Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

ТЕМА 13 ВАКЦИНЫ

1.Субъединичные вакцины

2.Противогерпетические вакцины

3. Противоящурные вакцины

4.Пептидные вакцины

5.Генная иммунизация

Вакцинация способствует форм рован ю у реципиента иммунитета к патогенным микроорганизмам и тем самым защ щает его от инфекции. В ответ на пероральное или парентеральное введение вакцины в организме хозяина вырабатываются антитела к пат генн му микроорганизму, которые при

последующей инфекции прив дят к его инактивации (нейтрализации или гибели), блокируют егоÏолесÃÓпролиферацию и не позволяют развиться заболеванию.

6.Аттенуированные вакцины Ðепозиторий7.»Векторные» вакцины

Эффект вакцинац о крыл более 200 лет назад – в 1796 г. – врач Эдвард

Дженнер. Он дока ал экспер ментально, что человек, перенесший коровью оспу, не очень тяжелую болезнь крупного рогатого скота, становится невосприимчивым к спе натуральной. Натуральная оспа - высококонтагиозное заболевание с выс к й смертностью: даже е ли больной не погибает, у него нередко возникают различные уродства, психические расстройства и слепота.

Дженн ублично провел прививку коровьей оспы 8-летнему мальчику

Джеймсу Фиппсу, использовав д я этого экссудат из пустулы больной коровьей

оспой, а зат м через опреде енн время дважды инфицировал ребенка гноем

из пустулы больного натуральной оспой. Все проявления заболевания ограничились покраснением в месте прививки, исчезнувшим через несколько дней.

Ранее такие инфекционные болезни, как туберкулез, оспа, холера,

брюшной тиф, бубонная чума и полиомиелит, были настоящим бичом для человечества. С появлением вакцин, антибиотиков и внедрением мер профилактики эти эпиидемические болезни удалось взять под контроль. Однако защитные меры со временем становились неэффективными, и возникали новые вспышки заболеваний. В 1991 г. эпидемия холеры поразила Перу; в течение трех следующих лет было выявлено примерно 1 млн. заболевших, несколько тысяч из них умерли. К сожалению, против многих болезней человека и животных вакцин не существует. Сегодня во всем мире более 2 млрд. людей страдают заболеваниями, которые можно было бы предотвратить спомощью вакцинации. Вакцины могут оказаться полезными и

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

СПИДа).

Как правило, современные вакцины создают на основе убитых

(инактивированных) патогенных микроорганизмов либо живых, но невирулентных (аттенуированных) штаммов. Для этого штамм дикого типа выращивают в культуре, очищают, а затем инактивируют или модифицируют таким образом, чтобы он вызывал иммунный ответ, достаточно эффективный в отношении вирулентного штамма. Несмотря на значительные успехи в создании вакцин против таких заболеваний, как краснуха, дифтерия, коклюш, столбняк, оспа и полиомиелит, производство современных вакцин сталкивается с целым рядом ограничений:

•ÐепозиторийАттенуир ванныеÏолесÃÓштаммы могут р вертировать к исходному штамму, поэтому необходимо постоянно контролировать вирулентность.

• Не все патогенные микроорганизмы удается культивировать, поэтому для

многих заболеваний вакцины не созданы.

• Для получения вирусов животных человека необходима дорогостоящая

культура животных клеток.

• Титр вирусов животных и человека в культуре и скорость их

вакцины могут попасть ж вые или недостаточно ослабленные вирулентные микроорганизмы, что может приве ти к неумышленному распространению инфекции.

• Н которые заболевания (например, СПИД) нельзя предупреждать с помощью традиционных вакцин.

• Большинство современных вакцин имеют ограниченный срок годности и сохраняют активность лько при пониженной температуре, что затрудняет их использование в развивающихся странах.

В последнее десятилетие, развитием технологии рекомбинантных ДНК, появилась возможность создать новое поколение вакцин, не обладающих недостатками традиционных вакцин. Для их разработки применяют методы генной инженерии.

• Патогенный микроорганизм модифицируют, делетируя гены, ответственные за вирулентность. Способность вызывать иммунный ответ при этом сохраняется. Такой микроорганизм можно безбоязненно использовать в качестве живой вакцины, поскольку выращивание в чистой культуре исключает возможность спонтанного восстановления целого гена.

• Создают живые непатогенные системы переноса отдельных антигенных детерминант неродственного патогенного организма. Такая система переноса

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

микроорганизм.

•Если патогенные микроорганизмы не растут в культуре, можно изолировать, клонировать и экспрессировать в альтернативном хозяине (например, в Е. coli или линии клеток млекопитающих) гены тех белков, которые содержат основные антигенные детерминанты, и использовать эти белки как «субъединичные» вакцины (см. следующий раздел).

•Некоторые патогенные микроорганизмы действуют опосредованно, вызывая развитие аутоиммунной реакции на инфицированные клетки организма-хозяина. Для таких заболеваний можно создать систему

специфического уничтожения клеток-мишеней, сконструировав ген, кодирующий химерный белок, одна часть которого будет связываться с инфицированной клеткой, а другая - ун чтожать ее. Эта система не является истинной вакциной, хотя она и действует только на инфицированные клетки, устраняя саму причину развития аутоиммунной реакции.

К вакцинам для животных п едъявляются менее жесткие требования, поэтому первыми вакцинами, п лученными с помощью технологии рекомбинантных ДНК, были вакцины пр тив ящура, бешенства, дизентерии и диареи поросят. Создаю ся и другие вакцины для животных, а в скором времени появятся и рекомб нан ные вакцины, предназначенные для человека.

1. Субъединичные вакцины

Как правило, вакцины сод ржат неповрежденные патогенные микроорганизмы, но при этом н живые или аттенуированные. Антитела, вырабатываемые в ответ на их вв д ние, связываются с поверхностными белками атог нного организма и запускают иммунный ответ. В связи с этим возника вопрос: должна и вакцина содержать целые клетки или лишь какието специфические поверхн стные компоненты? Что касается вирусов, то, как было показано, для выраб тки в организме-хозяине антител в ответ на

Достоинства состоят в том, что препарат, содержащий очищенный иммуногенный белок, стабилен и безопасен, его химические свойства известны, в нем отсутствуют дополнительные белки и нуклеиновые кислоты, которые могли бы вызывать нежелательные побочные эффекты в организме-хозяине. Недостатки заключаются в том, что очистка специфического белка стоит дорого, а конформация выделенного белка может отличаться от той, которую

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

приводить к изменению его антигенных свойств. Решение о производстве субъединичной вакцины принимается с учетом всех имеющих отношение к делу биологических и экономических факторов.

2.Противогерпетические вакцины

Вирус простого герпеса (HSV, herpessimplexvirus) вызывает инфекционные заболевания генерализованного или местного характера (тяжелые поражения глаз, энцефалит, урогенитальные инфекции и т. д.). Кроме того, он является

инфекции можно использовать неонкогенную субъединичную вакцину.

онкогенным, поэтому вакцинация убитым или аттенуированным вирусом сопряженаÐепозиторийс определенным риском развития рака. Для защиты от HSV-

Для создания любой субъедин чной вакцины прежде всего нужно идентифицировать те компоненты патогенного микроорганизма, которые индуцируют выработку антител. В случае HSV типа I (HSV-1) таким компонентом является гликопр теин D оболочки (gD). В ответ на введение этого гликопротеина мышам у них вырабатываются антитела, нейтрализующие

интактныйHSV. ГенÏолесÃÓgDHSV-1 был изолирован, клонирован в одном из

экспрессируюших векторов в кле ках млекопитающих и введен в яйцеклетки китайского хомячка (СНО), в которых в отличие от Е. coliпроисходит гликолизирование чужеродных белков. Полноразмерный ген gD кодирует

белок, в норме свя ывающийся мембраной клетки млекопитающего. Такой

белок труднее чистить, чем растворимый, поэтому ген gD модифицировали, удалив ту его часть, к торая кодиру т С-концевой трансмембранный домен.

