цвилиховский

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Вивчення öioxiMH i ф1зюлоги процеав травления, всмоктування та секрецн' речовин у шлунково-кишковому трактп людини i тварин е предметом багаточиселышх дослхджень (Уголев A.M., 1961-1992; Елецкий Ю.К., Цыбулевский А.Ю., 1979; Кушак Р.И., 1983; Semenza G.et al, 1984; Collarini j. 1987; Kramer W. et al. 1989-1995; Морозов И.А. и др. 1988; Бауман В.К., 1989; Смирнов К.В., 1994). Особлива увага придишеться дослщженню цих процеав на pißiii плазматично! мембрани ентероцитш тонкого кишечника, як1 при переход! взд внутршньочеревного до шдшпдуального розвитку ор-гашзму та у перюд раннього постнатального онтогенезу, вивчено недостатньо. Особ-лив1сть даного перюду подягае не тьтьки у завершент структурного i функщоиально-го становления само! травно! системи, а також у формуванш за и участю ф1зюлопчних i 6ioxiMi4HHX мехашзшв адаптацн оргашзму до нових умов ¡снування.

Уюкальна диференщацш плазмалеми ентероциту на аткальпу (AM) та базолате-ральну (БМ) мембрани забезпечуе злагоджене зд1йснення пдролггичних, транспортних i секреторних функций ентероцитхв, функщй по контролю клшшного метабол1зму, яю, в свою чергу, можлив1 при реалгзаци явищ мембранно! рецепцй. Вирштльна роль у виконанн1 кожно1 окремо! функху! плазматично! мембрани снтсроци-пв належить бшкам. Причому, р!зна структура та функцюнальш особливоси AM i БМ передбача-ють в1дмшност1 в ix бшковому склад!.

Актуалыпсть теми. На даний час бшковий склад AM i БМ ентероцитсв тонкого кишечника тварин i людини охарактеризовано досить детально (Maestracci D. et al. 1973; Fujita M. et al. 1981; Tirupathi C. et al. 1986; Vasseur M. 1989). Проте.'окремий науковий i практичний iHTepec викликае дослщження белкового складу плазматично! мембрани еттелпо тонкого кишечника велико! рогато!" худоби. Наявнхсть у цього виду тварин ба-гатокамерного шлунка, до складу якого входять передшлункн (рубець, ехтха, книжка) i власне шлунок (сичуг), передбачае ¿снування ряду особливостей в оргатзацн структур-них i функцюнальних одиниць травного каналу. Вони обумовлеш, перш за все тим, що передшлункн у велико! рогато! худоби виконують ряд функцхй травно! системи, яю не характерна для шлунка моногастричних тварин.

Не можна залишити без увага особливосп травно! системи у новойароджених телят, в яких у nepmi дш життя передшлункн не функщонують. Тобто !х травна система прир1внюеться до такох у моногастричних (Базанова Н.У., 1987; Измайлов 'Г.У., 1991). У цей перюд основним продуктом харчування новонароджених тварин е молозиво -фактор, який кр]м того, забезпечуе формування колострального ¡мухитету i рези-стентн1сть у першх дш i тижш постнатального розвитку. Вщсутнють ¡мунних гло-булшв у KpoBi телят при народженш (Butler Т.Е., 1983), висока концентрация ix в моло-зив1 KopiB (Butler Т.Е., 1983; Захаренко М.О., 1993) та присутшсть в молозшп inriöiTopiB протеол1тичних ферменэтв (Fellenberg R., 1980) забезпечують штенсивне надходження ¡мунних бшюв у нативномусташ в кров у nepmi години життя тварин. Безсумшвно, що всмоктування ¡мунних глобулнив ввдбуваеться при цьому певними, але ще не вивчени-ми молекулярними структурами плазмалеми ентероцит1в.

Важливою проблемою в першд новонароджеиосп телят е гостр! розлади травления (неонатальш дхаре!), як( наносять значних матер1алышх збитшв тваринництпу розвину-тих кра!н, у т. ч. Укра'ши. 1снуе щлий комплекс р1зномаштних факторт, яка сприяють виникиенню I розвитку ще! патологи. Однак, незважаючи на значку кшькють досладжень по вивченню гострих розладхв травления, едина думка про причини 1 ме-хашзми порушень травления у новонароджених телят ввдеутня.

Одним ¡з факторхв порушення мембранного травления та розвитку його гострих роз-лад!в у тварин може бути иадлишох небшкових азотових сполук 1 продуктов !х метаболизму. Небшковик азот, як продукт перетворення протешв корму, за ряду умов здат-ний накопичуватись у силосованих 1 сшажованих кормах, молозшп та тканинах хворих тварин у значних илькостях у вигляд! амоншного, амшного та а.ч]дного азоту, що тдтверджено результатами дослзджень, проведених сшвроб1тниками кафедри бкшмн 1 бютехнологп Нацюнального аграрного утверситету (Мельничук Д.0.1 ш. 1987; Заха-ренко М.О., 1993). У цьому аспект важлпвим е вивчення впливу вказаних речовин на процеси мембранного травления 1 транспорту поживних речовин у кишечнику велико! рогато! худоби.

