была впервые введена новорожденному ребенку. Этот день считается днем рождения БЦЖ. В 1925 г. А. Кальметт передал вакцинный штамм в СССР профессору Л.А. Тарасевичу. Через 3 года изучения было установлено, что вакцина безвредна, а смертность от туберкулеза среди вакцинированных стала намного меньше, чем среди невакцинированных людей. В 1928 г. вакцину БЦЖ стали вводить новорожденным в очагах туберкулезной инфекции. В середине 1950-х годов вакцинация новорожденных против туберкулеза в нашей стране стала обязательной.

В 1943 г. американский микробиолог З.А. Ваксман (рисунок 7.55) получил стрептомицин – первый противотуберкулезный антибиотик.

Рисунок 7.55 – Зельман Абрахам Ваксман (Selman Abraham Waksman, 1888-1973

гг.). Заимствовано из Интернет-ресурсов.

В 1952 г. З.А. Ваксман за открытие первого противотуберкулезного антибиотика стрептомицина был удостоен Нобелевской премии по физиологии и медицине.

Морфологические и тинкториальные свойства. Микобактерии туберкулеза имеют вид прямых или слегка изогнутых палочек длиной 1-10 мкм, диаметром 0,2-0,6 мкм (рисунок 7.56).

522

а б Рисунок 7.56 – Микобактерии туберкулеза: а – компьютерная визуализация; б –

сканирующая электронная микроскопия. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Иногда микобактерии образуют нитевидные структуры, напоминающие мицелий грибов, что и послужило основанием для их названия (рисунок 7.57).

Рисунок 7.57 – Образование микобактериями нитевидных структур, напоминающих мицелий грибов. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Микрокапсула

Рисунок 7.58 – Просвечивающая электронная микроскопия M. tuberculosis. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

По химическому составу микобактерии отличаются от других микроорганизмов, они содержат специфические белки (туберкулопротеины), полисахариды и липиды. Туберкулопротеины составляют до 56% сухой массы микробной клетки. Они обладают высокой токсичностью, вызывают формирование гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ). Полисахариды составляют до 15% сухой массы клетки. Липиды составляют до 40% сухой массы клеток. У

523

микобактерий обнаружено три фракции липидов: фосфатидная (растворимая в эфире), жировая (растворимая в эфире и ацетоне), восковая (растворимая в эфире и хлороформе). По структурным особенностям липиды микобактерий подразделяются на 7 групп:

-жирнокислотные производные углеводов (в частности, корд-фактор);

-маннозиды фосфатидилинозита;

-жирнокислотные производные пептидов;

-гликозиды N-ацилпептидов (микозиды С);

-жирнокислотные эфиры фтиоцеролов;

-микозиды А, В, G;

-миколаты глицерина.

Микобактерии имеют особую клеточную стенку. Наружные слои

представлены поверхностными (внешними) гликолипидами (сульфолипидами). Внешние гликолипиды называют также микозидами (специфическими восками) и сравнивают с микрокапсулой.

В средней части клеточной стенки основными компонентами являются разветвленные жирные (миколовые) кислоты с одной или двумя боковыми цепями и большим количеством атомов углерода. Миколовые кислоты обеспечивают высокую химическую устойчивость микобактерий. Миколовые кислоты могут быть ковалентно соединены с арабиногалактаном или находиться в составе свободных гликолипидов, таких как димиколат трегалозы. Наличие димиколата трегалозы способствует связыванию отдельных клеток в скопления в виде жгутов или кос, поэтому димиколат трегалозы называют “корд-фактором”.

Внутренние слои образованы арабиногалактаном и пептидогликаном. Пептидогликан непосредственно примыкает к цитоплазматической мембране. Арабиногалактан связан с одной стороны с пептидогликаном, а с другой стороны – с миколовыми кислотами.