Затем модифицированным г ном трансформировали СНО-клетки,

которы гликозилировали бе ковый продукт секретировали его во внешнюю

среду, поскольку он не м г встраиваться в клеточную мембрану. Лабораторные испытания показали, что антитела, вырабатываемые в ответ на введение модифицированного белка gD, эффективны в отношении как HSV-1, так и

HSV-2.

3.Противоящурные вакцины

Вирус ящура (FMDV, foot-and-mouthdiseasevirus) в высшей степени вирулентен и вызывает массовую гибель крупного рогатого скота и свиней. Для защиты от FMDV-инфекции используют вакцину, содержащую вирус, инактивированный формалином. В мире ежегодно производится примерно 1 млрд. доз этой вакцины.

Основной антигенной детерминантой, индуцирующей образование антител, является вирусный капсидный белок 1 (VP1, viralprotein 1). Это более слабый антиген, чем интактные вирусные частицы, но все же он индуцирует

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

были предприняты попытки клонировать VPl-ген.

Геном FMDV представляет собой одноцепочечную РНК. Поэтому сначала синтезировали полноразмерную двухцепочечнуюкДНК длиной примерно 8000 п. н. Затем ее расщепили с помощью рестрицируюшихэндонуклеаз и клонировали полученные фрагменты в экспрессирующемE.coli-векторе. Продукт кодирующей последовательности VPl-гена идентифицировали иммунологическими методами как часть слитого (химерного) белка, синтез которого контролируется системой pL-промотор–cl-penpeccop. Белок состоит из 396 аминокислотных остатков, содержит часть молекулы репликазы

бактериофага MS2 и полноразмерный VP1-белок FMDV, благодаря чему он и индуцируетÐепозиторийвыработку нейтрализующих FMDV антител.

Получить разрешение на применен е вакц ны, содержащей химерный белок, очень трудно, поэтому, вероятно, пр дется субклонироватьVP1-

последовательность в другом эксп есс ующем векторе. Так или иначе,

субъединичная вакцина против ящу а ско о будет готова для проведения доклинических испытаний.

Далее возникает следующ й вопрос: может ли небольшой участок белковой молекулы (домен) служить эффективной субъединичной вакциной и индуцировать выраб тку антител? Интуитивно кажется, что те домены,

которые доступны для антитела (т. . те, которые находятся на поверхности вируса), обладают иммуногенными вой твами, а внутренние домены

несущественны, если только они не влияют на конформациюиммуногенного

дом на. Если это редположение верно, то короткие пептиды.имитирующие

эпитопы (антигенные детерминанты), можно использовать для создания вакцин.

ÏолесÃÓ4. Пеп идные вакцины

Имея все это в виду, синтезировали химическими методами домены VP1 FMDV проверили возможность создания на их основе пептидных вакцин. Каждый из пептидов, соответствующих аминокислотным остаткам 141–160, 151–160 и 200–213 С-концевого участка VP1 и аминокислотным остаткам 9–24, 17–32 и 25–41 N-концевого участка, сшили по отдельности с инертным белкомпереносчиком (гемоцианином моллюска фиссурелии), чтобы предотвратить их разрушение, и ввели морским свинкам. Синтез антител в количестве, достаточном для защиты животного от последующих FMDV-инфекций наблюдался только при введении пептида 141-160. Введение же целого VP1 или пептидов 9-24, 17-32 и 25-41 индуцировало синтез антител в меньших

количествах.

Более длинный пептид, состоящий из аминокислотных остатков 141–158 и 200–213, которые были соединены двумя пролиновыми остатками,

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

когда он не был сшит с белком-носителем. Эта «двухпептидная» молекула оказалась эффективнее любого изолированного пептида и блокировала пролиферацию FMDV у крупного рогатого скота и морских свинок.

Эти результаты являются весьма многообещающими, однако количество (доза) пептидного материала, необходимого для индукции иммунного ответа, примерно в 1000 раз выше, чем в случае убитой FMDV-вакцины. Чтобы решить эту проблему, фрагмент ДНК, кодирующий пептид из аминокислотных остатков 142-160 VP1 FMDV, сшили с геном, кодирующим коровый белок гепатита В (HBcAg). При экспрессии этого химерного гена в Е. coliили

которых находился пептид из VP1 FMDV. Эти частицы обладали высокой иммуногенностью. Таким образом, HBcAg можно использовать в качестве

культуре животных клеток его продукты – белковые молекулы - в процессе самосборкиÐепозиторийобразовывали стабильные «27нм-частицы», на поверхности

эффективной молекулы-носителя с нтет ческих пептидов. Сравнение иммуногенности различных пептидных FMDV-вакцин, содержащих домен 142160 VP1-белка, проведенн е на мо ских свинках, показало, что

иммуногенность химерного белка, с ст ящего из HBcAg и указанного домена, в 10 раз ниже, чем у инак ивир ванных FMDV-частиц, в 35 раз выше, чем у

• КонформацияÏолесÃÓпептида должна быть такой же, как у эпитопа в интактной вирусной частице.

химерного белка, содержащего β-галактозидазуЕ. coliи домен 137-162 из VP1 FMDV, и в 500 раз выше, чем у свободного синтетического пептида, состоящего из аминок слотных остатков 142-160. Поскольку синтетический пептид, сшитый с HBcAg, образует 27нм-ча тицы, сходные с вирусом гепатита В, и они обладают п чти такой же иммуногенностью, как и интактный вирус,

на основе кот р го лучен синт тич кий пептид, этот подход может стать основным с особом доставки птидных вакцин к месту их действия.

И все же существует неско ько ограничений на использование коротких

пептидов в кач стве вакцин.

• Эпитоп, использующийся для создания эффективной пептидной вакцины,

должен представлять б й к роткий, но непрерывный участок белковой

молекулы, а это бывает не всегда.

• Изолированныйэпитоп может не обладать достаточной

иммуногенностью. В будущем синтетические пептидные вакцины могут стать высокоспецифичной, относительно недорогой, безопасной и эффективной альтернативой традиционным вакцинам, хотя для этого необходимо провести еще немало исследований.

5. Генная иммунизация

Новый подход, позволяющий индуцировать у организма иммунный ответ

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

гена, кодирующего белок-антиген. В первых экспериментах такого рода Е. coli- плазмиду, содержащую клонированный ген белка-антигена, транскрипция которого находилась под контролем промотора вируса животных, конъюгировали с микрочастицами золота и бомбардировали ими клетки уха мыши. Впоследствии выяснилось, что клонированную кДНК можно вводить в

клетки и с помощью внутримышечной инъекции раствора с большим количеством плазмиды, несущей соответствующую ДНК. Для этого необходимо в 103-104 раз больше ДНК, чем при бомбардировке микрочастицами. В одном из экспериментов более чем в 75% случаев ген

включался в клетки мыши, и синтезированный белок-антиген индуцировал синтезÐепозиторийантител. Этот подход позволяет избежать очистки антигена, что требует много времени и средств, или использован я для создания вакцины технологии

рекомбинантных ДНК. Кроме того, получаемые с его помощью белки с большей вероятностью подве гаются п ав льной посттрансляционной модификации, чем белки, синтези уемые о ганизмами-хозяевами. Этот метод, получивший название генн й иммунизации, можно использовать для

вакцинации домашних живо ных.

