13

Семинар 7. Условия культивирования и методы хранения микроорганизмов

Для роста микроорганизмов существенное значение имеют не только со­став питательной среды, но и такие факторы, как кислотность среды, аэра­ция, температура, свет, влажность. Развитие микроорганизмов возможно лишь в определенных пределах каждого фактора, причем для различных групп мик­роорганизмов эти пределы часто неодинаковы.

Температура. Интервалы температур, в которых возможен рост различных микроорганизмов, заметно варьируют. У мезофилов, к которым относится большинство известных нам форм, температурный оптимум лежит в интер­вале от 25 до 37 °С. У термофилов он значительно выше: от 45 до 80 — 90 °С. Психрофилы хорошо развиваются в интервале температур 5—10 °С. Отклоне­ние температуры от оптимальной неблагоприятно влияет на развитие микро­организмов, поэтому микроорганизмы выращивают в термостатах или спе­циальных термостатированных комнатах, где с помощью терморегуляторов поддерживается соответствующая оптимальная температура. Мезофильные бактерии, естественным местом обитания которых являются вода и почва, выращивают в интервале от 20 до 30 °С, тогда как бактерии кожных покро­вов, слизистой или кишечника человека и животных культивируют при бо­лее высокой температуре: 35 — 37 °С. Для выращивания психрофилов исполь­зуют холодильные камеры.

Свет. Для роста подавляющего большинства микроорганизмов освещение не требуется. Напротив, прямые солнечные лучи отрицательно влияют на их развитие, поэтому такие микроорганизмы выращивают в темноте. Свет необ­ходим для роста фототрофных микроорганизмов. Однако естественное освеще­ние используют редко, так как оно непостоянно и плохо контролируемо. Как правило, фототрофов выращивают в люминостатах, т.е. камерах, освещенных лампами накаливания или флуоресцентными лампами дневного света. Необхо­димая температура в люминостатах создается благодаря вентиляции или холо­дильному устройству.

Выбор источника освещения определяется спектром его излучения и дли­нами волн, при которых культивируемые микроорганизмы осуществляют фо­тосинтез. Для выращивания пурпурных и зеленых бактерий лучше использо­вать лампы накаливания; для культивирования цианобактерий и микроводо­рослей нужно применять флуоресцентные лампы дневного света. Помимо спек­трального состава света обращают внимание на освещенность, которую изме­ряют с помощью люксметра.

Активная кислотность среды. Активная кислотность (рН) среды имеет реша­ющее значение для роста многих микроорганизмов. Большинство бактерий лучше всего растет при рН, близком к 7,0, микроскопические грибы, напротив, пред­почитают слабокислые среды, поэтому в приготовленных средах всегда следу­ет определить значение рН. Измеряют рН электрометрическим методом на потенциометре. В лабораторной практике удобно использовать различные жид­кие или бумажные индикаторы.

Широко применяется, например, жидкий двуцветный индикатор, бромтимоловый синий (бромтимолблау). Его цвет изменяется от желтого к синему при сдвиге рН от 6,0 до 7,6. При рН 7,3 индикатор имеет сине-зеленую окраску.

В случае необходимости рН среды доводят до нужного значения растворами кислот (НСl, Н₂SО₄), щелочей (NаОН, КОН) или солей, имеющих щелоч­ную реакцию (Nа₂СО₃, NаНСО₃). Для корректировки рН целесообразно иметь стерильные растворы разной концентрации.

Значение рН сред может измениться в процессе стерилизации, поэтому после стерилизации его следует проверить и, если требуется, довести до нуж­ного с помощью стерильных растворов кислоты или щелочи. Активная кислот­ность питательной среды, благоприятная для начала роста микроорганизмов, часто меняется в процессе их культивирования. Эти изменения могут быть ре­зультатом образования продуктов метаболизма или неравномерного потребле­ния отдельных компонентов среды.

Например, при потреблении углеводов в среде накапливаются органиче­ские кислоты, снижающие рН среды. В средах с КNО₃, как уже отмечалось, рН возрастает за счет более интенсивного потребления нитрат-иона и накопления ионов калия.

Чтобы не допустить чрезмерного изменения рН в культурах микроорганиз­мов и удержать его на необходимом уровне, используют различные приемы. Иногда в среды добавляют буферные растворы. В микробио­логической практике чаще других применяют фосфатные буферы. Однако если рост микроорганизмов сопровождается образованием большого количества кислот, то тех количеств буферного раствора, которые можно добавлять к сре­дам (не более 5 г фосфатов на 1 л среды), оказывается недостаточно, так как противодействие любого буфера изменению рН ограничено. В связи с этим для микроорганизмов, активно изменяющих кислотность среды, применение бу­феров не эффективно. При культивировании таких микроорганизмов в среды вводят избыточное количество мела, который нейтрализует образующиеся кислоты. Для нейтрализации кислот по ходу развития культуры можно приме­нять 10%-й стерильный раствор NаНСО₃.

Поддержание определенного значения рН во время роста особенно важно для тех микроорганизмов, которые в процессе жизнедеятельности образуют кислоты, но не обладают устойчивостью к ним. К их числу относятся молочно­кислые бактерии, а также многие псевдомонады. Большие затруднения встре­чаются, когда нужно поддержать рН в слабощелочных средах, так как для Диапазона рН от 7,2 до 8,5 подходящих буферов не существует. С этой целью иногда приходится периодически или непрерывно доводить рН до нужной величины, добавляя стерильно в среду растворы кислоты или щелочи при постоянном контроле значения рН. В современных ферментерах это достигает­ся с помощью специальных автоматических устройств.

Аэрация. Кислород входит в состав воды и многих соединений, поэтому поступает в клетки в больших количествах. Значительная часть микроорганиз­мов нуждается в постоянном притоке молекулярного кислорода. Такие микро­организмы принято объединять в группу облигатных аэробов. Энергетическим процессом у них является аэробное дыхание, а молекулярный кислород играет роль терминального окислителя.

Среди облигатных аэробов выделяют группу микроаэрофилъных микроорга­низмов, которые нуждаются в кислороде, но лучше растут, если его парци­альное давление меньше, чем в воздухе. Развитие других микроорганизмов, напротив, возможно только в отсутствие кислорода. Получение энергии у них не связано с использованием молекулярного кислорода, а для многих кисло­род даже токсичен: он угнетает рост или вызывает гибель клеток. Такие микро­организмы называются облигатными анаэробами. Факультативные анаэробы способны расти как в присутствии, так и в отсутствие молекулярного кисло­рода. Например, некоторые дрожжи и энтеробактерии в зависимости от нали­чия кислорода осуществляют аэробное либо дыхание, либо брожение. Неоди­наковые потребности микроорганизмов в свободном кислороде учитывают при выборе способа их выращивания.