Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

ТЕМА 4 КЛАССИФИКАЦИЯ ВИРУСОВ

1. Классификация по Балтимору.

2. Характеристика классов ДНК- и РНК-вирусов.

3. Вирусы, содержащие двухцепочечную ДНК (класс I). 4. Вирусы, содержащие одноцепочечную ДНК (класс II). 5. Вирусы, содержащие двухцепочечную РНК (класс III). 6. Вирусы, содержащие плюс-РНК цепь (класс IV).

7. Вирусы, содержащие «минус»- цепь РНК (класс V). 8. Ретровирусы (класс VI).

1. Классификац я по Балт мору

Лауреат Нобелевской премии биолог Дейвид Балтимор разработал классификацию вирусов. Классификация ICTV в настоящее время объединяется с классификацией по Балтимору, составляя современную систему классификации вирусов.

Классификация в русов по Балтимору основывается на механизме образования мРНК. В русы должны синтезировать мРНК из собственных геномов для бра вания белков и репликации своей нуклеиновой кислоты, однако кажд е семейство вирусов им т об твенный механизм осуществления этого. Вирусные ген мы могут быть одноцепоченые (оц) или двухцепочечные (дц), ДНКили РНК-содержащие, могут использовать или не использовать

полярности.

•Вирусы, содержащие двуцепочечную РНК (например, ротавирусы).

•Вирусы, содержащие одноцепочечную молекулу РНК положительной полярности (например, пикорнавирусы, флавивирусы).

•Вирусы, содержащие одноцепочечную молекулу РНК негативной или двойной полярности (например, ортомиксовирусы, филовирусы).

•Вирусы, содержащие одноцепочечную положительную молекулу РНК и имеющие в своем жизненном цикле стадию синтеза ДНК на матрице РНК,

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

• Вирусы, содержащие двуцепочечную ДНК и имеющие в своём жизненном цикле стадию синтеза ДНК на матрице РНК, ретроидные вирусы (например, вирус гепатита B).

Дальнейшее деление производится на основе таких признаков как структура генома (наличие сегментов, кольцевая или линейная молекула), генетическое сходство с другими вирусами, наличие липидной оболочки, таксономическая принадлежность организма-хозяина и так далее.

2. Характеристика классов ДНК- и РНК-вирусов

ÐепозиторийВирусы подразделяются на 6 классов по строению нуклеиновой кислоты:

Класс I – вирусы, содержащие двух цепочечную ДНК.

Класс II – вирусы, содержащие одно цепочечную ДНК.

Класс III – вирусы, содержащие двух цепочечную РНК. Класс IV – вирусы, содержащие «плюс»-цепи РНК. Класс V – вирусы, содержащие «минус»-цепи РНК.

Класс VI – вирусыÏолесÃÓ, содержащие братную транскриптазу(ретровирусы).

3. Вирусы, содержащие двухцепочечную ДНК (класс I)

Герпесвирусы. Семейство Herpesviridae.

Двухнитевая ДНК, икосаэдральный нуклеокапсид, волокнистаяоболочка.

Значительная часть герпесвирусов по обны вызывать острые илатентные инфекции, а также обладает онког нным потенциалом.

Herpes labialis. Вызывает первичный герпетический гингивостоматит. Вирус Эпшт йна-Барр вызывает инфекционный мононуклеоз – остроеинфекционное заб левание, поражающее лимфоидную ткань

всегоорганизма. Этот вирус п стоянно выделяют из клеток двух видов опухолейчеловека – лимфомы Беркитта карциномы носоглотки.Генитальный герпес. Ветряная оспа, опоясывающий лишай.

Паповавирусы. Семейство Papovaviridae.

Икосаэдральный капсид, без оболочки, ДНК циклическая, замкнутая, двухнитевая. Средний размер около 45 нм.Свое наименование паповавирусы группа получила от названий трехвирусов: вируса папилломы, вируса полиомы

ивакуолизирующегообезьяньего вируса, тип 40 (SV40). Вызывают папилломы

иполиомы умлекопитающих и человека. SV40 иногда заражает клетки человека.

Папилломавирусы (род Papillomavirus) вызывают поражения кожныхпокровов и слизистых оболочек. Возбудитель передается при контакте черезмикротравмы на коже. Вирус бородавок человека, как и вирусы

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

эпидермиса.

Полиомавирусы (род Polyomavirus) включают группу вирусов,патогенных для животных и человека. Инфицируют почки и головной мозг.

SV40 – обезьяний вирус – вызывает нефриты.

Аденовирусы. Семейство Adenoviridae.

Впервые выделены Роу в 1953 г. из тканей миндалин и аденоидов удетей. Икосаэдральный голый капсид, ДНК линейная, двухнитевая. Среднийразмер вириона 60-90 нм. Наиболее часто вызывают ОРВИ, протекающие по

распространены.Основные пути передачи – воздушно-капельный и контактный.

типугриппоподобных поражений; конъюнктивиты, гастроэнтериты. АденовирусныеÐепозиторийинфекции человека достаточно широко

Поксвирусы. Семейство Poxviridae.

Объединяет крупные и сложные вирусы, разделяемые на подсемейства:Chordopoxvirus (ви усы оспы позвоночных) и Entomopoxvirus

(вирусы оспынасекомых). Ген м – двухнитевая ДНК. Оболочки нет. Частицы

внутреннеготельца, содержащего ДНК, двойного слоя, содержащего белок, эллиптических белковых телец и наружной мембраны. Частицу

вирусовнатуральной оспы (variola) и коровьей оспы (vaccinia) имеют видокругленных блоковÏолесÃÓ250-390 × 200-260 нм. Они состоят из

обвиваютплотно прилегающ к ней нити. Эти вирусные частицы очень

устойчивы к высыханию и поэтомучрезвычайно инфекционны.

Все стадии размн жения пок виру ов происходят только в цитоплазме. Молекулярный вес ДНК таких виру ов больше, чем у любого другого

вирусаживотных, репродукция данного вируса связана с инициацией

активностисамых разнообразных ферментов.Наиболее важным для человека

явля тся вирус натуральн й спы,который вызывает одно из древнейших

инфекционных заболеваний. Всепоксвирусы имеют общий антиген, поэтому людей вакцинируют вирус м, п лученным от коров, который у людей вызывает весьма слабые симптомы болезни.

Гепаднавирусы. Семейство Hepadnaviridae.

В семейство включены икосаэдральные вирусы с оболочкой, ДНК –

неполная (с разрывом одной цепи) двухнитевая, кольцевая. Типовой род Hepadnavirus, включает возбудителя гепатита В человека.Орган-мишень инфекции – печень, доминирующий симптом – желтуха. Болезнь может протекать в осложненной и хронической форме. Вызываетосложнения – цирроз печени.

Вирус гепатита В – основная причина одной из самыхраспространенных формы рака – первичного рака печени. Особенностьвируса гепатита В состоит в том, что сам по себе он не убивает клеткипечени. Заболевание является следствием иммунной атаки организма насобственные клетки печени.

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

(от матери к плоду), а также бытовые контакты с больным илихроническим носителем инфекции. Для детей гепатит В представляетособенную опасность, так как будучи перенесенным в раннем возрасте, он в50–95% случаев переходит в хроническую форму.

4. Вирусы, содержащие одноцепочечную ДНК (класс II)

Парвовирусы. Семейство Parvoviridae.

Мелкие вирусы, без оболочки. Икосаэдральный капсид, ДНКоднонитевая.

Диаметр около 20 нм. Геном представлен одноцепочечной ДНКс молекулярнымÐепозиторийвесом всего 1,5×106 дальтон. Размножение, по-видимому,

полностью зависит от соответствующ х с стем клетки-хозяина. Существует два основных класса парвовирусов – автономные идефектные. Все до сих пор известные автономные парвовирусы – это в усыгрызунов; для транскрипции, репликации 0 Tw 3.и других функций эти ви усыиспользуют соответствующие ферменты клетки-хозяина. Дефектныепа вовирусы – «аденоассоциированные»

– размножаются лишь в кле ках, которые заражены одновременно аденовирусом вирусами. Парв вирусы вызывают аномалии развития у эмбрионов и дефектырастущ х каней у новорожденных. Они вызывают также нарушенияфункции к шечн ка. К парвовирусам относится возбудитель инфекционной эритемы.

капсидикосаэдрическийÏолесÃÓ. Геном фрагментарный, образован двухнитевой РНК,состоящей из 10-11 тдельных сегментов. Патогенны для позвоночных,

5. Вирусы, с держащие двухц почечную РНК (класс III)

Вирусы данного класса бы и обнаружены у плесеней, высшийрастений,

насекомых озвоночных животных. Ни один из этих вирусов несодержит

липидов. Их капсиды с ст ят из двух слоев – внутреннего (сердцевины) и

наружного, образующего б л чку вокруг сердцевины. В

сердцевине находится мн жество сегментов двухцепочечной РНК.

Реовирусы. Семейство Reoviridae.

Семейство объединяет голые вирусы 78-80 нм в диаметре;

насекомых и растений. Вызываютреспираторные инфекции, инфекции ЖКТ, клещевую лихорадку.

икосаэдральнойсимметрией. Средний размер частиц 22-30 нм.Включает вирус

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

Риновирусы – возбудители ОРВИ или «простудныевирусы». Вирусы ящура, вызывающие тяжелые эпидемии скота.

Вирусный гепатит А – инфекционное заболевание, проявляющегосяжелтухой, которая вызвана вирусным поражением печени. Передается фекально-оральным путем, с загрязненной водой и продуктами.Источниками инфекции являются заболевшие люди. Возбудитель былоткрыт в 1973 г. Отличается высокой устойчивостью к факторам внешнейсреды и дезинфекционным средствам. После перенесения вирусного гепатитаА развивается пожизненный иммунитет. Существует вакцина.

Тогавирусы. Семейство Togaviridae.