серий экспериментов мышам в квадрицепсы обеих задних конечностей вводили раствор с Е. соli-пла м дой, несущей кДНКнуклеопротеина вируса гриппа А, транскрипция которой наход лась под контролем промотора вируса саркомы Рауса или цит мегал вируса. Хотя уровень экспрессии гена нуклеопротеина был настолько низ к, что не поддавал я регистрации, через 2 нед после иммунизации в кр ви мышей обнаруживали ь антитела к нему. Выживаемость иммунизированных мышей оказа ась значительно выше, чем мышей из

контрольной гру ы. Более того, они были нечувствительны и к другому

штамму вируса гриппа. Такая перекрестная защита не вырабатывается при введении традиционных пр тив гриппозных вакцин, полученных на основе

поверхностных антиген в вируса, поэтому каждая вакцина специфична лишь

Перспективы геннойÏолесÃÓиммунизации были тщательно изучены. В одной из

к одному штамму вируса. Более того, традиционные вакцины сохраняют свою эффективность только до тех пор, пока остаются неизмененными поверхностные антигены. К сожалению, для генов поверхностных антигенов характерна высокая частота мутаций, что приводит к появлению существенно различающихся штаммов вируса. Коровые же белки, такие как нуклепротеин, относительно стабильны и активируют иммунную систему по другому механизму, чем поверхностные антигены.

ДНК-иммунизация позволяет не только избежать очистки белковых антигенов, но и индуцировать иммунный ответ, направленный именно на кодируемый плазмидой белок, а не на саму плазмиду. Поэтому один и тот же вектор можно использовать для доставки разных белков или для многократного введения одного и того же гена.

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

интегрировать в геном хозяина с весьма серьезными последствиями, если при этом затрагивается какой-то важный ген или происходит злокачественная трансформация клетки. Однако такое развитие событий считается крайне маловероятным. Скорее всего такая ДНК какое-то время просуществует в клетке в виде нереплицируюшегосявнехромосомного элемента, а затем разрушится. Генную иммунизацию пока используют для выработки иммунитета к некоторым патогенным микроорганизмам (вирусу гриппа А, вирусу иммунодефицита человека типа I, вирусу бычьего герпеса, вирусу бешенства, Plasmodiumsp., вызывающему малярию, вирусу гепатита В) у

животных, но не у человека.

лишьÐепозиторийпосле проведенияÏолесÃÓклинических испытаний. Огромным преимуществом этого подхода является в зм жн сть перорального введения вакцин.

Для облегчения доставки ДНК в клетки животных при проведении генной иммунизации был создан модифицированный штамм Shigellaflexneri. Эта бактерия проникает в эпителиальные клетки ж вотных путем фагоцитоза, и присутствующая в ней плазмидная ДНК попадает в цитоплазму клеткихозяина, где и происходят транск ипция и т ансляция переносимого ею гена, находящегося под контролем эука и тического промотора. Shigella – это

патогенный микроорганизм, и как ак вой он не может использоваться для

доставки ДНК. Ее непатогенный ш амм можно получить, введя делецию в ген asd, кодирующий фермент аспар ат-β-полу-альдегид – дегидрогеназу, который

диаминопимелин в й кислоты и их можно использовать для доставки плазмидной ДНК в эпителиальные кл тки животных, поскольку они в них не пролиферируют.

Экс ерименты, в которых в кач стве вектора для доставки ДНК в клетки

6. Аттенуированные вакцины

В некоторых случаях в качестве живых вакцин можно использовать

генетически модифицированные (рекомбинантные) микроорганизмы (бактерии или вирусы). Такие вакцины содержат либо непатогенные микроорганизмы, синтезирующие антигенные детерминанты определенного патогенного агента, либо штаммы патогенных микроорганизмов, у которых модифицированы или делетированы гены вирулентности. В этих случаях основные антигенные детерминанты являются составными компонентами бактерериальных или вирусных частиц и имеют такую же конформацию, какую они принимают в болезнетворном микроорганизме. Изолированным антиген часто утрачивает

исходную конформацию и вызывает лишь слабый иммунный ответ.

Полесскийгосударственныйуниверситет Страница 90

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

Иммунизация с помощью пептида, синтезированного исходя из данных о нуклеотидной последовательности РНК вируса ящура.

Начиная с первой вакцины, созданной Дженнером более 200 лет назад, большинство человеческих противовирусных вакцин содержали убитые или аттенуированные патогенные вирусы или сходные с ними непатогенные штаммы. Этот подход достаточно эффективен и предотвращает распространение ряда вирусных инфекций, однако его применение ограничено по ряду причин: не все вирусы могут расти в культуре, что не позволяет создавать вакцины против них; производство традиционных вакцин –

предприняты попытки создания более безопасных и эффективных и в то же время менее дорогих вакцин, не меющ х ограничений в применении. Введение вакцины индуцирует вы аботку антител к антигенным

детерминантам, в норме присутствующим на поверхности вирусной частицы, поэтому разумно было предп л жи ь, что аналогичный иммунный ответ могут вызвать короткие синте ические пептиды с такой же аминокислотной последовательностью, как у в русной антигенной детерминанты. Конечно, такой подход примен м л шь в том случае, когда антигенная область представляет собой коротк й, но непрерывный домен.

Проведя соответствующиеÏолесÃÓэксп рим нты, они пришли к выводу, что его антигенные детерминанты находятся на N- или С-конце белковой молекулы. Опр д лив их аминокислотные пос едовательности, они синтезировали серию пептидов, которые сшили бе ками-переносчиками и ввели кроликам. В ответ на иммунизацию С-к нцевыми пептидами VPI у кроликов и морских свинок вырабатывались антитела, защищающие их от инфекции интактным вирусом яшура. Эта работа показала, что для индукции синтеза антител, нейтрализующих интактные вирусные частицы, достаточно одного (или нескольких) домена (доменов) специфического вирусного белка, и, следовательно, можно создавать вакцины нового типа, не содержащие патогенных вирусов.

7.»Векторные» вакцины

Противовирусные вакцины.

В качестве эффективной живой противооспенной вакцины широко используют вирус коровьей оспы (ВКО), относящийся к роду поксвирусов. Геном этого вируса полностью секвенирован; он представляет собой

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

белков. ДНК ВКО реплицируется в цитоплазме инфицированных клеток, а не в ядре, благодаря наличию у вируса генов ДНК-полимеразы, РНК-полимеразы и ферментов, осуществляющих кэпирование, метилирование и полиаденилированиемРНК. Поэтому, если в геном ВКО встроить чужеродный ген, так чтобы он находился под контролем ВКО-промотора, то он будет экспрессироваться независимо от регуляторных и ферментных систем хозяина.

ВКО имеет широкий спектр хозяев (позвоночных и беспозвоночных), остается жизнеспособным в течение многих лет после лиофилизации (испарения воды с помощью замораживания) и не обладает онкогенными

свойствами, а потому может использоваться для создания так называемых векторных вакцин. С их помощью осуществляется доставка и экспрессия в организме-хозяине клонированных генов, код рующих антигенные белки, которые индуцируют выработку протект вных антител. Геном ВКО имеет большие размеры и не содержит ун кальных сайтов рестрикции, что не

антигенаÐепозиторий, и гомолÏолесÃÓгичными последовательностями вирусного генома происходит встраивание кл нир ванного гена в вирусную ДНК. Частота таких

позволяет встраивать в него дополнительные нуклеотидные

последовательности. Однако нужные гены можно вводить в геном ВКО с помощью гомологичной рекомбинации invivo следующим образом.