Таким чином, доыпдження бшыв АМ1 БМ ештелш тонкого кишечника велико! рогато! худоби та новонароджених телят дозволить глибше зрозушти особливоста бкшми мембранного травления та формування колострального 1муштету у жуйних тварин. Доследження впливу неб!лкових бюгенних азот-вм1сних сполук на ферментш 1 транспорта! системи плазматично!' мембрани ентероцитт тонкого кишечника велико! рогато! худоби мають значно розншрити та поглибити розумшня молекулярних ме-хашзшв патолопй травного каналу, а також можуть бути лпкористаш як теоретична основа для розробки нових 1 модифшацй ¡сиу ю чих способ ¡в профилактики та ли;уван-ня хворих тварин.

Зв'яаок роботи з иауковими програмамн, планами, темами. Робота е частнною доелвджень, що виконувались по завданню Мшстерства Ыльського гостюдарства 1 про-довольства Укра'ши: "Вивчити особливосп бшх1м!чних процеав у новонароджених телят у норм та за гострого розладу травления з метою розробки методш корекцп вияв-лених порушень", № держреестр. 019311025527; тематики ДКНТ, №5/193, шифр "Еттелш"; тематики Кабшету Мппстр1в Укра'ши: "Досладити молекулярш мехашзми процеав травления у шлунково-кишковому траки сьчьськогосподарських тварин", № держреестр. 0196Ш01913.

Значна частина дослзджень виконана автором як ¿менним стипендиатом Кабшету МЫстрв Укра'ши за темою "Бшки плазматично! мембрани еттелш тонкого кишечника велико! рогато! худоби в онтогенез! та при патологи" (1994-1996 рр.).

Мета I задач! дослйжеиня. Вивчити бьчковий склад плазматично! мембрани еттелш тонкого кишечника доросло! велико! рогато! худоби та новонароджених телят I встановити вадношення окремих бшыв плазмалеми ентерощгпв новонароджених тварин до рецепци' ¡мунних глобулЫв. Дослщити вплив бюгенних исбижових азот-вмюних сполук на процеси мембранного травления у тонкому кишечнику новонародже-

них телят.

Для досягнеиня мети були поставлеш так! задачи

- ДОСЛ1ДИТИ білковкй склад ашкально! 1 базолатерально! мембран епітеліальних клітин тонкого кишечника доросло! велико? рогато!' худоби;

- вивчити особливоси білкового складу апікально! та базолатерально! мембран енте-роцитів тонкого кишечника новонароджених телят у перші дні постнатального розвитку;

- провести яюсний 1 шльюсний поршнялышй анал!3 Силкового складу плазматично! мембрани ештел!ю тонкого кишечника дорослих та новонароджених тварин;

- вивчити актившеть ферменпв ашкально! 1 базолатерально! мембран ентероцит тонкого кишечника доросло! велико! рогато! худоби та новонароджених телят;

- дослщитн вплив бюгенних небшкових азот-вмюних сполук на актившеть фер-мент1в плазматично! мембрани еттелио тонкого кишечника;

- вивчити вплив небикових азот-вмкних речовин на вмют циюнчних нуклеоттадв в 13ольованих ентероцитах тонкого кишечника новонароджених тварин;

- досладити рецепщю бшками плазматично!" мембрани ентероцштв тонкого кишечника 1мунних глобулийв.

Наукова новизна одержаних результат!». Вперше вивчено бшковий склад, актившеть ферменив та ¡мунофункцюнальну актипшеть бшыв плазматично! мембрани еттел^ю тонкого кишечника велико! рогато! худоби в рпш перюди постнатального онтогенезу.

Встановлено вщмшзпеть бшкового складу та активноеи ферментних систем ашкаль-них та базолатеральних мембран ентерощгав тонкого кишечника ршшх впеових груп велико! рогато! худоби.

Виявлено особливоси бшкового складу та активное^ фермент! в аткально! 1 базолатерально! мембран епггелш тонкого кишечника новонароджених телят 1 дорослих тварин, яю характеризують стан процеав мембранного травления, всмоктування та сек-реци речовин в онтогенез!.

Отримано нов! даш по впливу небшкових азот-вмкних речовин на функцюнальну актившеть плазматично! мембрани егнтелто тонкого кишечника велико! рогато! худоби. Вперше показано, що амоншний 1 штратний азот викликають змшу активносп ферментаашкально! та базолатерально! мембран ентероципз тонкого кишечника здоро-вих новонароджених телят.