Средняя величина 45-75 нм.Вызывают арбов русные инфекции – обязательно наличиечленистоногого переносчика (комары, клещи). Для сохранения популяциинаибольшее значение имеют позвоночные (птицы, млекопитающие). Серологически тогавирусы делятся на две г уппы (А и В), которые внастоящее время называются альфавирусами и флавивирусамисоответственно. Альфавирусы – вирусы энцефали а л шадей.

Включает роды Rubivirus – вирус краснухи, Hepacivirus – вирусыгепатита С, G и флавивирусов. В последний входит 63 вируса, разделяемыхна 4 антигенные группы: клещевого энцефалита (переносчик – клещи родаIxodes), японского энцефалита, желтой лихорадки и др.40 % гепатитов, возникающих при переливании д н рской крови, обу ловлены вирусом гепатита С. У 5-20 % носителей в течение 5-7 летразвива т я цирроз печени, переходящий в рак печени. Вирус отличаетсявысокой скоростью мутации. Быстро меняющееся “антиг нное лицо” антите а не узнают и не могут уничтожить вирус. Часто

приводит кхроническому н сите ьству. Вакцины не существует.

ÐепозиторийСферические оболочечные вирусы с икосаэдральным нуклеокапсидом.

Коронавирусы. Семейство Coronaviridae.

ФлавивирусыÏолесÃÓ. Семейс во Flaviviridae.

Объединяет б л чечные вирусы, круглой или овальной формы,

диаметром 50-220 нм. Нуклеокапсид спиральный; геном образует (+)РНК. Для

человека патогенны кишечные респираторные коронавирусы.Тяжёлый

острый респираторный синдром (ТОРС), более известен какатипичная пневмония или SARS. Первый случай этого заболевания был зафиксирован в ноябре 2002 г. в китайской провинции Гуандун. Уровеньсмертности от ТОРС – около 10 %.

Калицивирусы. Семейство Caliciviridae.

Семейство объединяет вирусы с голым икосаэдральным капсидом.В состав семейства входят вирусы насекомых, рыб, земноводных, птици млекопитающих. К семейству калицивирусов некоторое время относили ивирус гепатита Е, однако сейчас данное таксономическое положение этоговируса оспаривается. Калицивирусная инфекция кошек, или калицивироз – очень

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

преимущественнымпоражением респираторных органов и ротовой полости.

7. Вирусы, содержащие «минус»- цепь РНК (класс V)

Ортомиксовирусы. Семейство Orthomyxoviridae.

Оболочечные вирусы, средний размер вирионов – 80-120 нм. Типсимметрии – спиральный. Геном сегментированный, состоящий из рядаотдельных минус-цепей РНК.

частоприобретающими характер эпидемий. Наибольшую опасность представляютвирусы гриппа А.

Род Influenzavirus включает два вида – вирусы гриппа А и В. ОбасчитаютсяÐепозиторийвысококонтагиозными возбудителями ОРВИ,

Парамиксовирусы. Семейство Paramyxoviridae.Оболочечные вирусы со спиральной симметрией. Геном – линейнаяоднонитевая РНК цепь. Средний размер вириона 100-800 нм. Включает возбудителей эпидемического паротита

(свинка),парагриппа, вирусы к ри (слайд 10.26).

Рабдовирусы. Семейс во Rhabdoviridae.

Форма капсидаÏолесÃÓпулевидная, имеется оболочка, спиральный типсимметрии. Средн размеры вириона 180×75 нм. Включает более 60

вирусов, инфицирующ х млекопитающих, рыб, насекомых и растения. Для человека наибольшую опасность представляетвирус бешенства – острая инфекция ЦНС, с пр вождающая я дегенерацией нейронов головного и спинного мозга; летальность 100 %.Вирус везикулярного стоматита (ВВС) патогенен для кру н г рогатого скота. Возбудители ВВС размножаются в

организме комаров,которые яв яются п р носчиками.

Буньявирусы. Семейство Bunyaviridae.

Счита тся крупнейшим по количеству входящих в него вирусов

(около250). Большинство членов семейства – арбовирусы, а также природноочаговые. Симметрия спиральная. Все сферические, оболочечные с тремянуклеокапсидами, каждый из которых содержит три отдельных сегментаРНК. В состав большинства входит РНК-зависимая РНК-полимераза.

Круг позвоночных хозяев: грызуны, птицы, жвачные. Переносчикивозбудителей – комары Culicinae, иксодовые клещи, москиты. Патогенныедля человека виды вызывают лихорадки (в т. ч. геморрагические) иэнцефалиты (калифорнийский энцефалит).

Аренавирусы. Семейство Arenaviridae.

В состав семейства включены округлые или полиморфныеоболочечные вирусы. Спиральный тип симметрии. Основной хозяин – грызуны, человек – тупиковый хозяининфекционного цикла. Типовой вид – вирус лимфоцитарногохориоменингита (ЛХМ). Патогенные для человека виды вызывают тяжелыегеморрагические лихорадки с высокой летальностью и

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

Гепатит D встречаетсятолько в комбинации с инфекцией вирусом гепатита В, поскольку одним изкомпонентов вируса является белок вируса гепатита В.

палочковидныеветвящиеся вирусы со спиральным нуклеокапсидом. Средний размер: диаметр 80 нм и длина от 790 нм (вирус Марбург) до 970 нм (вирусы Эбола и Рестон). Для человека патогенны вирусы Марбург и Эбола. Вызывают тяжелыегеморрагические лихорадки, сопровождающиеся тяжелой

интоксикацией,сыпью, подкожными и внутренними кровоизлияниями, массивнымикровотечениями. Смертность при заболевании вирусом Марбург достигает25-30% от числа заболевших, а при заболевании вирусом Эбола - до

80-90%.

изученывирусÐепозиторийсаркомыÏолесÃÓРауса вирусы, вызывающие лейкозы у кур и мышей. Spumavirinae – «пенящие» вирусы, синцитиальные вирусы.

8 Ретрови усы (класс VI)

Ретровирусы. Семейство Retroviridae.

Вирусы покрыты обол чк й. Геном образован однонитевой (+)РНК,

образующей комплекс из двух идентичных субъединиц. Тип

вирусам,поддерживают продуктивную инфекцию, не вызывая гибели клетки-

хозяина.Характерная собенность мей тва – наличие обратной

транскри тазы(РНК-зависимая ДНК-полимераза).Обнаружено много самых разнообразных ретровирусов, однакопатогенностью для человека обладает огранич нная группа.

Подсемейства Oncovirinae – содержит группу онковирусов. Некоторыеиз них способны вызывать зл качественные опухоли. Лучше других

Lentivirinae – «медленные» ретровирусы, вирусы иммунодефицита человека.

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

ТЕМА 5 ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ВИРУСА С КЛЕТКОЙ. ЛИЗОГЕННЫЙ И

ЛИТИЧЕСКИЙ ПУТЬ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ БАКТЕРИОФАГОВ

1.Типы взаимодействия вируса с клеткой.

2.Жизненный цикл бактериофагов.

ÐепозиториАдсорбция. ВзаимÏолесÃÓдействие вирусайклеткой начинается с процесса адсорбции, . . прикрепления вирусов к поверхности клетки. Это

1. Типы взаимодействия вируса с клеткой

Различают три типа взаимодейств я в руса с клеткой: продуктивный,

абортивный и интегративный.

Продуктивный тип – заве шается образованием нового поколения вирионов и гибелью (лизисом) за аженных клеток (цитолитическая форма). Некоторые вирусы выходят из клет к, не разрушая их (нецитолитическая

форма).

Абортивный т п – не завершается образованием новых вирионов,

поскольку инфекционный процесс в клетке прерывается на одном из этапов.

Интегративный т п, ли вирогения – характеризуется встраиванием

(интеграцией) вирусн й ДНК в виде провируса в хромосому клетки и их

совместным с существ ванием (совм тная репликация).

Ре родукция вирусов осущ ствляется в несколько стадий,

посл доват льно сменяющих друг друга: адсорбция вируса на клетке; проникнов ние вируса в к етку;»раздевание» вируса;биосинтез вирусных компон нтов в клетке;ф рмир вание вирусов;выход вирусов из клетки.

высокоспецифический процесс. Вирус адсорбируется на определенных участках клеточной мембраны – так называемых рецепторах. Клеточные рецепторы могут иметь разную химическую природу, представляя собой белки, углеводные компоненты белков и липидов, липиды. Число специфических рецепторов на поверхности одной клетки колеблется от 104 до 105. Следовательно, на клетке могут адсорбироваться десятки и даже сотни вирусных частиц.

Проникновение в клетку. Существует два способа проникновения вирусов животных в клетку: виропексис и слияние вирусной оболочки с клеточной мембраной. При виропексисе после адсорбции вирусов происходят инвагинация (впячивание) участка клеточной мембраны и образование внутриклеточной вакуоли, которая содержит вирусную частицу. Вакуоль с

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

цитоплазмы или ядро клетки. Процесс слияния осуществляется одним из поверхностных вирусных белков капсидной или суперкапсидной оболочки. Повидимому, оба механизма проникновения вируса в клетку не исключают, а дополняют друг друга.

«Раздевание». Процесс «раздевания» заключается в удалении защитных вирусных оболочек и освобождении внутреннего компонента вируса, способного вызвать инфекционный процесс. «Раздевание» вирусов происходит постепенно, в несколько этапов, в определенных участках цитоплазмы или ядра клетки, для чего клетка использует набор специальных ферментов. В случае

его «раздевания». Конечными продуктами «раздевания» являются сердцевина, нуклеокапсид или нуклеиновая кислота в руса.

проникновения вируса путем слияния вирусной оболочки с клеточной мембрÐепозиторийаной процесс проникновения вируса в клетку сочетается с первым этапом

Биосинтез компонентов ви уса. Прон кшая в клетку вирусная нуклеиновая кислота несет генетическую информацию, которая успешно

конкурирует с генетической инф мацией клетки. Она дезорганизует работу

клеточных систем, подавляет с бс венный метаболизм клетки и заставляет ее

построение вирусного потомс ва.

синтезировать новыеÏолесÃÓвирусные белки и нуклеиновые кислоты, идущие на

Реализация генет ческой информации вируса осуществляется в

соответствии с процессами транскрипции, трансляции и репликации.