1. Сегмент ДНК, кодирующий пецифичный антиген (например, HBcAg), встраивают в плазмидный век ор непосредственно после клонированного ВКОпромотора, включенного в какой-либо несущественный ген ВКО, например ген

тимидинкиназы.

2. Этой пла мидой тран формируют культуру дефектных по

тимидинкиназе жив тных клеток, обычно фибробластов куриного эмбриона, предварительно инфицированных ВКО дикого типа, который синтезирует

рекомбинаций невысока, однако популяцию клеток, содержащих рекомбинантный ВКО, можно обогатить, спользуя селективную среду с бромдезоксиуридином. Этот токсичный аналог тимидина в отсутствие тимидинкиназы не включается в синтезируемую ДНК и не оказывает токсического действия. Дефектные по тимидинкиназе клетки-хозяева, которые содержат обычный ВКО, в присутствии бромдезоксиуридина погибают, а клетки, несущие рекомбинантный ВКО с разрывом в гене тимидинкиназы, становятся устойчивыми к его токсическому действию.

4. Проводят окончательный отбор с помощью ДНК-зонда, гибридизующегося с геном антигенного белка.

Поскольку дефектные по тимидинкиназе ВКО спонтанно возникают с относительно высокой частотой (примерно 1 на 103– 104 вирусных частиц),

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

нужным геном. Это облегчает разграничение спонтанных мутантов и мутантов, полученных с помощью гомологичной рекомбинации. В качестве селективного маркера обычно используют ген пео, кодирующий фермент неомицинфосфотрансферазуII и обеспечивающий устойчивость к аналогу канамицинаG418. Этот ген, в отличие от других селективных маркеров, остается стабильным при встраивании в геном ВКО.

Разработана специальная система, позволяющая избежать прерывания рамки считывания генов ВКО при встраивании чужеродного гена. При этом отпадает необходимость в использовании селективных маркеров, поскольку

отвечающий за образование бляшек при росте в руса в монослойной культуре животных клеток. Если заменить этот ген маркерным геном Е. coli, то образуется мутантный ВКО, кото ый не фо м рует бляшки при выращивании его в течение 2 – 3 сут в культуре животных клеток. Ген-мишень вводят в этот мутантный вирус с помощью г м л гичн й екомбинации его ДНК с вектором, несущим ген vp37 и ген-мишень. Мутантный ВКО, получивший ген vp37,

каждый образующий бляшку рекомбинантный вирус будет содержать и экспрессироватьÐепозиторийген-мишень. ДНК ВКО дикого типа несет ген vp37,

приобретает способностьÏолесÃÓк браз ванию бляшек, при этом в его геном

встраивается ген-мишень, а маркерный ген утрачивается. Мутантный вирус с делегированным геном vp37не может ревертировать к дикому типу, поэтому каждая вирусная част ца, образующая бляшку, содержит желаемую конструкцию. Эт т мет д прост, применим для переноса и экспрессии любого гена-мишени, не требует каких-либо дополнительных маркерных генов и не прерывает рамку считывания генов ВКО.

В геном ВКО уже уда ось встроить и экспрессировать в культуре

животных кл ток несколько генов антигенных белков: G-белка вируса

беш нства, пов рхностн го антигена гепатита В, поверхностных белков вируса Синдбис, NP- НА-белк в вируса гриппа, N- и G-белков вируса везикулярного

стоматита, гликопротеин в вируса простого герпеса. Некоторые из полученных на основе ВКО рекомбинантных векторов можно использовать для создания эффективных вакцин. Так, рекомбинантный ВКО, экспрессирующий ген гликопротеина D вируса простого герпеса типа 1, предотвращает герпесные инфекции у мышей, а рекомбинантный ВКО, экспрессирующий ген поверхностного антигена вируса бешенства, индуцирует выработку протективных антител у лис, основных переносчиков вируса бешенства в Европе.

Векторные ВКО-вакцины позволяют провести иммунизацию сразу от нескольких заболеваний. Для этого можно использовать рекомбинантный ВКО, который несет несколько генов, кодирующих разные антигены.

В зависимости от используемого ВКО-промотора чужеродный белок может синтезироваться в ранней или поздней фазе инфекционного цикла, при

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

высокого уровня экспрессии используют «поздние» ВКО-промоторы: pll (промотор гена, отвечающего за синтез белка мол.массой 11 кДа) или рСАЕ (промотор гена интегрального белка вируса коровьей оспы типа А). При встраивании в одну ДНК ВКО нескольких чужеродных генов каждый из них помещают под контроль отдельного ВКО-промотора, чтобы предотвратить гомологичную рекомбинацию между различными участками вирусной ДНК, которая может привести к утрате встроенных генов.

Живая рекомбинантная вирусная вакцина имеет ряд преимуществ перед неживыми вирусными и субъединичными вакцинами: 1) презентация

аутентичного антигена практически не отличается от таковой при обычной инфекции; 2) вирус может реплицироваться в клетке-хозяине и увеличивать

случаеÐепозиторийвозникших ÏолесÃÓвакцинации ос ожнений.

количество антигена, который актив рует продукцию антител В-клетками

(гуморальный иммунитет) и стимул рует выработку Т-клеток (клеточный иммунитет); 3) встраивание генов ант генных белков в один и большее число сайтов генома ВКО еще больше уменьшает его вирулентность.

Недостаток живой рекомбинантн й ви усной вакцины состоит в том, что при вакцинации лиц со сниженным иммунным статусом (например, больных

СПИДом) у них может разви ься яжелая вирусная инфекция. Чтобы решить

эту проблему, можно вс ро ь в вирусный вектор ген, кодирующий человеческий интерлейк н-2, который стимулирует Т-клеточный ответ и ограничивает пролиферац ю в руса.

чувствительный к интерферону вирус (ВКО дикого типа относительно устойчив к его действию), про иф рацию которого можно регулировать в

М ханизм устойчив сти ВКО к интерферону оставался неустановленным, пока не была обнаружена ткрытая рамка считывания K3L, кодирующая белок мол.массой 10,5 кДа. Эт т белок содержит аминокислотную последовательность, гомологичную N-концевой части эукариотического

фактора инициации elF-2α мол.массой 36,1 кДа. N-концевые области обоих белков содержат 87 практически идентичных аминокислотных остатков, причем в положении 51 в обоих случаях находится серии, который в elF-

2αфосфорилируется активируемой интерфероном Р1-киназой, что приводит к ингибированию синтеза белка в обработанных интерфероном клетках. КЗЬбелок действует как конкурентный ингибитор фосфорилированияelF-2альфа, обеспечивая устойчивость ВКО к интерферону, и если из генома ВКО удалить ген K3L или его часть, то вирус станет чувствительным к интерферону. С помощью ПЦР-мутагенеза гена K3L, находящегося в составе плазмиды, и последующей гомологичной рекомбинации между ДНК ВКО и плазмидой с

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

10—15 раз более чувствительным к интерферону, чем штамм дикого типа. Эта работа является важным этапом на пути создания более безопасных ВКОвекторов. Последовательности, сходные с K3L, могут содержать и другие устойчивые к интерферону вирусы, что позволит с помощью делеций создавать их штаммы, чувствительные к интерферону.