В плазмалем! еитерощтв телят на момент народження ш'дкрит) нов1 полшептиди з молекулярними масами 120, 87 та 75 кД, яы зникають з мембрани у перш! дш неона-талъного онтогенезу 1 ввдеутш у дорослих тварин. Методом ¡муноблотингу встановлено, що вщкрит! бшки, а також полшептиди з молекулярними масами близько 100 та ~24 кД з ашкально! мембрани егнтел1ю тонкого кишечника новонароджених телят (шк 1 година, до першо! гсд1вл1 молозивом) та полтентид 110 кД з ашкально! мембрани ен-терощгив телят 3-х добового вжу проявляють здатшеть до рецепци ! му но глобул ¡шв велико! рогато! худоби. На основ! отриманих даних запропонована ппотеза рецепторно-

ендоцитозного мехаюзму формування колострального ¿муштету у велико!' рогато! ху доби.

Практнчне значения одержаних результатов. Результата досладжень розширюют! 1 поглиблюють кнуюч! уявлення про молекулярну структуру, оргашзацпо т; функцюнальш характеристики плазматично!' мембрани ештелио тонкого кишечника Отримаш дан] е основою для подальших дослщжень ссобливостей процеав мембранно го пдролЬу, транспорту та сскреци речовин у травному канал; жуйних тварин.

Результата вивчення впливу амоншного та штратного азоту на фувкцюнальну ак тившеть фермснт1В апхкально! 1 базолатерально!' мембран сгцтслпо тонкого кишечник; велико!' рогато!' худоби суттево доповнюють концепцда етюлогн та патогенезу гостри? розлад1в травления алиментарного характеру у новонароджених телят 1 можуть бути ви користаш при розробщ нових ефективних профшактичних та терапевтичних засоб!в.

Запропонована гшотеза рецепторно-ендоцитозного мехашзму формування колост рального ¡муштету, суть я ко! полягае у зв'язуванш ¡муноглобулшв молозива матер!: бьтковими рецепторами плазматично!' мембрани ентерощтв новонароджених 1!'х тран спорт! у склада комплексу "^-рецептор" через клггпиу у кров'яне русло. Ця гшотез; може бути основою для фундаментальних 1 прикладних дослзджень по вивченше етюлогн та патогенезу ¡мунодефщитних сташв 1 шдбору д1евих засоб^в шдвшценш ¡муниого статусу новонароджених телят.

Розроблений метод отримання аткальних 1 базолатеральних мембран, з використан ням в якосп вихвдного матерхалу !зольованих клшш епггел1ю кишечника, рекомен дуеться для застосуваиня у наукових дослщженнях як бъчыи ефективний, шж отриман ня цих мембран Ь зюкрШу слизово!' оболонки.

Одержан! результата можуть бути використан! у навчальному процеы при вивченн бкшми I ф13юлогн тварин.

Особистий внесок здобувача. Участь здобувача в отриманш наукових результате яы покладено в основу дисертацн, становить 90%. Ним власноручно проведен! вс доелвдження за основними методиками, описаними у дисертацшнш робот!, а саме: тео ретична розробка та практичне застосування метод!в та робочих схем для отриманш суспензн ¿зольованих ентероцит!в, ашкальних ! базолатеральних мембран ¡з еп!тсл1к тонкого кишечника дослщних труп тварин; ва основн! дослщження по бю.тпчнш ха рактеристищ отриманих препарата, у т.ч. вивчення полшептидного спектру плазмати чно'1 мембрани ештелда тонкого кишечника методом ЕФ у ПААГ 5,7,5 та 15%-но! кон централи, як!сний 1 ильюсний пор!вняльний анал1з бшкового складу ап!кальних I ба золатеральних мембран ентерощтв тонкого кишечника дорослих 1 новонароджени? тварин, вивчення активностг мембранних ферменпв у норм! та п!д впливом р1знш форм бюгенних небшкових азот-вмшних сполук, а також дослщження рецепца бшка ми плазмалеми ентерощтв тонкого кишечника !муноглобулпив. Здобувачем сфор мульована гшотеза та запропонована схема рецепторно-ендоцитозного мехашзму фор мування колострального ¡муштету у велико!' рогато!" худоби. Особистий конкретнш внесок по кожшй науковШ стагп, яка була опубл!кована здобувачем у сшеавторстш

задекларований у списку опублжованих праць автореферату.