Формир вание (сборка) виру ов. Синтезированные вирусные нуклеиновые кисл ты и белки обладают способностью специфически

«узнавать» друг друга и при достаточной их концентрации самопроизвольно соединяются в результате гидрофобных, солевых и водородных связей.

2. Жизненный цикл бактериофагов

Важным свойств м бактериофагов является их специфичность: бактериофаги, как правило, лизируют бактерии определенного вида.

Взаимоотношения между фагом чувствительной к нему клеткой сложны и не

всегда завершаются лизисом клетки и размножением в ней фага.

В зависимости от специфичности различают моновалентные фаги, лизирующие культуры бактерий определенного вида, типовые фаги, лизирующие отдельные штаммы внутри вида, и поливалентные фаги, способные вызывать лизис группы родственных видов микроорганизмов. Инфекция клетки, которая заканчивается гибелью клетки и размножением в ней

фага называется продуктивной.

Важнейшая особенность фага в том, что его размножение может происходить только в живых клетках, находящихся в стадии роста и развития. В мертвых клетках, а также продуктах клеточного обмена размножение фага не

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

вирулентные и умеренные бактериофаги. Время с момента инфицирования клетки фагом до лизиса клетки называется латентным периодом. Первая половина латентного периода, во время которой еще не удается обнаружить в зараженной клетке инфекционный фаг, называется скрытым периодом. Каждая система фаг – бактерия в стандартных условиях проведения опыта характеризуется определенными величинами латентного и скрытого периодов. Продолжительность этого периода различна для разных типов фага, зависит от окружающей температуры, состава среды и других факторов. Латентный период фагов может составлять от 15 – 40 мин. до 5 ч и более. У фагов

актиномицетов латентный период может быть еще продолжительнее. При низкойÐепозиторийтемпературе латентный период значительно увеличивается.

Бактериофаг может развиваться по двум моделям: лизогенный и литический путь. Умеренные вирулентные бактериофаги на начальных этапах

взаимодействия с бактериальной клеткой меют одинаковый цикл развития.

Вирулентные бактериофаги развиваются по литической модели, которая включает следующие стадии (рисун к 5.1):

Рисунок 5.1 –ÏолесÃÓПринципиальная схема жизненного цикла бактериофага: 1 –

адсорбция фага на клетке; 2 – проникновение вирусной нуклеиновой кислоты в клетку; 3 – интеграция фаговой ДНК в хромосому бактерий; 4 – репликация фаговой ДНК; 5 – синтез вирусных белков, образование капсидов,упаковка ДНК в капсиды, созревание фаговых частиц; 6 – лизис клетки и выход фаговых частиц

• Адсорбция бактериофага на фагоспецифических рецепторах клетки. Адсорбция фагов на клеточной поверхности бактерий происходит при помощи специфических рецепторов, которые располагаются на кончике нити, шипа или хвостика. В свою очередь, на клеточной стенке бактерии располагаются ее фагоспецифические рецепторы, распознаваемые фагом. Рецепторы для одних

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

липополисахаридном слое. Для ряда фагов рецепторы находятся на жгутиках или пилях. Адсорбция фага – пусковой момент его жизненного цикла. Она очень специфична и поэтому обусловливает возможность практического использования фагов, например, для идентификации бактерий, а также для лечебных и профилактических целей. Пластинка с шипами прикрепляется к стенке, содержащийся в них лизоцим вызывает в месте контакта лизис клеточной стенки. Одновременно ионы кальция активируют содержащуюся в белках чехла АТФ-азу, и чехол сокращается. Его длина уменьшается в 2 раза, количество витков также уменьшается в 2 раза. В результате сокращения чехла

• Инъекция фаговой нуклеиновой к слоты в клетку хозяина. Внедрение фаговой ДНК в клетку происходит с помощью следующим образом: около 10 % ее активно впрыскивается во время сок ащен я чехла хвоста; остальная часть фаговой ДНК втягивается в цитоплазму бактерий благодаря процессам транскрипции и работе трансляци нн го аппарата. Белки капсида остаются

внутренний стержень прокалывает клеточную стенку в участке, разрушенном лизоцимомÐепозиторий, и цитоплазматическую мембрану.

снаружи клеточной стенки.

Нуклеиновая кислота фага направляет синтез ферментов фага, используя для этого белоксинте ирующ й аппарат бактерии. Фаг тем или иным способом инактивирует ДНК и РНК хозя на, а ферменты фага совсем расщепляют её; РНК фага «п дчиняет» себе клеточный аппарат синтеза белка. Репликация фаговой ген мн й ДНК или РНК протекает в соответствии с общим механизмом ре ликации. Степ нь зави имо ти репликации ДНК фага от хромосомы клетки опреде яется набором генов у фагов. Крупные фаги (фаг Т4), осущ ствляют репликацию по ностью автономно; средние – частично нуждаются в помощи бактериа ьных генов, а мелкие (фаг М13) почти

полностью зависят хр м мных генов. После начала репликации

начинается синтез поздних вирусных 14 информационных РНК. В результате образуется второй набор вирусспецифических белков, в том числе субъединицы вирусного капсида.

• Сборка вновь синтезированных вирионов – заключение фаговой

• Совместная репликацияÏолесÃÓфаг в й и бактериальной нуклеиновой кислоты.

нуклеиновой кислоты в белковую оболочку (морфогенез фагов). У мелких

фагов морфогенез протекает по типу самосборки. У фага Т4 этот процесс требует активности более 40 генов и происходит при участии трех самостоятельных линий. На одной происходит сборка хвоста (участие 20 генов), на другой – головки фага (около 16 генов), на третьей – сборка ворсин (5 генов). Соединение хвоста с головкой не требует участия генов, но оно не может произойти до тех пор, пока и хвостовой отросток, и головка не будут смонтированы полностью. Точно так и ворсины могут присоединиться к хвосту только после его полного соединения с головкой. Благодаря строгому

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

исогласованность всех процессов его внутриклеточного размножения.

•Лизис клетки. Клетка лопается под воздействием лизоцима; высвобождается около 200–1000 новых фаговых частиц; фаги инфицируют другие бактерии.

Выход вновь синтезированных фагов из клетки присходит:

1) путем почкования (М13 – единственный фаг, не вызывающий при выходе из клетки ее гибели);

2) путем лизиса клетки изнутри.

Осуществляется лизоцимом и вызывает гибель клетки. Лизоцим

синтезируетсяÐепозиторийкак поздний вирусспецифический белок. Он воздействует на

пептидогликановый слой стенки бактериальной клетки, в результате стенка разрывается, фаговое потомство выход т з клетки. Иногда происходит лизис

бактерий извне, как следствие адсорбц мног х фагов на одной клетке, но при

этом размножения фагов не происходит. Обычно же после внедрения фагового генома в клетку у нее возникает состояние иммунитета к суперинфекции данным фагом, т.е. проникн вение д угих фаговых геномов становится невозможным. Умеренные бак ери фаги после деления клетки находятся в

состоянии профага (лизогенныйÏолесÃÓпу ь).

Лизогения – это способнос ь бактериальной культуры в бесчисленном ряду поколений нести в своем составе фаг в особой неинфекционной форме – профаг. В форме профага в рус не патогенен для клетки, сохраняя, однако,

потенциальную сп бность стать вирулентным при переходе в зрелый (активный) фаг. Пр фаг находи я в клетке либо в интегрированном с

бактериальной хр м мой состоянии (например, λ, Р22), либо в виде цитоплазматической частицы, в частности, профаги Р1и N15 локализуются в цитоплаз15 ме клетки хозяина, образуя самостоятельный репликон, подобно плазмидам бактерий. Бактерии, в составе клеток которых есть профаг, называются лизогенными. Лиз генные бактерии могут лизироваться и высвобождать зрелый фаг (либо спонтанно, либо при воздействии индуцирующими факторами: УФ-излучение, ионизирующее излучение, обработка некоторыми кислотами, перекисями, антибиотиками и др.). Наиболее эффективные и широко применяемые индуцирующие агенты – УФ-лучи и антибиотик митомицин С.

Лизогенизация – это процесс перехода бактериальной клетки в лизогенное состояние, обусловленный инфицированием умеренным фагом. Умеренные фаги играют важную роль в обмене генетическим материалом между бактериями. Этот процесс получил название трансдукции.

Различают общую (генерализованную или неспецифическую) и специфическую трансдукцию. Общая трансдукция. Механизм ее заключается в том, что в процессе внутриклеточного размножения фага в его головку может быть случайно включен вместо фаговой ДНК фрагмент бактериальной ДНК,

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

возникают дефектные вирионы, у которых в головках вместо собственной геномной ДНК содержится фрагмент ДНК бактерии. Такие фаги сохраняют инфекционные свойства. Они адсорбируются на бактериальной клетке, вводят в

нее ДНК, содержащуюся в головке, но при этом размножения фага не происходит. Введенная в клетку реципиента донорная ДНК, если она содержит гены, отсутствующие у реципиента, наделяет его новым признаком. Этот признак будет зависеть от того, какой ген (гены) попал в головку трансдуцирующего фага. В случае рекомбинации привнесенного фагом фрагмента ДНК донора с хромосомой клетки-реципиента этот признак

наследственно закрепляется.

прикрÐепозиторийпляются отросткÏолесÃÓм к бактериальным жгутикам. У некоторых фагов процесс адсорбции м жет существляться лишь в том случае, когда в среде

Специфическая трансдукция отличается от неспецифической тем, что в этом случае трансдуцирующие фаги всегда переносят только определенные гены. Специфическая трансдукция всегда связана с интеграцией умеренного

фага в хромосому клетки-хозяина. П выходе (исключении) из хромосомы

профаг может захватить ген с левого или п авого фланга, но в этом случае он должен лишиться такого же разме а св ей ДНК с противоположного конца, чтобы ее общая длина ос авалась неизменной (иначе она не может быть упакована в головку фага). П э му при такой форме исключения образуются

дефектные фаги.