Липоарабиноманнан представляет собой смесь полимеров арабинозы и маннозы с производными пальмитиновой и туберкулостеариновой кислот. Липоарабиноманнан заякорен на цитоплазматической мембране, пронизывает клеточную стенку и выходит на ее поверхность. Концевые фрагменты липоарабиноманнана (маннозные радикалы) неспецифически подавляют активацию Т-лимфоцитов и лейкоцитов, вызывая нарушения иммунного ответа на микобактерии.

В клеточной стенке микобактерий присутствуют также маннозиды и пептиды. Поверхностные слои микобактерий из фосфолипидов, гликолипидов и миколовых кислот называют микомембраной. Клеточная стенка микобактерий пронизана порами, обеспечивающими транспорт веществ. Схема строения клеточной стенки микобактерий представлена на рисунке 7.59.

524

ABC

Рисунок 7.59 – Схема строения клеточной стенки микобактерий.

Высокое содержание липидов в составе клеточной стенки определяет

спиртоустойчивость, щелочеустойчивость и кислотоустойчивость

микобактерий, затрудняет окрашивание микробных клеток обычными методами, обусловливает вирулентность и длительную сохраняемость микобактерий в окружающей среде. Кроме того, липиды экранируют бактериальную клетку, подавляют фагоцитоз, блокируют активность клеточных ферментов, а терминальные фрагменты липоарабиноманнана подавляют активацию Т- лимфоцитов и лейкоцитов.

Микобактерии относятся к группе грамположительных микроорганизмов, хотя при окраске по Граму они не прокрашиваются кристаллвиолетом. К группе грамположительных бактерий они относятся в связи с наличием слоя пептидогликана, связанного с цитоплазматической мембраной и отсутствием внешней клеточной мембраны, характерной для грамотрицательных бактерий.

525

В цитоплазме клеток могут обнаруживаться от 2 до 12 гранул, состоящих из липидов или метафосфатов (зерна Муха).

Геном микобактерий туберкулеза представлен кольцевой молекулой ДНК (бактериальной хромосомой). Особенностью генома микобактерий туберкулеза является наличие большого количества IS-элементов, что обусловливает ДНКполиморфизм возбудителей.

Геномный анализ показал, что у микобактерий около 10% генов кодируют белки необычного аминокислотного состава. Такие белки содержат повторяющиеся сочетания либо остатков пролина и глютаминовой кислоты (РЕ-белки), либо остатков пролина, пролина и глютаминовой кислоты (РРЕ-белки). Эти белки входят в состав системы секреции VII типа (T7SS). Увеличение или снижение экспрессии генов, детерминирующих синтез этих белков, зависит от конкретных условий микроокружения. Белки семейства РЕ/РРЕ кодируются приблизительно 168 генами, что обеспечивает широкую возможность изменения их экспрессии при адаптации патогена к окружающим условиям.

Первоначально различные варианты системы секреции VII типа обозначались аббревиатурой ESX. Белки, входящие в состав этих систем, вызывают образование пор в мембранах клеток. В геноме микобактерий может присутствовать до пяти ESX-систем. Количество этих систем коррелирует с вирулентностью микобактерий. Только патогенные медленно растущие виды микобактерий имеют в своем геноме 5 ESX-систем, быстрорастущие и менее патогенные виды содержат только 3 таких кластера. Система секреции VII типа характерна для M. tuberculosis, M. bovis, M. avium. Эта система секреции состоит из двух частей (пор). Одна пора располагается в цитоплазматической мембране, а другая - в микомембране (рисунок

7.61).

Микомембрана

Микомембрана

Цитоплазматическая

ЦПМ

мембрана

Рисунок 7.61 – Система секреции VII типа.

Для окраски туберкулезных бактерий при люминесцентной микроскопии используют аурамин или родамин. При этом микобактерии приобретают золотистооранжевое свечение (рисунок 7.62).

526

Рисунок 7.62 – Люминесцентная микроскопия микобактерий. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Культуральные свойства. M. tuberculosis является облигатным аэробом, а M. bovis и M. africanum – аэрофилами. Оптимальная температура роста 37-38ºС. Микобактерии туберкулеза растут медленно из-за наличия в клеточной стенке липидов, замедляющих обмен веществ с окружающей средой.