Апробафя результат»! дисертацй". Основш результат« дисертацй доповдались на: наук. конф. молодик учених (УНД1ЕВ, Харю в, 1988 та СГ1, Кам'янець-Подътьеький, 19В9); 21-й мкькш конф. "Молекулярш мехашзми фпюл. процеав" (1н-т ф1зюл. HAH Украши ¡м.О.О.Богомольця, Кшв, 1988); 8-й Всес. конф. молодих учених-бюлопв "Еколопчш питания рацюнального природокористування" (1н-т бюлогп Латв. АН, Рига, Î989); Всес. симп. "Biox. с.-г. тварин i Прод. програма" (Кшв, 1989); Всес. симн. "Обм!н лшодв i використання жир1в в год! мл i с.-г. тварин" (Суми, 1989); Всес. симп."Мембрана шдтинково! кайми. Ферментш i транспорта! процеси" (Рига. 1990); Всес. хонф. "Фшолопя травления i всмоктування" (Краснодар, 1990); Всес. з'!зд! гаст-роентеролопв (Лешнград, 1990); VI та VIIУкр. 6iox. з'гзд! (Кшв, 1992, 1997); Ann. Meet. Amer. Soc.Anim. Sei. - (Minneapolis, USA, 1994); Наук.-практ. конф. "Нешфекцшна па-толопя тварин" (Ri л а Церква, 1995); М1жн. конф. "Акт. пробл. бюлогп тваринництва" (Боровеьк, PocÎH, 1995); European Society cf Veterinari and Comparative Nutrition Conference (Munich, Шмеччина, 1997); М1жн. наук.-практ. конф. "Суч. проблеми вет. медицини, зоошженери та технологш продукпв тваринництва" (JIbbîb, 1997); наук.-практ. конф. Нац. агр. ушверситету (Ки!в, 1989; 1990; 1991; 1992; 1993; 1994; 1995; 1996; 1997; 1998).

Публжацй". За материалами дисертацп опубл1ковано 48 роб!т. 3 них статей у науко-вих виданях - 13 (5 одноос1бних), праць мгжнародних, всесоюзних, загальнодержавних та галузевих з'!зд1в, симпозиум!» i конференидй - 29.

Структура та обсяг дисертацй". Дисертацшна робота складаеться з таких роздь^в: "Вступ", "Огляд лггератури" (3 роздии), "Матер1али i методи дослщжень" (1 розди), "Результата та ïx обговорення" (4 роздшО, "Заключения", "Висновки" та список вико-ристаних джерел (660 найменувань). Дисертащю викладено на 319 сторшках машинописного тексту, вона мютить 24 таблищ, 43 рисунки та 9 додатив.

Загальиа методика та основш методи досладжеиь

Дослвди проводили на 6a3i навчального господарства Нацюнального аграрного ушверситету "Великосштинський" Фаст!вського району Кш'всъко! облает!.

В екепериментах викориетовувалась велика рогата худоба чорно-рябо! породи. 3 досл!дних тварин формували групи (по 5-6 гол1в) клМчно здорово! доросло!' велико! рогато! худоби bïkom 3-5 poKiß, новонароджених телят у siu,i 3 доби i щойно народжених телят (через 45-60 хвилин шеля народження). Доросл1 тварини та телята 3-х добового в!ку, яких використовували у гострому доапдп попередньо витримувались на голодшй flieTi протягом 12-18 годин. Щойно народжеш телята використовувались у гострому Д0СЛ1Д1 до першого згодовування !м молозива.

У дослщах використовували передню /нлянку (2-6 м) порожньо! кишки дорослих та новонароджених тварин. В якоси стартового материалу для отримання фракцш апжаль-них i базолатеральних мембран на початкових етапах виконання дано! робота викори-

стовували 3icKpi6 слизово! оболонки, а на бшьш ni3Hix (основы доследження) - сус-neH3iro ¡зольованих ентероцига. В останньому випадку застосовували два розроблених нами для велико! рогато! худоби методи: Х1шчний (цитрат/ЕДТО) та ферментативний, з використанням 0,05% колагенази (Merck. США).

Аткальш та базолатеральш мембрани i3 ештелио кишечника отримували зпдно роз-роблено! нами схеми, за етапами: а) гомогешзащя материалу; б) вщдьчення AM i БМ В1д гомогенату; в) роздшення цих мембран одна в!д одно!; г) очшцення загальних фракцш AM i БМ на rpaflieirri густишь

Гомогешзацпо 3icKpi6y слизово! оболонки чи суспснзи ентсрощтв проводили у ножовому гомогешзатор! MPW-302 (Польща) у середовжщ такого складу (мМ): 250 сахароза, 5 ЕДТО, 5 Tpic-HCI буфер, рН 7,4, t 6-8°С, з оптимальним сшвввдношенням материалу досередовища гомогетзаци для 3icKpi6y слизово! оболонки - 1,8-2,0 г бшка на 380 мл, а для суспензй ¿зольованих ентерощтв - 0,8-0,9 г бшка на 135 мл, та оптималь-нш гомогешзащ! матер!алу при 9,5 тис. об ножа за 1 хв., 20 сек.