Достаточно хорошо сследованным является процесс адсорбциифаговой

частицы на клетке. Адсорбц я фага на клетке – реакция строго специфична. На рецепторах в клет чн й стенке бактерий адсорбируются (прикрепляются) только те фаги, к к т рым чувствит льна клетка. Фаги, имеющие отростки,

прикрепляются к клет чной ст нке вободным концом отростка. Нитевидные

фаги, а также фаги, не имеющие отростков, адсорбируются на нитевидных

структурах кл тки – фимбриях пилях. Существуют фаги, которые

имеются определенные вещества – кофакторы (аминокислоты – триптофан, тирозин или соли Ca, Mg). На конце фагового отростка имеется особый фермент типа лизоцима. После адсорбции фага под влиянием этого фермента происходит растворение стенки микробной клетки и содержимое головки фага

(нуклеиновая кислота) переходит в клетку бактерии. Остальные структуры фаговой частицы (оболочка головки, отросток и его субструктуры) внутрь инфицированной фагом клетки не попадают. Их роль заключается в обеспечении сохранности фаговой частицы, находящейся вне клетки, и содействии проникновению фаговой нуклеиновой кислоты в клетку при инфекции. У нитевидных фагов внутрь клетки кроме молекулы нуклеиновой кислоты проникает частично или полностью белковая составляющая фага. Абсолютное большинство фагов вызывает лизис клетки и ее гибель. Если произвести рассев по поверхности агаризованной питательной среды в чашках

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

термостатированием, то происходит лизис клеток в результате репродукции фага. При большом количестве частиц фага лизируется большая часть или весь выросший газон культуры. Если количество фаговых частиц таково, что они распределяются только на отдельных участках газона, лизируя в этих местах культуру, то образуются округлые прозрачные участки, называемые стерильными пятнами, фаговыми бляшками или негативными колониями фага, которые хорошо визуализируются при просмотре чашек в проходящем свете. Сформировавшаяся негативная колония содержит 106 – 109 фаговых частиц. Размер и форма негативных колоний являются важной характеристикой фага,

колоний пропорционален скорости еп одукц фага, скорости освобождения фаговых частиц из клеток их адсо бции на поверхности неинфицированных бактериальных клеток может быть п по ционален размеру фаговых частиц, который определяет скорос ь их диффузии в агаре. Следовательно, крупные

фаги образуют мелкиеÏолесÃÓнега ивные к лонии, фаги с небольшим размером

вирусной частицы – крупные нега ивные колонии. Морфология негативной

колонии относится к пр накам, чрезвычайно специфичным для данного фага,

иногда для группы родственных фагов. Фаговые бляшки могут быть прозрачными (к гда ли ировалась в я культура) или выглядеть мутными.

Мутные бляшки бычно образуют ум ренные бактериофаги, поскольку

большинство бактериальных кл ток внутри бляшки остаются лизогенными.

Стерильное ятно может быть окруж но одной или несколькими зонами

неполного лизиса, имеющими вид окружностей различной ширины. Иногда

негативные колонии па есцируют, что обусловлено рассеянием света

большим количеством фаг вых частиц в негативной колонии. Негативные колонии, образуемые бактери фагами, прекращают увеличиваться в размере че18 рез сутки, поскольку фаги способны репродуцироваться только в активно делящихся клетках бактерий.

Важной характеристикой взаимодействия фага с клеткой бактерии

является выход (урожай) фага – среднее количество новых частиц

бактериофага, освобождаемых клеткой в момент лизиса. Можно также рассчитать средний выход фага – отношение общего количества бляшкообразующих единиц фага к числу первоначально зараженных бактерий. Выход фага зависит от свойств данного фага и не зависит от клетки-хозяина и ее размеров. Одни фаги отличаются очень низким выходом (5–50 частиц на клетку), у других выход значительно выше (от 1000 до 2500). Особенно высоким выходом отличаются мелкие РНК-овые фаги (свыше 20 000 частиц на клетку). Если большое количество бактериальных клеток смешать с небольшим

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

несколько циклов. Вначале инфицируется часть клеток. Первое потомство фага инфицирует оставшиеся клетки – происходит второй цикл, за ним может следовать третий и т.д., пока не будут лизированы все чувствительные к данному фагу клетки.

ÐепозиторийÏолесÃÓ

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

ТЕМА 6 ХАРАКТЕРИСТИКА ВИРУСОВ ЖИВОТНЫХ

1.Общие свойства вирусов животных.

2.Онтогенез вирусов животных.

3.Специфичность вирусов животных.

1.Общие свойства вирусов животных

Специфика вирусов животных тесно связана с особенностями строения и физиологии их хозяев, поскольку является результатом их совместной эволюции. Эти вирусы проникают в клетки л бо путем эндоцитоза, либо в результате слияния оболочки вириона с ц топлазматической мембраной. Вирус гриппа, например, использует механизм клатрин-опосредованного, а

полиомавирусы - кавеолин- п с ед ванноrоэндоцитоза. В свою очередь,

соседниеÐепозиторийклетки ÏолесÃÓвирусной инфекции и запускать противовирусный ответ. Вирус Эбола и респираторно-синцитиальный вирус (RSV) не только блокируют

вирусы герпеса, вирус иммун дефицита человека и вирус кори доставляют свой

генетический материал в ци плазму х зяина путем слияния липопротеиновой мембраны вириона с ц оплазма ической мембраной. Таким образом, в

отличие от бактериофагов, в русы животных проникают в клетку либо в интактном виде, либо част чно раздетыми.

Поскольку у млек питающих ильно развит клеточный и гуморальный

иммунитет, их вирусы часто сод ржат г ны, ответственные за уклонение от

зараж нной кл тки, в резу ьтате чего она становится «невидимой» для

иммунной системы. В св ю чередь, вирусы гриппа и кори кодируют ранние

неструктурные белки, п давляющие клеточный сигналинг, в частности при

использовании системы интерферона, предназначенной информировать

межклеточный сигналинг, но и заставляют инфицированные клетки секретировать вирусные белки для связывания нейтрализующих антител, которые вырабатываются в ответ на вирусную инфекцию. Особо изощренные способы подавления иммунного ответа используют вирусы, вызывающие хронические и медленные инфекции (в частности вирус гепатита С, герпесвирусы и вирус ВИЧ).

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

и у вирусов других организмов, однако имеет ряд особенностей.

Адсорбция. Для того чтобы вирус прикрепился к клетке, на ее поверхности должны присутствовать рецепторы с той или иной степенью избирательности; соответственно различают неспецифическую и специфическую адсорбцию.

В неспецифической адсорбции участвуют неполярные и полярные химическиегруппы, широко представленные на поверхности клеток разного типа, в частности остатки сахаров, сиаловая кислота, гепарансульфат, заряженные «головки» липидов и т. п. Неспецифическая адсорбция не всегда

необратимой.

завершается проникновением вируса и бывает обратимой. Однако когда вирион вступаетÐепозитово взаимодействие со специфическимирийрецепторами, она становится

Специфическая адсорбция – это сложный многостадийный процесс, в

котороммогут участвовать несколько в усных и клеточных белков. Как

правило, со стороны хозяина она опосредована сложноустроенными

рецепторами, характерными для п еделенного типа клеток. Например,

рецептором для вируса ВИЧ являю ся м лекулы CD4 (трансмембранные белки,

экспонированные наÏолесÃÓповерхн с и Т-хелперов). Для аденовирусов первичным

специфическим рецептором служит белок CAR (сокр. от англ. Coxsacki eadenovirus receptor; компонент плотных контактов, англ. tightjunction); на следующей стадии спец ф ческой адсорбции используются интегрины (белки, обеспечивающие прикрепление клетки к внеклеточному матриксу). Вслед за специфическ й адс рбцией происходит интернализация вирусного генома.

Проникн вение вируса. Виру ы животных проникают в клетки либо

путем эндоцитоза, либо в р зультате слияния суперкапсида с

цитоплазматич скоймембраной. Эндоцитоз происходит в ответ на лиганд-

рец пторное взаимодействие к етки вирусными белками. В данном случае

вирус использует механизмы, к рые в норме обеспечивают поглощение пищи и/или обновление поверхн стных рецепторов. Многие оболочные вирусы проникают в клетки путем слияния вирусной мембраны с мембраной хозяина; для этого используются специализированные вирусные белки слияния (англ. fusionprotein). Примером служат представители семейства Paramyxoviridae, в частности вирусы кори, парагриппа, чумы плотоядных и эпидемического паротита (свинки), а также представители семейства Retroviridae– вирусы иммунодефицита и лейкозов.

Раздевание вируса и презентация генома. У вирусов животных, использующих для проникновения в клетки механизм слияния мембран, презентация генома обычно сопряжена с проникновением. Если вирус заражает клетку путем эндоцитоза, проникновение предшествует презентации генома. Для этого мембрана оболочных вирусов (таких, как вирус гриппа) сливается с мембраной эндосомы; безоболочные вирусы (например, пикорнавирусы)

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

высвобождая геномную РНК.Нуклеокапсиды ДНК-содержащих вирусов (в частности, аденовирусов и вирусов герпеса) доставляются к ядерным порам, и геномная нуклеиновая кислота высвобождается в нуклеоплазму. Внутриклеточная транслокациянуклеокапсидов или рибонуклеопротеиновых комплексов происходит с помощью транспортных белков, которые распознают специфические сайты на вирусных белках, например сигналы ядерной локализации (анrл. Nuclea rlocalization signal). Следует отметить, что не все вирусы животных проходят стадию раздевания. Например, содержащие dsPHKротавирусы никогда полностью не раздеваются и не высвобождают свой

сформированных капсидов.