Большинство работ по созданию живых вирусных вакцин проводились на ВКО, однако в качестве кандидатов на роль векторов для вакцинации рассматриваются и другие вирусы: аденовирус, полиовирус и вирус ветряной оспы. Вектор на основе живого аттенуированногополиовируса (его

исследования только начинаются) привлекателен тем, что позволяет проводить пероральнуюÐепозиторийвакцинацию. Такие «слизистые» вакцины (вакцины, компоненты которых связываются с рецепторами, расположенными в легких или

желудочно-кишечном тракте) пригодны для профилактики самых разных заболеваний – холеры, брюшного тифа, г ппа, пневмонии, мононуклеоза, бешенства, СПИДа, болезни Лайма. Но до любых клинических испытаний любого на первый взгляд без бидн го вируса как системы доставки и экспрессии соответствующего гена не бходимо убедиться в том, что он действительно безопасенÏолесÃÓ. Например, п всеместно используемый ВКО вызывает у людей осложнения час ой примерно 3,0 – 10-6. Поэтому из генома рекомбинантного в руса, который предполагается использовать для вакцинации человека, желательно удалить последовательности, ответственные за вирулентн сть.

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

ТЕМА 14 НОВЫЕ И ВОЗНИКАЮЩИЕ ВИРУСНЫЕ ИНФЕКЦИИ

1.Прионы.

2.Механизмы прионного перехода.

3.Болезни вызываемые прионами.

4. Вироиды.

«конформационным» болезням. Болезни этого типа вызваны нарушением процессов формирования прост анственной структуры некоторых белков, приводящим к изменениям клеточной физиологии. Наряду с прионнымиболезнями к «к нф маци нным» также относят амилоидные заболевания, такие как болезни Альцгеймера, Хангтингтона и Паркинсона. При

накопление белковых агрега ов фибриллярной структуры, состоящих из растворимых в норме клеточных белков.

амилоидных и прионныхÏолесÃÓзаб леваниях происходит внеили внутриклеточное

Термин прион появ лся в конце XX века, однако прионные болезни,

например, скрэйпи вец, были изве тны уже в ередине XVIII века. Прионные

болезни – это губчатые энцефалопатии млекопитающих, такие как бычья

губчатая энцефал атия или коровье б шен тво,скрэйпи овец и некоторые нейродегенеративные заболевания ч ов ка – болезни Крейцфельда-Якоба и

Герстмана-Штраусслера-Шейнкера, семейная фатальная бессонница и куру. Все прионные заболевания на сег дняшний день являются смертельными. Они могут быть наследственными (примерно 15% случаев), приобретенными (< 1% случаев) и спорадическими (85% случаев), но независимо от этиологии заболевания оно может быть передано инфекционным путем.

Чандлером, заразившим лабораторных мышей болезнью овец – скрэйпи, позднее К. Гайдушеком, которому удалось передать шимпанзе заболевание человека – куру. Заражение прионами человека и животных обычно происходит при употреблении в пищу мяса и особенно мозга больного или ятрогенным путем, то есть через недостаточно стерилизованные нейрохирургические инструменты. Экспериментально заражение производится путем введения гомогената мозга больного животного здоровому – интраперитонеально или интрацеребрально.

Природа инфекционного агента, вызывающего прионные заболевания, долгое время оставалась неизвестной. В 1966 г. было обнаружено, что агент,

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

ионизирующей радиации и ультрафиолету. Это поставило под сомнение популярную в то время гипотезу о том, что скрэйпи вызывается вирусом.

В1967г. Д. Гриффит высказал предположение, что инфекционный агент не содержит генетического материала, а представляет собой измененную форму одного из клеточных белков, самоподдерживающуюся за счет автокаталитического механизма.

Вначале 80-х годов С. Прузинер с соавторами выделили и очистили агент, вызывающий скрэйпи, из мозга больных животных и описали его свойства. Выяснилось, что он устойчив к нагреванию, сохраняет активность

обнаружено, что данный инфекционный агент чувствителен к ионизирующей

после обработки протеиназой К, мочевиной, хаотропными солями, SDS и агентамиÐепозиторий, повреждающими ДНК – нуклеазами и псораленами. Было также

радиации в присутствии кислорода, есть проявляет свойства, характерные

для гидрофобных белков, связанных с л п дами. Агент, вызывающий скрэйпи, получил название «прион». Этот агент п едставляет собой белок, названный

PrP (Prion Protein).

На основании определения первичной структуры белка PrP был

идентифицирован кодирующийÏолесÃÓего ген, названный Prnp. Ген Prnp присутствует

в геноме всех млекоп тающ х, а акже у птиц и рыб. PrP является мембранным белком, который в основном экспрессируется в клетках центральной нервной системы и лимфорет кулярной ткани. Нормальная форма белка PrP обозначается PrPC. Патологическая форма этого белка, обуславливающая инфекционность, была названа PrPSc (форма PrP, связанная со scrapie). PrPSc неотличим от PrPC по аминокислотной по ледовательности, но имеет другую конформацию. Пространственная структура рекомбинантного PrPC впервые была опр д лена методом ядерного магнитного резонанса. Аминоконцевой район б лка PrPCв раств ре не структурирован,его карбоксиконцевая часть формирует глобулу и с ст ит из трехα-спиралей и короткого участка с β- структурой. Было обнаружено,что PrPC содержит 42% α-спиралей и 3% β- структур, тогда как PrPScсодержит 30% α-спиралей и 43% β-структур.

Вследствие этогопредположили, что приобретение инфекционных свойств белком PrPсвязано с конформационным переходом, при котором

происходитобразование β-складчатого слоя.

В отличие от нормальной формы PrP, его патологическая форма устойчива к протеиназе К. В результатеобработки PrPS c протеиназой К образуется протеазоустойчивый фрагмент с молекулярной массой 27–30 кДа (молекулярнаямасса PrP варьирует от 33 до 35 кДа в зависимости от степени гликозилирования). Выявление протеазоустойчивого фрагмента PrPScс молекулярной массой 27–30 кДа после обработки протеиназой К соскоба ткани миндалевидных желез до сих пор используется придиагностике прионных заболеваний.

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

С.Прузинер сформулировал прионную концепцию. Эта концепция подразумевала, что инфекционным агентом является белок PrPSc.Инфекционный агент PrPScможет реплицировать себя в отсутствие нуклеиновой кислоты (превращение белка из нормальной формы (PrPC) в инфекционную (PrPSc) происходит путем конформационного перехода). Конформационный переход PrPC в PrPSc может происходитьспонтанно, приводя к спорадическим формам прионных болезней. Он может быть вызван поступлением в организм патологической формы PrPSc извне (приобретенные формы прионных заболеваний). Наконец, переход может произойти из-за

мутацийÐепозиторийв гене Prnp, способствующих образованию PrPSc из PrPC (наследственные формы прионныхзаболеваний).

К настоящему времени концепц я пр онов получила убедительные экспериментальные подтверждения. Если размножение PrPSc после попадания в организм происходит путем наведения патолог ческой конформации на PrPC, то организмы, лишенные PrPC, должныбыть устойчивы к прионной инфекции.

Это и было показано с использ ванием т ансгенных мышей, гомозиготных по

делеции гена Prnp(Prnp0/0). Введение гомогената мозга мышей, больных

скрэйпи, трансгеннымÏолесÃÓмышам Prnp0/0 не приводило к развитию болезни ввиду

отсутствия нормального PrP C. Более того, оказалось, что в отсутствиеPrPC не происходит не только репл кац и приона, но и повреждения нервной ткани. PrPC также необходим для транспорта инфекционного агента периферическими

нервами к центральн й нервной системе.