Вудаления AM i БМ гид супутшх кл1тинних органел та грубих мембраниих фракцш здшснювали при 10 тис. g протягом 15 хв, отримання загальних фракщй цих мембран:

Таблиця1 15 тис. g/бОхв. -для AM i Характеристика аткальних (лужна фосфатаза) i базолатеральних (Na\ К+-АТФаза) мембран (мкмоль Фн/мг бшка за 1 год.), одержаних i3 ¿зольованих епггел1алышх кштин i 3icKpi6y слизово! оболонки тонкого кишечника велико! рогато! худоби, М ± т, п-5

Фракщя

Лужна фосфатаза Na+, 1С-АТФача

70 тис. g/60 хв - для БМ. 1х очищения зд1Йснювали центрифугуванням на rpaAieHTi густини сахаро-зи: 30; 35; 40; 43; 45; 46,5; 48 i 50% - для АМ, та 20; 25; 31,5; 33; 35; i 40% -для БМ, при 105 тис. g протягом 4 год. Фракцн АМ локалнувались у зонах град!ента густинисахароз!! у межах 46,5 та 48%, а БМ - 31,5 та 33%. ïx ni д бирал и в о к ре MÎ проб1рки, розбавляли фЫолопчним розчином з рН 7,4, (t 4-6°С) i осаджу-вали дентрифугуванням при 105 тис. g протягом 30 хв.

Оцщку очистки та забруднення мембранних препарат]в здшснювали за актившстю !х маркерних ферментш - лужно! фосфатази (АМ) i Na+, К+-АТФази (БМ) (Murer H., et al. 1976). При виконанш основних дослщжснъ нами була вщдана перевага методу отрк-мання фракщй плазматично! мембрани Î3 використанням в якосэт базового материалу

Гомогенат Аткальш мембрани

Базолатеральш мембрани

Гомогенат Аткальш мембрани

Базолатеральш мембрани

1зольоваш ештел1алъш клшши 19,2 ±1,8 1,50 ±0.2 234.0 ±19,2 1,44 ±0,4 (12,2)* (0,97)** 93,0 ± 2,8 29,8 ± 2,4 (4,8)** (19,8)* 3icRpi6 слизово! оболонки 15,8 ±1,2 3,9 ±07 133,0 ±13,2 4,1 ±0.5 (8,5)* (1,06)** 50,4 ±14,4 34,4 ±8,6 (3,2)** _(9.1)*

Примггка: * ступшь очистки, ** ступшь забруднення фракщй AM i БМ мембран вщносно гомогенату.

суспеши ентерощтв (табл. 1.).

Фракщйний склад б1лк!в AM i БМ вивчали методом електрофорсзу, зпдно процедур^ описанш Лемл! (Laemmly, U.K., 1970) у систем! АВГЕ-1 ф1рми "Хийу-Каллур" (Ес-тотя), яка забезпечуе розд!лснкя б1лыв за принципом вертикального гель-електрофо-резу у пол1акрилам1дному гель

Якюну та кшьюсну характеристику 6)ЛК1В проводили шляхом денситометри гел1в на спектрофотометр! Specord М-40 з викорнстанням оптико-мехашчно'1 приставки для ска-нування та математично'1 обробки денситограм за програмою Gel-scanning. Молеку-лярш маси окремих бшкових фракций розраховували з кшбрувального граф!ка елект-рофоретично'1 pyxoMocri бьтыв-стандарлв молекулярних мае: 14,1; 20; 24; 29; 36; 45; 66; 97,4; 116 та 205 кД (MW-SDS-200 Kit, Sigma, США).

Концснтрацгю бьчка в пробах AM i БМ визначали за методом Jloypi i с!пвавт.,(Ьоиту О.Н. etal. 1951).

В мембрашшх препаратах визначали актишпеть лужно!" фосфатази (КФ 3.1.3.1.) (Murrer H. et al. 1976), у- глутамштрансферази (КФ 2.3.2.2.) (Ceriotti G., 1972), лейци-намшопептидази (КФ 3.4.11.1.) (Lap-Test, "Fermognost", Шмеччина), мальтазн (КФ 3.2.1.20.), лактази (КФ 3.2.1.23.) i сахарази (КФ 3.2.1.48.) (Dahlgvist А., 1968) в мо-дифшацн (Tsuboi, К. et al., 1979). Актившсть №+,К+-АТФази, Са2+, Мя2+-АТФази га Mg2+-ATФaзи (КФ 3.6.1.3.) в AM i БМ визначали як рекомендовано (Болдырев АЛ., 1977).

При вивченш впливу небшкових азот-вшених сполук на активность фермешчв AM i БМ ентероцитт в шкубащйне середовище, як джерела небелкового азоту, вносили хлорид амоюю у концентраци 1-20 мМ, сечовину у концентраци 5-20 мМ, а також н1трат калто - »¡л 0,02 до 0,5 мМ

3 метою доелвдження впливу небшкових азот-вмюних речовин на piBenb цАМФ i цГМФ в ентероцитах, до суспензи клтт (2-5 мг б1лка у 1 мл) вносили хлорид амонш у концентраци 10 мМ. Вшст цАМФ та цГМФ у доелвдному матер1ал! визначали радкнмунним анал1зом за допомогою комерцшного набору реактив1в "Amersham" (Aнглiя).