геном – у них первичная транскрипция происходит внутри капсида,ds-геномы потомстваÐепозитакже образуютсяторийне в цитоплазме, а внутри заранее

Синтез вирусных белков и нукле новых кислот. Различают ранние и поздние вирусные белки. Первые об азуются в начале цикла размножения, вторые – в конце его. Многие ви усы животных на ранней стадии инфекции синтезируют специализированные белки, подавляющие иммунный ответ хозяина. Как правило, это нес рук урные белки, которые не входят в состав

вирусных частиц. ÏолесÃÓ Вирусы животных разл чаются по зависимости от клеточных

биосинтезов. В то время как х белки, как у всех вирусов, образуютсяна хозяйскихрибосомах, х нуклеиновые кислоты обычно синтезируются

собственными ферментами. Для этого РНКодержащие вирусы (в частности, вирус гриппа) исп льзуют виру п цифичные РНК-зависимые РНКполимеразы (RdRP). Крупные ДНКод ржащие вирусы (например, вирусы

африканской чумы свиней, иридовирусы вирусы оспы) образуют

цитоплазматич ские вирусные фабрики, где геномная ДНК синтезируется с помощью вирусных фермент в.

Сборка вирион в. П сле того, как в клетке накопилось достаточно

вирусных структурных белк в, начинается сборка вирионов. У большинства

ДНК-содержащихвирусов животных сначала формируются капсиды, а затем в

них упаковывается генетический материал. Вирионы оболочных РНК-

содержащих вирусов упаковываются и при отпочковании от клеточных

мембран.

Выход вирионов. Безоболочные вирусы животных часто образуют внутри инфицированной клетки обширные квазикристаллические скопления. В данном случае вирионы могут выйти из клетки только после того, как цитоплазматическая мембрана разрушится и клетка погибнет. Некоторые вирусы, например аденовирусы, помогают выходу своего потомства, образуя белки смерти, или апоптины (англ. deathprotein, DP; apoptin), которые стимулируют апоптоз. Выход оболочных вирусов в отличие от выходабезоболочных вирусов не обязательно связан с гибелью клетки. При

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

вирусом гепатитаС, клетка может долго существовать, производя все новые и новые вирусные частицы. У многих оболочных вирусов (в частности, у вирусов гриппа икоронавирусов) представители нового поколения вирионов остаются после выхода прикрепленными к клеточной мембране; чтобы нарушить эту связь, требуются специализированные вирусные или клеточные ферменты. У вируса гриппа такую роль выполняет нейраминидаза.

Внеклеточное созревание вирионов. Для мн огих вирусов животных характернастадия внеклеточного созревания (англ. maturaton), когда вышедшие из клетки частицы вирусного потомства претерпевают изменения под

следующий раунд размножения, пока не созреют.

воздействием вирусных и/или клеточных ферментов. Вновь синтезированныевирусныеÐепозиторийчастицы зачастую не способны осуществить

Стадия созревания отчетливо выражена у таких вирусов, как аденовирусы и вирус HIV-1. В процессе соз еван я структурные белки вируса процессируютсявирусоспецифичными п отеазами, что приводит к завершению

формирования капсида.

Вирусы способны ра множаться в клетках животных определенного вида и передаваться от одной особи к другой. Как правило, вирусы животных могут

размножаться в клетках дного или не кольких родственных видов хозяина.

Специфичн сть вируса (англ. Host specificity – специфичность в

отношении х зяина) непосредств нно не вязана со способностью вызывать

заболевание – многие вирусы цирку ируют в природных популяциях хозяев, не причиняя им особого вреда. В то же время у «тупикового» хозяина, каковым часто явля тся человек, вирусы животных способны вызывать тяжелые, а иногда смертельные заб левания (в популяции тупикового хозяина вирус по

определению не передается т соби к особи). Примерами служат вирусы бешенства клещевого энцефалита.

Для многих вирусов животных характерен сложный экологический цикл,

3.ÏолесÃÓСпецифичн сть вирусов животных

обусловленный свойством размножаться в клетках неродственных организмов, например млекопитающих и членистоногих. Очень часто промежуточными хозяевами служат членистоногие (клещи, москиты и т.д.), поэтому вирусы, которые передаются млекопитающим через их укус, называются арбовирусами (сокр. от англ. Arthropodbornevirus– вирус, переносимый членистоногими).

Следует учесть, что специфичность вирусов никогда не бывает абсолютной и варьирует в широких пределах в зависимости от природы вируса и хозяина. Например, чума плотоядных, поражающая главным образом собак и волков, не раз становилась причиной гибели львов и леопардов в африканских национальных парках.

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

представления о специфичности многих вирусов животных сильно изменились, поскольку появилась возможность выявлять субклинические и бессимптомные формы инфекции. В частности оказалось, что ротавирусы собак способны вызывать бессимптомную инфекцию у человека; коронавирусы коров (телят) и собак размножаются в кишечнике кошек и т.п.

Когда вирус почему-либо встречается с популяцией нового хозяина и приобретает способность передаваться от особи к особи, говорят о преодолении вирусом межвидового барьера и смене хозяина. Примером служит появление в 1976 г. новой болезни собак – парвовирусного энтерита («олимпийки»). Этот

в нем размножаться.

новый парвовирус – вариант давно известного вируса панлейкопении кошек, которыйÐепозиторийпри невыясненных обстоятельствах сменил хозяина и в результате перестал быть патогенным для первичного хозя на, хотя сохранил способность

Клеточный тропизм. В многоклеточном организме вирус заражает только

клетки, на поверхности которых имеются специфические рецепторы и которые

ворсинок, а вторые – в камб альных клетках крипт. Респираторные вирусы, как правило, могут ра множаться только в эпителии дыхательных путей, а вирусы, вызывающие гепатит, - в гепатоц тах.

способны поддерживать eгo азмн жение. Например, ротавирусы и парвовирусы поражают тонкий кишечник, вызывая острый энтерит, однако первые размножаютсяÏолесÃÓисключи ельно в дифференцированных клетках

Некоторые вирусы способны размножаться в клетках нескольких типов. Например, вирус пр ст го герп са при п рвичном заражении размножается в эпидермисе, а затем по аксонам добирает я до спинальных ганглиев,где вызывает латентную инфекцию. В свою очередь, вирус полиомиелита в норме реплициру тся в желудочно­кишечном тракте, однако в провоцирующих условиях (при травмах, внутримышечных инъекциях и т. д.) может проникнуть

в центральную нервную систему и вызвать поражение моторных нейронов.

Многие вирусы сп бны изменять свой клеточный тропизм при прогрессирующей инфекции. Например, вирус ммунодефицита человека в

начальной стадии инфицирует почти исключительно Т-хелперы, однако с

развитием заболевания приобретает способность заражать

моноциты/макрофаги, дендритные клетки и астроглию. Наконец, коронавирусы кошек в норме персистируют в эпителии кишечника, однако если хозяин перенес стресс, они начинают заражатьмакрофаги, а затем клетки других тканей и органов. Развивается системная инфекция, заканчивающаяся гибелью животного.

Разнообразие вирусов животных. Вирусы животных, даже если говорить только о вирусах млекопитающих, исключительно разнообразны в отношении генетического материала, строения вирионов и цикла размножения. Приведем ряд типичных, а также крайних примеров.

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

10 - 15 тыс. н. Таковы геномы вируса гриппа, вируса иммунодефицита человека и вируса кори. Самый большой ssPHK-гeнoм (30 тыс. н.) имеют коронавирусы, а самый маленький (7 тыс. н.) – калицивирусы и пикорнавирусы. Диаметр частиц РНК­содержащих вирусов животных варьирует в пределах 30 - 300 нм (в среднем 80 – 100 нм). Предполагается, что его естественным ограничителем служит размер генома, который, в свою очередь, ограничивается свойством полимеразного комплекса ошибаться чаще ДНК-полимеразы при неспособности исправлять (репарировать) ошибки.

Диапазон размера генома у самых маленьких и самых больших ДНК-

тыс. п.н., т.е. различие составляет целые два порядка. Средний диаметр вириона ДНК-содержащих вирусов животных бл зок к 100 нм. Размер генома вируса животных не коррелирует с разме ом генома хозяина; так, самый большой из известных вирусных геномов (1200 тыс. п.н.) у вируса амебы – Acanthamoeba polyphagamimivirus.

самых крупных вирусовÏолесÃÓ. Напр мер, дикие африканские свиньи-бородавочники служат природными хо яевами парвовирусов (размер генома – 4 тыс.н.),

Один и тот же вид жив н го м жет быть хозяином и самых мелких, и

асфарвирусов (200 тыс. .н.) поксвирусов (350 тысп.н.).

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

ТЕМА 7 ВИРУСЫ ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ (ФИТОВИРУСЫ)

1.Основные особенности фитовирусов.

2.Экономический ущерб от вирусной инфекции.

На первый взгляд, высшие растения обладают преимуществами перед другими объектами, на которых изучаются вирусные инфекции. Действительно, в отличие от бактерий их проще культивировать, а по сравнению с животными они быстрее растут и размножаются, требуют меньше ухода и не находятся под бдительным оком биоэтики. Тем не менее вирусы высших растений охарактеризованы гораздо хуже бактериофагов или вирусов животных.

1. Основные с бенности фитовирусов

Относительно слабая изученн сть фитовирусов имеет не только такую «субъективную» прич ну, как неак уальность их для медицины, но и связана со спецификой строения растен й на клеточном и тканевом уровнях.

Вирион фитовирусов. У разных представителей фитовирусов вирионы различаются по ф рме. Однако в на тоящее время она не считается главным критерием при разграничении семей тв или порядков.

Вирионы фит вирусов могут быть безоболочными и оболочными;

Након ц, пр дставители семейства Narnaviridae вообще не образуют капсида. Г ном фитовирус в. Размер генома у всех изученных РНК-содержащих

фитовирусов варьирует в пределах от 2,5 тыс. н. (сем. Narnaviridae) до 20 тыс. н. (сем. Closteroviridae); реднее значение составляет 4 – 6 тыс. н. В свою

сегментированными, унипартитными и мультипартитными. При этом, в одном и том же семействе могут встречаться все перечисленные варианты геномов (примером служит сем. Virgaviridae). Широкому распространению мультипартитных вирусов благоприятствуют персистентныйхарактер инфекции и передача агента насекомыми.