Окончательн е д казательство концепции прионов долгое время

сдерживалось нев зм жностью получ ния значительного количеств аPrPres – формы PrPSc, образуемой in vitro, которая устойчива к частичному протеолизу и способна вызывать болезнь при введении экспериментальным животным. Недавно было показано, что фрагмент рекомбинантного PrP мыши с 89 по 231 а.к., экспрессированный в Escherichia coli, образует амилоидные фибриллы invitro, которые привведении трансгенным мышам, экспрессирующим этот же фрагмент PrP, приводят к развитию неврологической картины прионного заболевания.

Общим свойством аминокислотных последовательностей всех известных

к настоящему моменту прионных белков S. Cerevisiae является высокое

содержание аспарагиновых и глутаминовых остатков. Этим свойством также обладают амилоидогенные последовательности белков человека, таких как хантингтин и APP (Amyloidβ Precursor Protein). Было показано, что глутаминбогатые последовательности склонны формировать амилоидные фибриллы in vitro,что указывало на возможность предсказания прионных свойств белков на основе их обогащенностиглутаминовыми и аспарагиновымиаминокислотными остатками. В качестве критерия для идентификации таких белков использовалось наличие 30 остатков глутаминаили аспарагина на протяжении

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

встречаемостиглутамин-аспарагин-богатых последовательностей у разных видоворганизмов показал, что в геноме S. Cerevisiae 1,69 % ОРС (ОткрытыхРамок Считывания) кодирует такие белки (107 белков). У Drosophil amelanogaster было найдено 472 подобных белка, что соответствует3,47 % всех ОРС. Принимая во внимание распространенностьглутамин-аспарагин-богатых последовательностей, можно предполагать, что прионы не редки в природе. Однако необходимо отметить, что не все прионобразующие последовательности богаты аспарагиноми глутамином. Например, к ним не относятся прионные доменыбелков PrP и HET-s. Таким образом, пока не

существует надежногокритерия оценки способности полипептидных последовательностейк прионообразованию, что существенным образом затрудняет предсказание белков с прионными сво ствами.

(рисунокÐепозиторий14.1 А). ÏолесÃÓ

2.Механизмы п онного перехода

На сегодняшний день при нную гипотезу можно считать доказанной. Однако остается неясным механизм превращения PrPC→ PrPSc. Было предложено несколько моделей при нн го перехода. Согласно гетеродимерной

Рисунок 14. 1 – Модели прионного перехода. А – гетеродимерная модель. Б – два

варианта полимеризационной модели. Образование «ядра» PrPSc происходит

медленно, процесс полимеризации – быстро.

Полесскийгосударственныйуниверситет Страница 99

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

При этом спонтанный переход PrPC→ PrPSc маловероятен из-за высокого энергетического барьера. После осуществления перехода PrPC→ PrPSc образуются гомодимеры P rPSc/PrPSc, которые могут диссоциировать, запуская новые раунды конформационного превращения, или агрегировать. Наличие агрегированной формы белка не обязательно для прионного перехода и рассматривается как вторичное явление, не связанное с конформационной перестройкой как таковой. Существуют экспериментальные данные совместимые с этой моделью, но ее нельзя считать доказанной. Альтернативный механизм прионного перехода рассмотрен в

поддерживать только олигомер или мульт мер PrP. Стадией, лимитирующей скорость перехода PrPC→ PrPSc, является образование «ядра» – олигомера

PrPSc, являющегося интермедиатомп онного превращения (рисунок 14.1Б).

Эта модель допускает существование двух возможных вариантов механизма прионного перехода. Первый вариант п ионного превращения предполагает, что PrPC и PrPSc сосущес вуют в ерм динамическом равновесии, сдвинутом в

Стабилизация состоян я PrPSc происходит при присоединении мономера PrPSc к «ядру» PrPSc, в ре ультате чего мономер PrPSc оказывается в составе полимера PrPSc. Если мономер PrPSc не присоединяется к «ядру» PrPSc,

происходит братн превращение PrPSc→PrPC. Второй вариант

полимеризаци нн йм дели предполага т, что конформационная перестройка происходит не до, а в момент при о динения мономера PrPC к олигомеру

PrPSc. В ользу олимеризационной мод ли свидетельствуют эксперименты,

показавшие, что конвертирующая активность связана именно с полимерами

PrPSc.

полимеризационной модели, согласно которой прионное превращение неотделимоÐепозиторийот агрегации, так как прионнуюконформацию может стабильно

сторону PrPC, и PrPScÏолесÃÓобразуе ся до присоединения мономера PrP к «ядру».

Позднее была предл жена модель прионного перехода, представляющая

собой второй вариант лимеризационной модели с дополнительными

допущениями. Было показано существование интермедиатовприонного превращения – олигомерных комплексов, менее структурированных, чем прионные фибриллы и напоминающихмицеллы. Для того, чтобы такой олигомерный комплекс мог катализировать прионный переход, он должен сформировать стабильное «ядро», обладающее прионнойконформацией. Конформационному превращению может подвергаться как мономер, так и олигомерный комплекс при присоединении к стабильному «ядру», служащему «матрицей» для образования прионнойконформации.

3.Болезни вызываемые прионами

К настоящему времени у людей описаны четыре прионовые болезни:

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

Шейнкера и смертельная семейная бессонница. Два последних заболеваниявстречаются редко. Распространенность остальныхприоновых заболеваний человека весьма различна в зависимости от конкретного вида патологиии исследуемого региона. Почти во всех регионахвстречается болезнь Крейтцфельда – Якоба с частотой 0,3–1 случай на 1 000 000 населения в год. Соотношение между заболеваемостью мужчин иженщин составляет 1,5 : 1. В нескольких регионахмира заболеваемость оказывается значительно выше: Словакия, Израиль и Чили. Семейнаяболезнь Крейтцфельда – Якоба, синдром Герстманна – Штреусслера – Шейнкера и фатальнаясемейная инсомния

относятся к доминантно наследуемым прионным заболеваниям, связаннымис некоторыми мутациями прионного гена.

Болезнь Крейтцфельда – Якоба (класс чески вариант) была впервые описана в 1920 г. независимо друг от друга Кре тцфельдом и Якобом. Инфекционные прионы, при данной болезни, могут возникать в мозге

ВероятнееÐепозивсего, людиÏолесÃÓзаразилисьторийот мясных продуктов, содержащихприоны животных с «коровьим бешенством»

спонтанно (после 50 лет).

Вначалезаболевание пр является в форме кратких потерь памяти, изменениями настроения, п ерейинтереса к происходящему вокруг. Постепеннобольной станови ся бесп м щным. В конечнойфазе наступает расстройство зрения, галлюц нации и расстройство речи. В заключении болезньпроявляется в форме быстропрогрессирующегослабоумия, иногда сопровождаемого ритм ческ ми судорогами, подергиванием мышц. При наследственн й ф рме признаки и ход болезни подобны таковым при

зараж ния (так называемыйновый вариант болезни). Смерть от нового вариантабол зни Крейтцфе ьда – Якоба впервые зарегистрирована в 1995 г. в Великобритании. В 1996 г. была достоверно доказана связь между эпизоотией

крупного рогатого скота эпидемией болезниКрейтцфельда – Якоба у людей.