Вщношення бьлкш плазматично!" мембрани еттел!алышх клгшн тонкого кишечника до рецепци ¡мунних глобулшв вивчали методом ¿муноблотингу (Towbin H., Gordon j., 1984) за такою схемою: а) попередне роздшення мембранних бшлв методом ЕФ у 7,5%-ному ПААГ у присутносп 0,1 % ДДС-Na. (Laemmly U.K., 1970); б) ¡муноблотинг у систем! Товбша-Гордона (Towbin H., Gordon j., 1984), який включав етапи перенесения бшыв на штроцелюлозну мембрану, блоковану BSA "Sigma" (США) з частксвим вщно-вленням ïx miTUBHOÏ структури, шкубацда мембран ¡з стандартною сироваткою велико'! рогато'! худоби у розведенш 1:2, та проявления ¡мунолопчних властивостей oî.-îkîb у присутност пероксидазного кон' югату антисироватки з ¡муноглобулшами свит проти ¡муноглобултв велико"! рогато'1 худоби.

Отримаш результати оброблено статистично (Поляков О.В. та ¡н. 1985).

Б1ЛКОВИЙ СКЛАД ПЛАЗМАТИЧН01МЕМБРАНИ ЕНТЕРОЦИПВ ТОНКОГО КИШЕЧНИКА ВЕЛИКО! Р0ГАТ01ХУДОБИ

Проведеними дослвдженнями встановлено, що бшковий склад аткальннх мембраи суттево шдр1знясться ввд базолатеральних за яюсним та кшьмсним складом , а обо* мембранних фракций - м!ж дорослими та новонародженими тваринами.

За даними ЕФ у 7.5%-ному ПААГ в АМ ентероципв дорослих тварин виявлено 18, г в БМ - 20 полшептидних фракцш з молекулярними масами у межах в'щ 205 до 24 кД Кр1м цього, в обох мембранах присутш високо- та низькомолекулярш нолшептидн! фракцп, як] сконцентроваш у зонах вище 205 та нижчс 24 кД, вщновщно (рнс. 1, А).

Сканування гел1в (рис. 1, Б,В) та статистична обробка результат дослвджень дозволили провести порпшялышй анал1з окремих полшептидних фракций АМ 1 БМ

По-перше, в АМ виявлено полшептидну фракщю з молекулярною масою 110 кД, як1 в БМ не зареестрована. По-друге, в АМ у пор^внянш з БМ, встановлено тдвшцени* ввдсотковий вм]ст полшептидних фракцш з молекулярними масами 95, 63, 52 та 43 кД Накшець, по-трете, в АМ не виявлеш полшептидш фракцн з молекулярними масамг 115 та 87 кД, яы присутш в БМ (рис. 1, Г).

Для виявлення 1 характеристики високо- 1 низькомолекулярних полшегггиднп? фракщй у подальших досладженнях нами був використаний метод електрофорез) б!лмв в жшакриламздному гел15 115%-но!' концентрацн. Такий шдхщ дозволив вияви ти в АМ при ЕФ в 5%-ному гел! додатково 3 полшептиди (300, 215 та 127кД), а в 15%' ному гел1 - ще 5 полшептщив (22,5, 21, 17, 14,2 та <14,2 кД). В БМ при ЕФ в 5%-ном) гсл! виявлено додатково ще 3 полшептиди (300, 215 та 127 кД), а в 15%-ному гел! - б полшептщив (22,5, 21, 17, 15,5, 14,2, та < 14,2 кД).

Загалом в АМ ентероцнпв тонкого кишечника велико! рогато! худоби виявлено 2( полшептидних фракцш. Вздмшностями у пор!внянн! з БМ е наявшсть полшептидш ■ молекулярними масами 110, 31 та 26 кД, а також достойрно вищий р1вень нолшептид них фракщй з молекулярними масами 95, 63, 52, 43 та 33 кД, 1 нижний - фракцн 24 кД

В БМ ентерощтв тонкого кишечника доросло! велико! рогато!' худоби виявлено 25 полшептидних фракщй. ЕПдмшностями у пор1внянт з АМ е наявшсть полшептид1в ; молекулярними масами 115, 87, 35 та 15,5 кД.

Отримаш нами результати тдображають структурт особливост! АМ I БМ 1 сввдчат! про !'х р!зну функцюнальну роль у процесах травления, всмоктування та секрец! речовин у травному канал!.

Особливост! травно!' системи у новонароджених телят передбачають ¿снування мож ливих вщмшностей в бшковому склад! АМ 1 БМ.

За даними ЕФ в 7,5%-ному ПААГ в плазмалег.н ентерощтв тонкого кишечника но вонароджених телят у виц 3 доби виявлено 19 полшептидних фракщй в АМ та 17 - \ БМ (рис. 2, табл. 2).