Особенности проникновения и транслокации. В нормальных условиях стенка растительной клетки представляет собой массивный и очень жесткий каркас целлюлозных фибрилл в аморфном матриксе, который состоит в первую

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

может дополнительно содержать лигнин, кутин, суберин, белки и воски. Различают первичные и вторичные клеточные стенки.

Первичные клеточные стенки (анrл. primary cell wall) формируются в процессе роста клетки. Они относительно тонкие (0,1 -– 1 мкм) и состоят из неупорядоченно ориентированных целлюлозных фибрилл, которые погружены в обводненный матрикс из гемицеллюлоз, пектинов и белков. Первичные клеточные стенки способны к растяжению под воздействием тургорноrо давления.

Вторичная стенка (анrл. secondary cell wall) формируется после

фитовирусовÐепозиторий, как правилоÏолесÃÓ, не с провождается лизисом клетки; преобладают персистентные инфекции, при которых вирионы мигрируют в теле хозяина или

окончания роста клетки; в ней преобладают упорядоченно ориентированные целлюлозные фибриллы и лигнин, придающий растительным волокнам и древесине механическую прочность,а также рекальцитрантность, т.е. устойчивость к разложению. Вторичная стенка обычно толще первичной (0,5 –

10 мкм); у нее иная ультраструкту а д уг е механические свойства. В

частности, она бывает способна к эластичному растяжению под воздействием тургора, обусловленного нак плением в цитоплазме осмотически активных ассимилятов, в частности сахар в.

Клеточная стенка вып лняет не только арматурную, защитную, транспортную и регуляторную функции; без нее растительная клетка не может долго просуществовать. Искусственно полученные протопласты даже в условиях осмотического ком­ форта через непродолжительноевремя (обычно

фитовирусов нет ферментов, которые могли бы разрушить клеточную стенку

передаются другому хозяину помощью животных векторов.

Хотя первичное проникновение фитовирусов возможно в поврежденных частях растения, для дистанционной транслокации они используют особую деталь его тканевой организации – систему плазмодесм (диффузионных коридоров, соединяющих соседние клетки).

Плазмодесма (англ. plasmodesma; от греч. plasma– тело и desme– связка; в данном случае – цитоплазматическая перемычка) представляет собой мембранный канал диаметром 30 – 40 нм, связывающий цитоплазму соседних клеток. В него вложена десмотубула – продолговатая цистерна эндоплазматическоrо ретикулума, которая обеспечивает непрерывность внутренних мембран клеток растительной ткани. Просвет десмотубулы и зазор

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

вспомогательными белками.

Максимальный пропускной (эксклюзионный) диаметр плазмодесмы и десмотубулы составляет 2,5 – 3 нм, что позволяет свободно диффундировать молекулам массой не более 0,75 – 1 кДа (значительно меньше, чем молекулярная масса геномной нуклеиновой кислоты фитовирусов, вирусных белков и, тем более, вирионов).

В процессе транслокации вирионов фитовирусов участвуют уникальные «белки движения». Под их воздействием эксклюзионный диаметр плазмодесмы и десмотубулы значительно увеличивается; кроме того, эти белки выполняют

размноженииÐепозиторийили с семенамиÏолесÃÓ, хотя обычн их хозяевами служат представители отдельного рода в пределах семейства. В то же время нередки случаи, когда

регуляторные функции.

Наряду с транслокацией, происходящей в результате контактного взаимодействия между клетками в пределах ткани, фитовирусы могут использовать дистанционную связь между тканями и органами растения,

которая обеспечивается их проводящей с стемой.

Роль проводящей системы в т анслокации фитовирусов. Проводящая система функционально интегрирует ткани и органы растительного организма и подразделяется на ксилему (англ. xylem; от греч. xylon– древесина), которая транспортирует воду и минеральные и ны от корней к надземным частям, в

частности к ассимилирующ м каням, и флоэму (англ. phloem; от греч. phloios

луб), которая перенос т асс м ляты в корни, в зоны роста, к зреющим плодам и т.д., т.е. в места их непосредственной утилизации или запасания. За последнее

десятилетие выяснил сь, что проводящая система дополнительно

транспортирует инф рмационные мол кулы, в том числе мРНК. С проводящей системой связано и распростран ние виру ной инфекции по телу растения.

Специфичность фитовирусов. Отсутствие рецепторов на поверхности

фитовирусы преодолевают барьер между семействами и даже таксонами более высокого ранга. Например, вирус бронзовости томата (Tomato spotted wilt virus,TSWV) может инфицировать представителей более 650 видов 80 семейств однодольных и двудольных растений. Наконец, известны случаи, когда фитовирусы преодолевают барьер, и их хозяевами становятся представители другого царства – беспозвоночные животные.

Биоразнообразие и систематика фитовирусов. В настоящее время насчитывается свыше 2000 видов фитовирусов, и можно предположить, что их на самом деле на порядок больше. Среди известных штаммов 77% выделено от культурных растений, что объясняется не биологическими причинами, а

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

Основными критериями систематики фитовирусов служат тип, структра, размер и число молекул геномной нуклеиновой кислоты, которая может быть представлена dsPHK или ssPHK (65% изолятов), а также dsДHK или ssДHK разной конфигурации. Не обнаружены только фитовирусы с геномной линейной dsДHK. В жизненном цикле некоторых РНК-содержащих или ДНКсодержащих фитовирусов есть стадия обратной транскрипции.

Размер и строение генома у представителей разных групп фитовирусов значительно варьируют. Границы семейств и родов, наряду с молекулярными характеристиками генома и строением вириона, определяются кругом хозяев, а

также способом и путем передачи инфекции.

имеютÐепозиторийпоражения цветковÏолесÃÓ, плодов и семян сельскохозяйственных культур; новых представителей фитовирусов обычно описывали при эпифитотиях (от

Критерий вида фитовируса – характерные симптомы болезни; они отражены в таксономическом или тр в альном названии, в него входит название растения, на котором данный в д был впервые обнаружен, например

Barley yellow dwarf virus (BYDV) - ви ус желтой карликовости ячменя; Тоbассо

ringspot virus (TRSV) – вирус кольцевой пятнистости табака и т.д.

2. Экономический ущерб от вирусной инфекции.

Вызванное вирусной нфекцией нарушение метаболизма приводит к отмиранию частей растен я ли, гораздо реже, к его гибели. Особое значение

греч. epi– охватывающий и phyton – ра тение; эпидемия среди растений), которые наносят серьезный экономич кий ущерб.

Потери урожая могут происходить на всех этапах агротехнического цикла (выращивание, сбор урожая, хранение, обработка и т.д.), поэтому их трудно точно оц нить в денежн м выражении. Интродукция новых культур и несоблюдение карантинных мер в условиях интенсивного земледелия способствуют расширению круга хозяев развитию эпифитотий. Сильнее всего подвержены вирусным инфекциям популярнейшие культуры.

Например, растение картофеля инфицируется фитовирусами 14 родов; огурца – 8 родов; пшеницы – 17 видов. Ущерб от вирусных болезней в сельском хозяйстве огромен. По примерной оценке, он ежегодно составляет >60 трлн. долларов (~10% стоимости урожая). Последствия эпифитотии обычно сказываются в течение нескольких лет: утрачивается сортность, снижаются урожаи, теряется товарный вид плодов, возникают новые природные резервуары инфекции, расширяется круг поражаемых культур.

Фитовирусы служат неотъемлемой частью природных экосистем; они способны быстро адаптироваться к разным хозяевам (в том числе, размножаться в насекомых) и долго сохраняться в растительных останках, что создает постоянную угрозу земледелию и стимулирует выведение

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

рекомбинаций и мутаций у РНК-содержащих фитовирусов (которых большинство) последние неизменно лидируют в соревновании с селекционера­ ми. Тем не менее, в настоящее время массово выращиваются генетически модифицированные вирусоустойчивые растения, при создании которых учитывается структура и свойства генетических элементов фитовирусов.

ÐепозиторийÏолесÃÓ

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

ТЕМА 8 ВИРУСЫ МИКРООРГАНИЗМОВ

1.Основные особенности бактериофагов.

2.Особенности систематики бактериофагов.

3.Вирусы архей.

Бактериофаги поначалу вызвали интерес как потенциальное средство

животных. И только с расцветом генетики в 1940 – 1960-х годах они, в первую очередь фаги Е. coli , заняли достойное место в ряду ключевых объектов, на которых проводились исследования основ строен я, воспроизведения, передачи и функционирования генов.

Позднее, в 1970 – 1980-х г дах, с зарождением, а затем быстрым прогрессом молекулярной би л гии бактериофагов стали широко использовать

при клонировании генов и анализе их инфраструктуры.

борьбы с патогенными бактериями, однако вскоре отошли на задний план, посколькуÐепозиториймагистральным направлением вирусологии было изучение вирусов

Заражение происходитÏолесÃÓпри случайном столкновении вириона с клеткой хозяина. На фоне высокой локальной численности бактерий и вирусных частиц это происходит очень часто. Дальнейшее зависит от наличия и плотности размещения рецепторов на клеточной поверхности. В ходе проникновения бактериофаги (за исключением оболочных) полностью раздеваются, и в

1. Основные особенности бактериофагов

Бактерии заселяют ра нообразные ниши, в том числе экстремальные; они могут, с одн й ст роны, быстро размножаться, с другой стороны, дифференцир ваться в резистентные формы, сохраняющиеся в агрессивных условиях окружающей среды. По м ньш й мере, два свойства бактерий – активный м таболизм и высокая числ нность – делают их объектами

эксплуатации со стороны бактери фагов.

Сп цифика хозяев бактери фагов. Особенности индивидуального цикла

развития бактериофаг в пределяются спецификой клеточной организации

хозяев (напомним, что бактерии, как правило, содержат ригидную клеточную стенку неспособны к эндоцитозу).

цитоплазму поступает «голая» нуклеиновая кислота.

Бактерии постоянно имеют дело с чужеродной ДНК, которая инактивируется системой рестрикции/модификации, и чтобы уцелеть, бактериофаг эксплуатирует клеточные механизмы рекомбинации и репарации ДНК, что привело к широкому распространению феномена лизогении.