Внутриклеточное дыхание микобактерий осуществляют оксидоредуктазы, из которых особый интерес представляют каталаза и пероксидаза, так как с ними связана вирулентность возбудителей.

M. tuberculosis в большом количестве образует никотиновую кислоту (ниацин), которая накапливается в жидкой питательной среде и дает с раствором цианида калия и хлорамином Б ярко-желтое окрашивание - ниациновая проба Конно (рисунок 7.63).

Рисунок 7.63 - Ниациновый тест на способность микобактерий туберкулеза синтезировать никотиновую кислоту – ниацин (правая пробирка). Левая пробирка – контроль. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Микобактерии очень требовательны к питательным средам. Они нуждаются в глицерине (глицеринзависимые бактерии), растут на средах, содержащих яичный желток, сыворотку крови, факторы роста (биотин, никотиновую кислоту), соли магния, калия, натрия, железа, активированный уголь. Для подавления роста сопутствующих микроорганизмов в среды добавляют пенициллин или малахитовый зеленый. Микобактерии туберкулеза размножаются простым делением. Цикл деления составляет 14-18 часов.

Элективными питательными средами для микобактерий являются:

-яичные среды Левенштейна-Йенсена (рисунок 7.64) и Финна-2;

-глицериновые агаровые среды Миддлбрука;

Рисунок 7.66 – Характер роста микобактерий туберкулеза на среде ЛевенштейнаЙенсена. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

На средах с желчью микобактерии образуют сероватый маслянистый налет. В жидких питательных средах на 7-10 день после посева появляется пленка,

которая постепенно утолщается, становится морщинистой, приобретает желтоватый (кремовый) цвет. При этом среда остается прозрачной. При выращивании в жидкой питательной среде на стекле (метод Прайса) микобактерии туберкулеза образуют структуры, напоминающие жгуты, косы, веревки. Эти структуры называются кордфактором (рисунок 7.67).

Рисунок 7.67 – Корд-фактор M. tuberculosis - палочки расположены в виде жгутов, рисунок. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Резистентность микобактерий. Среди микробов, не образующих спор, микобактерии являются наиболее устойчивыми к действию неблагоприятных факторов окружающей среды. В высохшей мокроте больного микробные клетки сохраняют жизнеспособность и патогенность в течение 5-6 месяцев. При кипячении туберкулезные микобактерии погибают через 5-7 минут. На предметах больного сохраняются более 3 месяцев. В почве остаются жизнеспособными до 6 месяцев, в воде – до 15 месяцев, в навозе – 2 года. В уличной пыли микобактерии туберкулеза сохраняются в течение 10 дней. В сливочном масле микобактерии выживают до 240 дней, в сыре - до 200 дней. Солнечный свет вызывает гибель микобактерий через 1,5 часа, УФЛ – через 2-3 минуты. При пастеризации микобактерии погибают через 30 минут.

Микобактерии устойчивы к действию низких температур. Они достаточно устойчивы к действию обычных дезинфицирующих средств: 5% раствор фенола вызывает гибель туберкулезных палочек через 6 часов. Хлорсодержащие соединения (3-5% растворы хлорамина, 10-20% растворы хлорной извести), вызывают гибель возбудителя туберкулеза в течение 3-5 часов.

529

Эпидемиология. Основным источником инфекции при туберкулезе является больной человек. При туберкулезе легких в 50% случаев отмечается выделение возбудителя во внешнюю среду. Особое значение имеет прямой, длительный и тесный контакт здорового человека с больным. Основным

механизмом заражения является аэрогенный, а входными воротами – органы дыхания. Пути заражения туберкулезом - воздушно-капельный и воздушнопылевой (рисунок 7.68).

Рисунок 7.68 – Аэрогенный механизм заражения туберкулезом (синие стрелки – воздушно-капельный путь, зеленые стрелки – воздушно-пылевой путь).