Загальним для АМ та БМ ентерощтв цих тварин е наявшсть полшептщцв з молеку лярними масами 155 та 135 кД, я и вщеутш у дорослих.3 шшого боку, в АМ 1 БМ енте

205

116 97.4

66 45 29

ам бм

м 1 2 3 4 5 м 1 2 3 45

А

Рис. 1. Характеристика полшептидних фракцш ашкальних (АМ) та базолатеральних (БМ) мембран енте-роципв тонкого кишечника велико! рогато! худоби за данями електрофорезу в 7,5%-ному пол^акриламщному гел1.

Позначення:

А: М - марксрш б)лки з молекулярними масами 205. 116, 97,4, 66, 45 та 29 кД; 1, 2, 3, 4, 5 - проби АМ \ БМ дослщних тварин.

Б, В: денситограми бшив АМ (Б) та БМ (В); » 205 -< 24 - молекулярт маси полшептидних фракцш. Г: процентний вмют полшептидних фракцш АМ \ БМ, М ± ш, п=5;

* - вфопдна р1зниця (Р < 0,05) ънж АМ 1 БМ.

АМ БМ

М а б в А Б В

116 97,4

66

45

29

;: ' jm*t «

рин • ■- «

, í ' « И' « ' * И; < ' i

у t <# t *

*** »

та* - 1 , f < л

А

Рис. 2. Електрофореграма (А) та денситограми (Б, В) полшептидних фракцш АМ i БМ еятерощтв тонкого кишечника дорослих та новонароджених тварин за даними електрофорезу у 7,5%-ному пол^акрилам'щному гел1. Позначення; A: MapKepiii бшки з молекулярними масами 205, 116, 97,4, 66, 45 та 29 кД; а (А) - бшки АМ (БМ) дорослих тварин; б (Б) - бмки АМ (БМ) новонароджених телят 3-добового В1ку; в (В) - бинси АМ (БМ) щойно народжених телят;

Б, В: денситограми быыв АМ(Б) та БМ (В) дорослих тварин (I), новонароджених телят 3-х добового В1ку (II) та щойно народжених телят (III);

» 205 - < 24 - молекулярш маси полшептидних фракций.

в

и

Таблиця 2

Бшки ашкальних i базолатеральних мембран снтероциэтв тонкого кишечника велико! рогато! худоби р!зного вшу за даними електрофорезу у 7,5%-ному