4. Вироиды

Более 16 болезней растений вызваны особой группой инфекционных агентов, названных вироидами. Они представляют собой кольцевые однонитчатые молекулы РНК, содержащие от 250 до 370 нуклеотидов. Вироиды передаются от растения к растению механическим путем или с пыльцой. После инфицирования вироиды обнаруживают главным образом внутри ядра пораженной клетки в количестве от 200 от 10 000 копий нуклеиновой кислоты. Известно, что молекулы нуклеиновой кислоты вироида

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

невыясненным механизм появления симптомов у пораженных растений. Иногда вироиды вызывают латентные инфекции растений. Хотя вироидная РНК может быть реплицирована РНК-зависимойРНК-полимеразой, репликация РНК вироида идет при участии клеточного фермента, воспринимающего РНК как нить клеточной ДНК.Наиболее изученными являются вироиды, вызывающие болезни картофеля. Они содержат кольцевую РНК, содержащую 359 нуклеотидов и упакованную в виде короткой палочки за счет объединения комплементарных пар нуклеотидов внутри нуклеиновой кислоты. Выделено несколько штаммов, отличающихся по вирулентности. Как было установлено,

это обусловлено изменением нуклеотидной последовательности в двух короткихÐепозиторийучастках РНК вироида.

По вторичной структуре РНК в ро даверетеновидности клубней

картофеля (ВВКК) представляет собой двусп ральные участки, разделенные короткими внутренними одноцепочечными петлями (рис. 1), и формирует палочковидные частицы. Предложенная модель была распространена на всех представителей семейства Pospiviroidae. У вироидов семейства Avsunviroidae вторичная структура несколько иная. РНК вироида солнечного ожога авокадо

структуру с двумя терм нальными шпильками в левой части молекулы , вироидовхлоротической крапчатости хризантем латентной мозаики персика – сложную разветвленную структуру (рисунок 14. 2).

(типичного представителяÏолесÃÓэ го семейства) образует квазипалочковидную

Рисунок 14. 2 – Схема разных типов вторичной структуры вироидов: А – палочковидная (вироидверетеновидности клубней картофеля), В –

квазипалочковидная (вироид солнечного ожога авокадо), С – разветвленная (вироид латентной мозаики персика).

На основании секвенирования РНК вироидов группы ВВКК предположили, что РНК ВВКК имеет пять структурных доменов (рис. 14.2, А). Эта модель также была распространена на все вироиды семейства Pospiviroidae. В центральном домене (С) находится центральная консервативная область (ЦКО), которая образована «выпуклыми» консервативными последовательностями нуклеотидов CC CCGG и GGUGGCC, расположенными

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

репликации вироидов. Консервативная последовательность на верхней цепи фланкирована инвертированными повторами, которые могут образовывать петли (русунок 14. 3, Б).

ÐепозиторийРисунок 14. 3 Модель доменной структуры РНК вироидаверетеновидности

картофеля (А) и инвертированных повто ов (указаны стрелками), способных образовывать петли (Б): T1, P, C, V и T2 – соответственно левый терминальный,

патогенный, центральный, вариабельный и п авый терминальный домены; a и b – сегменты домена T1, фланкирующие бменный участок РНК (ограничен прерывистой

Домен патогенности (Р) обусловливает проявление симптомов заболевания и содерж т последовательность (А)5-6, присутствующую в РНК всех вироид в семейства Pospiviroidae. Домен V даже у близкородственных вироидов характеризуется большой вариабельностью нуклеотидной последовательн сти, что, возможно, влия т на патогенность. При совместном пораж нии растений вироиды могут обмениваться двумя терминальными дом нами (Т1 и Т2), и этот процесс может влиять на эволюцию вироидов. Кроме того, домены Т1 и Т2 необходимы для транспорта вироидов по растению. Вироиды семейства Avsunviroidae не имеют ЦКО, но содержат последовательности, участвующие в создании рибозимных структур в форме головки молотка (hammerhead), необходимых для саморасщепления цепей РНК.

линией); (А)5-6 – последовательнос ь, присутствующая в РНК всех вироидов семейства Pospiviroidae; RÏолесÃÓи Y – коро кие олигопурин-олигопиримидиновые спирали.

Вироиды из семейств Avsunviroidae Pospiviroidae реплицируются в

разных клеточных органеллах. Следует отметить, что геномы всех вироидов не кодируют собственных белков, поэтому для репликации используют белки растения-хозяина. Предполагается, что репродукция вироидов происходит по механизму катящегося кольца (a rollingcirclemechanism).

РНК вироидов семейства Avsunviroidae реплицируются в хлоропластах по симметричному варианту механизма катящегося кольца. Было установлено, что в РНК вироида солнечного ожога авокадо сайтами инициации репликации служат нуклеотиды U121 и U119 соответственно в плюс- и минус-цепях. Последовательности, окружающие эти сайты инициации, похожи на промоторы хлоропластной РНК-полимеразы, кодируемой в ядре. Возможно, что этот

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

минус-цепь РНК на матрице – кольцевой РНК вироида. Эта минус-цепь саморасщепляется на фрагменты, соответствующие длине генома вироида, благодаря рибозимной активности структур в форме головки молотка. Расщепление происходит в результате взаимодействия в сайте расщепления 2'- гидроксила с нуклеотидным фосфатом, и образовавшиеся фрагменты содержат 2',3'-циклический фосфат и 5'-гидроксил. Саморасщеплению способствуют два хлоропластных белка PARBP33 и PARBP35, имеющие РНК-связывающие домены. Расщепленные фрагменты сшиваются самопроизвольно или при участии хозяйской РНК-лигазы в минус-кольца. Они служат матрицей для

образования длинных линейных мультимерных плюс-цепей, которые саморасщепляются на фрагменты, образующие плюс-кольцевые РНК.

фрагментыÐепозиторий, соответствующиеÏолесÃÓразмеру вироида. Эти фрагменты сшиваются с низкой скоростью авт каталитически или очень быстро растительной РНК-

Репликация вироидов семейства Pospiviroidae осуществляется в ядрах

и(или) ядрышках растительных клеток. Было показано, что минус-цепи РНК ВВКК локализованы в нуклеоплазме, тогда как плюс-цепи выявляются в нуклеоплазме и ядрышке. По мнению авто ов, синтез минус- и плюс-цепей РНК происходит в нуклеоплазме, затем плюс-цепи транспортируются в ядрышко. Однако возможно, ч длинные линейные мультимерные плюс-цепи РНК переносятся в ядрышко и ам расщепляются на фрагменты, которые потом превращаются в кольцевые молекулы. Репликация РНК вироидов семейства Pospiviroidae происход т по ас мметричному варианту механизма катящегося кольца. Кольцевая молекула РНК вироида служит матрицей для образования

длинной линейн мультимерной минус-цепи. В опытах invitro с ВВКК было

установлено, что сайтами инициации транскрипции при этом служат нуклеотиды А111 (д мен С) и А325 (дом н Т1). Затем на линейной минус-цепи синтезируется линейная му ьтим рная плюс-цепь. Обе реакции транскрипции

лигазой с образованием кольцевых молекул РНК.

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

Основная литература

1.Барышников, П. И. Ветеринарная вирусология [Текст] : учебное пособие для студентов высших учебных заведений, обучающихся по специальности 111201 - "Ветеринария" / П. И. Барышников. - М. : ФОРУМ, 2007. - 96 с.

2.Вопросы общей вирусологии [Текст] : учебное пособие / ред. О. И. Киселев. - СПб. : СПбГМА им. И.И. Мечникова, 2007. - 374 с.

3.Горячкина, Н. С. Общая медицинская вирусология [Текст] / Н. С.

Горячкина. - Ростов н/Д : Феникс, 2007.

Ðепозиторий10. ПавловичÏолесÃÓ, С. А. Основы вирусологии [Текст] : допущено Министерством образования Республики Беларусь в качестве учебного пособия

4. Дромашко, С. Е. Генетика и вирусология в современной медицине

[Текст] : учебно-методическое пособие / С. Е. Дромашко ; ГУО "Институт подготовки научных кадров Национальной академ и наук Беларуси". - Минск : Институт подготовки научных кад ов НАН Беларуси", 2008. - 53 с.