Отсутствие у бактерий мембранной компартментализации, имеющейся у Полессэукариотовкийгосударственный, снимает проблемууниверситетвнутриклеточного транспорта бактериофаговСтраница 47,

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

однако создает другую проблему – необходимость обеспечения высокой локальной концентрации структурных белков на этапе сборки вирионов. Она решается путем использования вирусных морфогенетических белков, а также хозяйских шаперонов, роль которых впервые была показана на примере фага лямбда.

Относительная простота культивирования бактерий позволяет без особого труда размножать бактериофагов в лабораторных условиях. Благодаря усилиям американской «фаговой» группы в 40 – 60-х годах ХХ в. они стали одним из модельных объектов молекулярной генетики. Знание молекулярных

экстрагированнойÐепозиторийизÏолесÃÓразн бразных сред и образцов).

свойств бактериофагов необходимо генным инженерам, использующим результаты фундаментальных исследований при конструировании геномов и для гетерологичной экспрессии генов.

Распространение и численность бактер офагов. Методами электронной микроскопии в природных популяциях бактер й постоянно и в большом количестве выявляются вирионы бакте иофагов, что свидетельствует о широчайшем распространении этих ви усов и косвенно указывает на их глобальную роль в биосфере. Суммарная биомасса бактериофагов не уступает

биомассе их хозяев, . е. в качес ве резервуара органического вещества и

аккумулятора биогенных элемен ов они служат важным, хотя и слабо изученным, звеном б олог ческого круговорота.

Как и в случае бактер – хозяев, истинные масштабы разнообразия

бактериофагов неи вестны; нание о них в о новном базируется на изучении

видов, инфицирующих модельные объ кты микробиологии, в частности Е.coli.

Генетическая роль бактери фагов. В настоящее время установлено, что бактериофаги – один из ключевых факторов эволюции бактерий. В отсутствие полового процесса у хозяев они отвечают за горизонтальный перенос их генов путем трансдукции. Напомним, что общая трансдукция представляет собой неспецифический перенос фрагмента хромосомы хозяина дефектной частицей вирулентного бактериофага. В свою очередь, специализированной трансдукции предшествует интеграция /эксцизия умеренного бактериофага с помощью тех же рекомбинационных механизмов, которые используются мобильными

генетическими элементами.

Трансдуцирующие бактериофаги способствуют распространению плазмид, а присутствие в конъюгативных транспозонах гомологов нуклеотидных последовательностей фага лямбда дополнительно указывает на универсальность бактериофагов в качестве генетического вектора. Два других механизма горизонтального переноса, генетическая трансформация и

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

заражение популяции бактерий может оказать существенное влияние и на их эффективность.

2. Особенности систематики бактериофагов

Бактериофаги обладают разнообразным, нередко сложным строением, что позволяет использовать их морфологию в качестве одного из критериев семейства или рода. Напомним, что в 1962 г. Андре Львов предложил классифицировать вирусов на основе особенностей морфологии вириона и по

типу геномной нуклеиновой кисло ты. В 1967 r. английский вирусолог Дэвид Брэдли (D.Е.Bradley) применил этот алгоритм к бактериофагам, подразделив их на шесть основных групп, или морфотипов.

В группу А вошли dsДНК-фаги с сократ мым хвостовым отростком, в группу В – dsДНК-фаги с длинным несок ат мым хвостовым отростком; в группу С – dsДНК­ фаги с коротким несок атимым хвостовым отростком; в

группу D – ssДНК-фаги без хв ст в го т остка, с крупными капсомерами; в

группу Е – ssPHK-фaги без хв с в го отростка, с мелкими капсомерами; в

группу F – ssДНК-фаги с ни евидным капсидом. Принадлежность к той или иной группе, по Брэдли, не коррелирует с таким важным признаком, как клеточная специфичность бактериофаг а. В частности, Escherichia sp. инфицируется фагами всех шести групп; Pseudomonas sp. – бактериофагами пяти групп ( а исключением группы D); Bacillus sp. – четырех групп (кроме групп D и F); Staphylococcus sp. – только бактериофагами групп А и В.

случаяхÐепозиторий, когда ониÏолесÃÓдержат дин и тот же тип нуклеиновой кислоты и используют одинаковую тратегию генома, их относят к разным семействам в

использу тся г нетическая система Дэвида Балтимора, применительно к бактериофагам по-прежнему актуален морфологический критерий. Даже в тех

соответствии со строением хвостового отростка.

Общие критерии рода у бактериофагов не разработаны, и в данном случае эта таксономическая категория носит условный характер. Внутри рода бактериофаги различаются по кругу хозяев, по чувствительности к абиотическим факторам (температуре, солености и т. д.), по модификации генов (вставки, делециии т. д.), по вторичной структуре нуклеиновой кислоты (линейная, кольцевая, суперспирализованная и т. д.), а также по инфраструктуре генома.

Проблематичность разграничения видов у бактерий не могла не отразиться на демаркации видов у бактериофагов. Чаще всего статус вида получают только те штам­мы-изоляты, которые инфицируют референтные

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

группы по способности инфицировать близкородственных хозяев, и эти группы соответствуют кластерам подобия геномов. Официально признанные названия видов бактериофагов включают в себя названия хозяев и, как правило, наборы цифр, а также сочетания латинских или греческих букв, отражающие рабочие обозначения штаммов-изолятов.

В отличие от симптомов вирусной инфекции растений и животных, внешние признаки инфекции у бактериофагов не имеют таксономического значения. За исключением феномена лизогенной конверсии единственным фенотипическим проявлением инфекции служат зоны лизиса или участки угнетения роста на газоне чувствительной бактерии, а также просветление суспензионной культуры, обусловленное лизисом клеток.

3. Вирусы архей

Еще недавно вирусов архей считали экзотическими объектами, не интересными «обычной» вирус л гии. Однако в последнее время внимание к ним повысилось; число посвященных им публикаций неуклонно растет, что объясняется тремя основными причинами.

Во-первых, больш нс во в русов архей, как и их хозяев, существует на границе адаптационных во можностей органической жизни, что относится к области интересов так х молодых и быстро развивающихся наук, как

относятся к числу умеренных, м гут служить векторами для осуществления гетерологичной экспрессии ген в белков. В то же время литические вирусы

состоит из четырех фил. Две из них, фила Euryarchaeota («вездесущие» археи) и фила Crenarchaeota («археи из горячих источников»), включают в себя большинство изученных видов архей. Две другие филы, Korarchaeota («юные» археи) и Nanoarchaeota («карликовые» археи), бедны представителями и преимущественно содержат виртуальные объекты, не охарактеризованные в фенотипическом плане.

К филе Euryarchaeota принадлежат облигатные экстремальные галофилы

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

Тhermoplasmata) и серозависимые экстремальные термофилы/гипертермофилы

(классы Тhermococci и Archaeoglobi).

К филе Crenarchaeota преимущественно относятся экстремальные термофилы/ гипертермофилы (класс Тhermoprotei), большинство из которых

(ан)аэробы\нейтрофилы или факультативные анаэробы, восстанавливающие серу, в порядок Sulfolobales – окисляющие серу ацидофилы-аэробы или факультативные анаэробы.

Число видов вирусов архей (-50) на два порядка меньше по сравнению с числом видов бактериофагов и вирусов ядерных организмов (-8000). Лишь немногие из них охарактеризованы в фенот п ческом отношении и только у

первых, не срабатывает испы анный прием вирусологии – получение препарата вирионов путем центрифугир вания фильтрата образцов природного материала (возможно, из-за того, что в резуль ате эволюции время пребывания вирусов архей в экстремальной среде сведено к минимуму). Во-вторых, удается культивировать лишь немног х хозяев, да в условиях, неблагоприятных для выделения вирус в. В частности, из-за вы окой оптимальной температуры роста (>75°С) мн гие из них не образуют зон лизиса (бляшек) на обычной агаризованной среде, х тя эта пробл ма ча решается путем замены aгapa более туго лавким полимером микробного происхождения - гелланом. В- третьих, многие вирусы архей (а в случае вирусов кренархеотов это большинство известных представите ей) не относятся к литическим, а по типу инфекции являются персистирующими или умеренными.

Как правило, вирусы архей содержат геномную dsДHK (5-85 тыс. п.н.; 1480 открытых рамок считывания) кольцевой или линейной конфигурации. Их

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

ТЕМА 9 КОНСТРУИРОВАНИЕ ВЕКТОРНЫХ СИСТЕМ НА ОСНОВЕ

БАКТЕРИОФАГОВ

1. Векторы, сконструированные на основе ДНК фага λ. 2. Векторы, созданные на базе ДНК нитевидных фагов.

Фаговые векторы конструируют на базе ДНК фагов таким образом, чтобы

ДНК фагов λ и М13. В первом случае фаговые головки имеют строго определенную геометрию, так что векторы способны включать такое количество чужеродного ДНК, чтобы образовавшиеся рекомбинантные ДНК могли упаковаться в головки фагов. Для н тевидных фагов, к которым относится М13, понятие емкости не п именимо, величина клонируемой в них ДНК определяется требованиям и эксперимента к стабильности фаговых частиц.

в них сохранилась информация, что обеспечивает сборку фаговых частиц invivoÐепозиторий. Для клонирования в клетках E. Coli такие векторы разработаны на базе

вектаров, длина рекÏолесÃÓмбинантн й ДНК равна сумме длин вектора и клонируемого фрагмента. Векторы замещения имеют два сайта узнавания для

1. Векторы, сконструированные на основе ДНК фага λ

Фагу λ была уготована роль переносчика чужих генов invivo. Действительно, в середине генома фага имеет я область, несущественная для развития фага. Она замещается на бактериальные гены при образовании трансдуцирующих фагов и она же используется для внедрения чужеродной

ДНК в в ктор м тодами invivo.