При кашле, чихании, разговоре в выдыхаемом воздухе больного туберкулезом содержатся частицы диаметром около 10 мкм. Жидкость этих частиц в атмосферном воздухе испаряется, и содержащие микробы частицы длительное время могут находиться во взвешенном состоянии. Каждая частица может содержать от 3 до 10 клеток M. tuberculosis. Осевшие на почву микобактерии вместе с пылевыми частицами способны повторно подниматься в воздух, обусловливая воздушно-пылевой путь заражения. При аэрогенном инфицировании частицы размером более 5 мкм задерживаются в полости носа, а частицы меньшего размера (около 1 мкм) могут достигать альвеол.

Реже заражение человека туберкулезом происходит алиментарным путем - при употреблении молока и мяса от больных животных при недостаточной термической обработке. Большое количество липидов в составе клеточной стенки обусловливает кислотоустойчивость микобактерий и способствует преодолению ими кислого содержимого желудка. При алиментарном заражении для развития заболевания требуется значительно большее количество возбудителя, чем при аэрогенном инфицировании.

Иногда наблюдается заражение контактно-бытовым путем через поврежденные кожные покровы и слизистые оболочки при использовании предметов больного человека (одежды, посуды, книг и др.) или при уходе за больными животными. Описаны случаи заражения у хирургов, патологоанатомов, мясников. Редко возможно инфицирование через конъюнктиву глаз и плаценту.

Туберкулез распространен повсеместно. В соответствии с данными ВОЗ, около 2 млрд. людей инфицировано возбудителем туберкулеза. В настоящее время

530

ежегодно заболевает примерно 9 млн. человек во всем мире, из них 3 млн. человек умирает. Росту заболеваемости туберкулезом способствуют неблагоприятные социально-экономические факторы и широкое распространение штаммов с множественной устойчивостью к антибиотикам. Рост заболеваемости наблюдается при снижении уровня жизни населения, в лагерях беженцев, следственных изоляторах, тюрьмах. Однако в настоящее время нельзя четко установить зависимость заболеваемости туберкулезом от условий жизни людей.

В России смертность от туберкулеза (по данным за 2008 г.) составляет 18 человек на 100 тысяч жителей, то есть в год от туберкулеза умирает около 25000 человек.

Факторы патогенности микобактерий:

-корд-фактор – гликолипид клеточной стенки (эфир трегаллозы и миколовой кислоты), вызывающий повреждение клеточных мембран;

-сульфатиды (сульфолипиды) - серосодержащие поверхностные гликолипиды, усиливающие токсическое и антифагоцитарное действие кордфактора, препятствующие слиянию фагосомы с лизосомой;

-липоарабиноманнан (LAM) – гетерополисахарид, подавляющий активацию Т-лимфоцитов и лейкоцитов, вызывающий секрецию макрофагами фактора некроза опухолей – ФНО (под действием ФНО развивается лихорадка, отмечается снижение веса) и ИЛ-10 (тормозит пролиферацию Т-клеток);

-микозиды – специфические воска, образующие защитный экран на поверхности клетки;

-белки-эффекторы, препятствующие слиянию фагосомы с лизосомами (ESAT-6 и CFP-10). Эти белки кодируются генами, находящимися в локусе вирулентности RD1 (Region of Difference 1). Белки-эффекторы транспортируются в окружающую среду с помощью системы секреции VII типа (T7SS).

Основные факторы патогенности микобактерий туберкулеза локализуются в клеточной стенке (рисунок 7.69).

Микозиды

Внешние

сульфолипиды

T7SS

Белки-эффекторы

Липоарабиноманнан

Корд-фактор

Рисунок 7.69 – Факторы патогенности микобактерий туберкулеза.

Возбудители туберкулеза не образуют экзотоксинов. Высокой токсичностью обладают продукты распада микобактерий.

Главным фактором патогенности микобактерий является корд-фактор (англ. соrd - жгут, веревка) - гликолипид, располагающийся в клеточной стенке и способствующий склеиванию микробных клеток в виде жгутов или кос, в которых микобактерии располагаются параллельными цепочками. Авирулентные и условно-