5. Зинченко А. И. Основы молекулярной биологии вирусов и

антивирусной терапии/ А. И. Зинченко, Д. А. Паруль. Минск: «Вышейшая школа», 2005.

6. Зинченко, А. И. Осн вы молекулярной биологии вирусов и антивирусной терап [Текст] : допущено Министерством образования

Республики Беларусь в качестве учебного пособия для студентов вузов / А. И. Зинченко, Д. А. Паруль. - М нск : Вышэйшая школа, 2005. - 214 с.

7. Луговцев В.Ю. Классификация номенклатура вирусов позвоночных / В.Ю. Луговцев, Д.А. Васильев. Ульянов к. 2002.

8. Медицинская вирусология [Т к т] : учебное пособие / Военномедицинская академия. - СПб. : ЭЛБИ-СПб, 2002. - 163 с.

9. М дицинская микробио огия / под ред. В. И. Покровского, О. К. Позд ва.- Гэотар Медицина. С. 657-848 (Общая вирусология. Частная

для студентов биологических специальностей высших учебных заведений / С. А. Павлович. - Минск : Вышэйшая школа, 2001. - 192 с. : ил.

11. Прозоркина, Н. В. Основы микробиологии, вирусологии и иммунологии [Текст] : учебное пособие / Н. В. Пильщикова. - Ростов н/Д :

Феникс, 2007. - 378 с.

12. Прозоркина, Н. В. Основы микробиологии, вирусологии иммунологии. [Текст] : учебное пособие / Н. В. Прозоркина. - 2-е изд., допол. и перераб. - Ростов н/Д : Феникс, 2006. - 384 с.

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

13.Атлас по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии [Текст] : учебное пособие / ред. А. С. Быков. - 2-е издание, дополненное и переработанное. - М. : Медицинское информационное агентство, 2008. - 272 с.

14.Болгова, В. Осторожно: грипп [Текст] / В. Болгова, И. В. Болгова, Н. В. Гладик // БИОЛОГИЯ - ПЕРВОЕ СЕНТЯБРЯ : Учебно-методическая и научно-популярная газета для преподавателей биологии, экологии и естествознания. - 2011. - N 16. - С. 4-12.

15.Бондаренко, Т. Ю. Вирус гепатита А: структурно-функциональная

ГЕНЕТИКА МИКРОБИОЛОГИЯ И ВИРУСОЛОГИЯ : Научно-теоретический журнал. - 2013. - N 3. - С. 12-21 .

организация генома, молекулярная диагностика и культивирование [Текст] / Т. ЮÐепозиторий. Бондаренко, В. А. Терновой, С. В. Нетесов // МОЛЕКУЛЯРНАЯ

16. Германенко, И. Г. Herpes simplex "новые" герпес-вирусы в патологии

человека [Текст] : учебно-методическое пособие / И. Г. Германенко, А. П.

Кудин ; Министерство здрав х анения Республики Беларусь, Белорусский

государственный медицинский университет, Кафедра детских инфекционных

болезней. - Минск : БГМУÏолесÃÓ, 2009. - 48 с.

17. Данилов, Д. Е. Что нужно знать Вашим пациентам о вирусном гепатите С [Текст] : информац я для специалистов здравоохранения / Д. Е. Данилов. -

Минск : [б. и.], 2012. - 35 .

18. Молекулярные основы вакцинопрофилактики чумы [Текст] / С. В. Дентовская [и др.] // МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА МИКРОБИОЛОГИЯ И

ВИРУСОЛОГИЯ : Научно-теор тич кий журнал. - 2013. - N 3 .

19. Рекомендации по испо ьзованию пробиотика "Биофлор" для

промышл нного тицеводства [Текст] : нормативное производственно-

практич ское издание / М. А. Г аскович [и др.] ; Министерство сельского хозяйства продовольствия Республики Беларусь, УО "Витебская ордена "Знак почета" государственная академия ветеринарной медицины", Кафедра микробиологии вирусологии. - Витебск : ВГАВМ, 2009. - 23 с.

20. Семенюга, Т. Вирусы-убийцы [Текст] / Т. Семенюга // ПЛАНЕТА :

общественно-политический журнал. - 2012. - N 5. - С. 28-35

21. Семижон, П. А. Молекулярно-биологическая характеристика COREгена и кодируемого им белка вируса гепатита C: использование в лабораторной диагностике [Текст] : автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.06-вирусология / П. А. Семижон ; Государственное учреждение "Республиканский научнопрактический центр эпидемиологии и микробиологии" Министерства здравоохранения Республики Беларусь. - Минск : Республиканский научно-

практический центр эпидемиологии и микробиологии, 2010. - 22 с.

Полесскийгосударственныйуниверситет Страница 106

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

22. Ясинская, Л. И. Клинико-лабораторная диагностика энтеровирусных энцефалитов [Текст] / Л. И. Ясинская, А. А. Астапов, Н. В. Голобородько // ЗДРАВООХРАНЕНИЕ : Научно-практический ежемесячный журнал. - 2010.

Проблематичность разграничения видов. Состояния умеренного бактериофага, их характеристика.

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

24.Эволюция вирусов. Молекулярные механизмы изменчивости вирусов. Рекомбинация. Реассортация. Мутации. Типы вирусных мутантов.

25.Виды вирусных инфекций. Латентные вирусные инфекции.

26.Субъединичные вакцины. Противогерпетические вакцины. Противоящурные вакцины. Пептидные вакцины. Генная иммунизация. Аттенуированные вакцины. «Векторные вакцины».

27.Прионы. Природа инфекционного агента прионных заболеваний.

28.Прионная концепция. Конформационный переход и его механизмы. Болезни, вызываемые прионами. Вироиды.

29.Характеристика семейства вирусов оспы.

30.ÐепозиторийХарактеристика семейства вирусов Герпеса.

31.Характеристика семейства вирусов Герпеса.

32.Характеристика семейства вирусов Аденов русов.

33.Характеристика семейства ви усов Па вов русов.

34.Характеристика семейства ви усов Рет овирусов.

35.Характеристика семейства ви ус в О томиксовирусов.

36.Характеристика семейс ва вирус в Бирнавирусов.

37.ХарактеристикаÏолесÃÓсемейс ва вирус в Парамиксовирусов.

38.Характеристика семейс ва вирусов Рабдовирусов.

39.Характеристика семейства вирусов Пикорнавирусов.

40.Характеристика семейства вирусов Калицивирусов.

41.Характеристика семейства виру ов Коронавирусов.

42.Характеристика семейства виру ов Флавивирусов.

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

УТВЕРЖДАЮ

Проректор по учебной работе УО ”Полесский государственный университет“

_________________ О.А. Золотарева

2019 г.

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

Учебная программа составлена на основе ОСВО 1-31 80 12-2015 утвержденного

(название образовательного стандарта,

Министерством образования Республики Беларусь по специальности

(образовательных стандартов), типовой учебной программы, дата утверждения, регистрационный номер

Биология и учебного плана УВО №

СОСТАВИТЕЛИÐепозитор: ий

Д. Д. Жерносеков, доцент кафедры биотехнологии Учреждения образования

(И.О. Фамилия, должность, ученая степень, ученое звание)

государственный университет“ А.Д. Кульгавеня, преподаватель-стажер кафед ы биотехнологии Учреждения образования

”Полесский государственный университет“