пол1акрилам1дному гели M±m, n=5

Молекулярш АГОКАЛЬН! МЕМБРАНИ БАЗОЛАТЕРАЛЬН! МЕМБРАНИ

маси бшав, Дороац Новона зоджеш Дороет Новона рОД/rXHi

кД тваршш Bis 3 доби BiK 1 година тваршш BiK 3 доби BiK 1 ГОД1ЧШ

»205 2,32±0,67 5,38±0,44* 3,92+0,34 2,63±0,33 4,12±0,52* 3,40+0,38

>205 1,00±0,07 1,60±0,21 1,3±0,23 0,98+0,15 1,02±0,14 1,10+0,2

205 1,58±0,22 2,28±0,23 2,3±0,3 1,49+0,18 1,30±0,18 1,54±0,16

155 — 3,38±0,57 3,4±0,32 — 2,84±0,16 3,04±0,32

145 5,42±0,2 — — 6,27+0,48 — —

135 — 2,41 ±0,26 2,75+0,2 — 1,64±0,18 2,50±0,19

120 — — 3,42±0,22 — — 3,98±0,56

115 — — — 2,86+0,31 3,02+0,43 2,98±0,3

110 2,76±0,27 3,00±0,41 СЛ1ДИ — — —

100 1,91±0,17 2,02±0,19 3,48±0,31 1,42±0,15 — —

95 2,85±0,19 4,46±0,44 4,68±0,47 1,30±0,11 3,00±0,33>: 4,84±0,33**

87 — — 6,01±0,21 1,66+0,19 1,36+0,12 1,42±0,13

80 5,35±0,57 4,88±0,61 4,09±0,24 5,53+0,68 — —

75 — СЛ1ДИ 5,42±0,68 — — 4,00+0,22

72 4,00+0,31 — — 3.04±0,36 — —

66 4,20±0,29 4,00±0,45 1,48±0,19** 4,96±0,56 — —

63 4,92±0,37 3,55±0,38 2,! ±0,27 2,70±0,32 6,94±0,29* 5,78±0,43

57 5,67±0,47 5,15+0,27 4,32±0,26 4,73±0,35 4,42*0,38 3,82+0,24

52 8,25±0,44 5,94±0,29* 6,98±0,44 3,10±0,39 5,48±0,26* 5,56±0,21

46 8,45±0,74 6,80±0,45 7,58±0,42 9,22+0,64 6,66±0,34* 4,78±0,29**

43 5,53±0,74 6,86±0,3б 4,16±0,07** 1,73±0,9 1,92+0,12 2,02+0,12

35 — 1,52±0,19 — 3,55±0,36 4,00+0,21 3,10+0,3**

33 6,40±0,51 5,48±0,39 3,68±0,34** 7ДЗ±0,62 6,30+0,21 3,46±0,24**

31 2,78+0,15 2,16±0,05 2,58+0,23 2,63±0,2 2,04+0,3 1,73±0,12

29 6,80+0,53 2,96±0,15* 2,68±0,4 8,80x0,64 7,58±0,26 4,61±0,32**

26 3,92±0,3 3,06±0,26 — 4,40+0,6 6,90+0,41 6,10+0,35

24 1,44+0,17 4,49±0,35 4,37±0,29 2,00±0,23 2,40+0,12 2,02+0,23

<24 13,5±1,84 19,29±1,69 18,11±2,06 14,32±1,73 22,74±2.5 26,32+3,03

Примпта: * - BiporiAHa р1зниця (Ps0,05) у пор1вняяш з показниками у дорослих твари»; ** - в^ропдна {пзшщя у пор!внянга з аналопчними даними у новопароджених телят вжом 3 доби.

роднив новонароджених не виявлеш полшептидс« фракци з молекулярними масами 145 та 72 кД, а в БМ ще й 100 та 66 кД, яы в плазмалекп ентерощтв дорослих тварин мають досить високий р1вень.

Ввдомо, що перюд раннього постнаталыгого онтогенезу характеризуеться штенсив-ними процесами синтезу травних ферментов у клтшах кишечника, oxpeMi з яких за молекулярними масами в1др1зняються вщ зрших форм (Nairn Т. et al., 1986; Nsi-Emvo Е. et al., 1987; Buller H.A. et al., 1990). Одш i3 синтезованих фермегтв можуть мати мснид

молекулярш маси, тод1 як шш! - бшыш, у пор1внянш Í3 зршими ферментами. Перин до-сягають po3MipiB зрших форм за рахунок глжозилювання бшково\' молекули, а друг-i -навпаки, за рахунок вщцеплення низькомолекулярних фрагменте В1Д молекули бшка (Nairn Т. е£ al., 1986, Buller Н.А. et al., 1990).

Враховуючи це, можна допустити, що з bíkom тварин полшептиди AM i БМ з молс-кулярними масами 155 та 135 кД трансформуються у полшептидну фра к ni ю з 145 кД. Не виключено також, що полшептид AM з молекулярного масою 135 кД нредставляе зршу форму лактази (Buller Н.А. et al., 1990; Castillo R.O. et al., 1990; Nairn t., 1994) -бшка, bmíct якого у плазматичшй мембран! ентероциту в молочний (молозивний) иерюд год!вл1 новонароджених тварин максимальний (Seetharam В. et al., 1977).У випад-ку шших фракщй, hkí не виявлеш в AM (72 кД) i БМ (100, 72 та 66 кД) ентерощптв новонароджених телят 3-х добового вшу, допустимою може бути ппотеза про íx гюяву в мембраш у прочей онтогенетичного розвитку, як це властиво ¡ншим тваринам (Seetharam В. et al., 1977)

Уткальною е полшептидна фракцт AM новонароджених телят 35 кД. У зршому виц полшептид з такою молекулярною масою в AM не вкявляеться. Це дозволяе припусти-ти, що бшок (бшки) nieí фракцп е спецш{нчшш компонентом мембрани, який виконуе певну функщональну роль тшьки у перюд раннього постнатального онтогенезу. При-чому, цей бшок може мати колостральне походження, посильки при народженш телят (до першого згодовування '¿м молозива) «in в AM також вщеутшй.

Високий р!вень в плазматичшй мембран! ентерощтв новонароджених телят полше-птид1в з молекулярними масами 95, 63, 52 та 24 кД, пояснимий з точки зору íhtchckb-них б!осинтетичних процес!в по утворенню пдролггично-транепортних, структурних, редепторних та íh. 6úikíb у клшшах кишечника, як це властиво для перших дшв постнатального онтогенезу (Seetharam. В. et al., 1977).

У плазматичшй мембран! ентероцимв новонароджених телят 3-х добового bíkv вста-новлено floCTOBipHO нижчий вдаотковий bmíct фракцш з молекулярними масами 52 i 29 кД - в AM, та 46 кД - у БМ (див. табл. 2). У той же час результата досладжень вказу-ють на поступове, стшке шдвищення р1вня цих полшептщпв шд перюду новонародже-hoctí до зр!лого стану оргашзму. Отриманий експериментальний факт CKopime всього необхедно розглядати як законом!рне явище, яке можна пояснити з точки зору перебу-дови та становления травно! системи, а також як результат адаптацп до кормових ком-noHeHTÍB ращону.