Фаговые векторы внедрения и факторы замещения. Первые несут один

сайт узнавания для избранн рестриктазы, поэтому у них, как и у плазмидных

используемой рестриктазы, поэтому в такие векторы клонируемые фрагменты ДНК вставляют вместо участков, ограниченных данными сайтами. В обоих случаях в реакциях образования рекомбинантрой ДНК участвуют два фрагмента λ ДНК (левое и правое плечи векторного генома, имеющие на одном ис своих концов cos-сайт) и фрагмент чужеродной ДНК. Под действием лигазы благодаря cos-сайтам прежде всего объединяются разные плечи λ ДНК. Затем образовавшиеся векторные молекулы реагируют с чужеродной ДНК и друг с другом, формируя конкатемеры. Они являются субстратом при сборке фаговых частиц invitro.

Прим работе с векторами замещения после их расщепления рестриктазами возникает проблема с буферными фрагментами, которые в

процессе клонирования могут снова вставляться в вектор вместо чужеродной ПолессДНК,кийуменьшаягосударственныйтем самымуниверситетвыход рекДНК. Проблему решаютСтраницаочисткой52

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

векторных плеч, используя препаративных электрофорез в 0,5%-ном агарозном геле или центрифугируя в градиенте сахарозы или NaCl. Эффективность очистки повышается, если предусмотрена возможность расщепления буферных фрагментов действием какой-либо рестриктазы. Другая возможность – дефосфорилирование 5’р-концов плеч вектора в местах разреза и буферных фрагментов, что предотвращает их лигирование. В этом случае ДНК предварительно выдерживают один час при 42°С, позволяя плечам объединяться через cos-сайты и предохраняя тем самым от действия щелочной фосфатазы. Дефосфорилирование 5’р-концов ДНК в местах разреза применяют

и при использовании векторов внедрения с целью предотвращения самолигированияÐепозиторийплеч вектора.

Емкость фагового вектора, т.е. теорет чески наибольший размер чужеродной ДНК, вставляемой в вектор, выч сляется как разность между максимальной величиной молекулы ДНК, упаковываемой в головку фага λ (52 т.п.н.), и минимальной величиной генома фага, необходимой для его развития.

Последняя, в свою очередь, п дсчитывается как разность между длиной ДНК

(48,5 т.п.н.) и суммарной длин й бластей, несущественных для развития фагов. К ним относятсяÏолесÃÓоблас ь в центре генома между генами JиN размером 16

т.п.н., и область nin между генами P и Q, размером 3,5 т.п.н.. Таким образом, минимально возможный размер векторов, сконструированных на основе λ ДНК, 29 т.п.н., а макс мальная величина вставки (теоретическая емкость) 23 т.п.н.

Реальная емк сть вектора опр д ля т я не только его размером, но и минимальной величин й ДНК, которая может упаковываться в фаговую головку. Поэтому вводятся понятия максимальной и минимальной емкости фаговых в кторов. Под этим подразумевается максимальное и минимальное

колич ство ДНК, кот м жно к онировать в векторе. Эти величины

определяются как разн сть, соответственно, между максимальным и

минимальным размер м упак вываемой ДНК и суммарным размером плеч

вектора. Отбор фагов, содержащих только рекомбинантную ДНК, ведут

методом прямой или непрямой селекции. Для прямой селекции удобно

использовать фаговые гены exo,betи gam, присутствующие в буферном

фрагменте. Метод основан на неспособности фага λ дикого типа развиваться в

клетках с профагом Р2 (Spi+фенотип). Те фаги, у которых произошла инактивация этих генов или их замена на чужеродную ДНК, развиваются в таких клетках. Напомним, что фаги λred-gam-не развиваются в recA клетках и формируют лишь маленькие негативные колонии на газоне recA- клеток. Поэтому для повышения жизнеспособности рекомбинантных фагов в векторы подобного типа вводят сайт chi, который служит горячей точкой recA- зависимой рекомбинации. В векторах внедрения для генетической метки рекомбинантных фагов применяют гены exoи cl, вводя в них сайты

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

клетках с мутациями в генах polA или lig, что и позволяет отличать их от самого вектора. Внедрение чужеродной ДНК в ген cl вызывает инактивацию фагового репрессора, в результате чего рекомбинантные фаги образуют прозрачные негативные колонии, так как они теряют способность лизогенировать клетки. Для таких фагов возможна прямая селекция с помощью бактериального мутанта hfl, в котором фаги с геном cl+не развиваются из-зи 100%-ной лизогенизации ими клеток.

Стратегию конструирования фаговых векторов можно рассмотреть на примере создания первых векторов, предназначенных для работы с

рестриктазой EcoR1. В ДНК фага λ дикого типа имеется 5 EcoR1-сайтов, причемÐепозиторийтри из них располагаются в центральной части области, где

локализованы несущественные гены, а два са та затрагивают важные гены. Конечно, сайты рестрикции используемые для клонирования, не должны затрагивать существенные гены. Поэтому авторы отобрали жизнеспособные варианты фагов, у которых два последних сайта были изменены. На их основе были созданы векторы серии λgt, п ичем для увеличения их емкости в них была

внесена делеция nin5 размером 2,8 .п.н.

В базовой конструкцииÏолесÃÓλgt сутствуют центральные фрагменты В (4,8 т.п.н.) С (5,5 т.п.н.), поэ ому ее, казалось бы, можно было использовать как

вектор внедрения. Ра мер такого вектора был бы недостаточен для упаковки в фаговую головку, что давало бы возможность прямого отбора рекДНК в виде фаговых частиц. Однако на практике подобные векторы можно использовать, если только предлагаются способы наработки их ДНК. Известны два таких способа: внедрение в вектор плазмидного репликона, или буферных

фрагментов, увеличивающих го до размеров, что обеспечивают упаковку вектора в головку фага.

2. Векторы, зданные на базе ДНК нитевидных фагов

Близкородственные нитевидные колифаги М13, fl и fd обладают однонитевой кольцевой ДНК, состоящей из 6,4 тыс. нуклеотидов, и имеют ряд свойств, позволяющих использовать их в качестве векторов. Во-первых, в их ДНК между генами II и IV есть межгенный участок, в который можно вставлять чужеродные гены. Во-вторых, размер капсида зависит от длины упаковываемой молекулы ДНК, что позволяет клонировать фрагменты ДНК до 15 тыс. нуклеотидов. В-третьих, они образуют фаголизаты с высокой концентрацией и, таким образом, позволяют получить большие количества векторной и клонируемой ДНК. Преимущества однонитевых векторов

являются следствием особенностей их развития.

Генно-инженерные операции с однонитевыми векторами и процедуры по их конструированию ведутся, конечно, с использованием двунитевых

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

введению единичных сайтов рестрикции, а также селективные маркеры. Основная особенность этих векторов – возможность работать с ними и как с плазмидами, используя РФ ДНК, и как с фагами. Доступность клонируемых генов сразу в одноили двунитевой формах значительно облегчает их структурный или функциональный анализ. Получение клонированных генов в однонитевой форме необходимо для секвенирования генов по Сэнгеру, для сайт-специфического мутагенеза и для приготовления гибридизационных зондов. Главный недостаток однонитевых векторов – нестабильность клонируемых в них чужеродных ДНК, обусловленная тем, что фаги с

большими вставками рзвиваются медленнее. Поэтому уменьшение их длины являетсяÐепозиторийфактором селекции. ÏолесÃÓ

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

ТЕМА 10 ХАРАКТЕРИСТИКА АНТИВИРУСНЫХ ПРЕПАРАТОВ

1.Механизм противовирусного действия лекарств.

2.Спектр антивирусного действия и характеристика препаратов.

Для многих вирусных заболеваний (грипп, ВИЧ-инфекция, гепатиты,

осложнений.

ОРВИ, герпес и др.) характерна высокая смертность, тяжелые осложнения и резкоеÐепозиторийснижение качества жизни. Противовирусные средства способны ослабить клинические проявления вирусных нфекций и уменьшить частоту их

Низкая эффективность сов еменных противовирусных средств

объясняется поздним началом химиоте апии, когда вирус уже вступил в фазу максимально активного размн жения. Реже, например, при герпетической инфекции размножение возбуди еля продолжается и после возникновения

клинических признаковÏолесÃÓзаб левания, что повышает эффективность противовирусной фармако ерап .

Вирусы являются внутр клеточными паразитами, размножение которых

в клетках хозяина включает ряд этапов. Основными из них являются:

проникновение вирус в в клетку, интез полимераз вирус-специфических

нуклеиновых кисл т, синтез вирус-сп цифиче ких нуклеиновых кислот (РНК и ДНК), синтез к нечных структурных б лков вируса, сборка вирусных частиц и их выход из клеток.

В зависимости от характера действия противовирусные средства

подразд ляются на:

• препараты, угнетающие проникновение вирусов в клетку;

• средства, бл кирующие синтез вирус-специфических нуклеиновых

кислот;

• препараты, угнетающи синтез вирус-специфических белков.

1.Механизм противовирусного действия лекарств

Противовирусныесредствавмешиваютсявпроцессыпроникновенияиразмн

ожениявирусныхчастиц различными путями. Ряд препаратов действует на вирусные частицы вне клеток хозяина. Так, гамма-глобулин и цитотект содержат специфические антитела к поверхностным антигенам вирусов. Связывая клетки вирусов, препараты тормозят их проникновение в клетки хозяина. Оксолин и теброфен обладают вируцидным действием. Разрушая вирусные частицы на поверхности клеток, препараты препятствуют их

проникновению в клетки хозяина.

Полесскийгосударственныйуниверситет Страница 56

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

Ряд средств вмешиваются в процесс проникновения вирусных частиц. Арбидол накапливаясь в местах проникновения вируса в клетки хозяина подавляет слияние липидных оболочек вирионов с мембраной клеток больного. Амантадин и ремантадин, возможно, предотвращают снижение рН эндосом (мембранных вакуолей, содержащих частицы вирусов) и тем самым тормозят слияние вирусной оболочки с мембраной клеток. Кроме того, препараты, действуя на глюкозидазу, угнетают депротеинизацию вируса гриппа типа В и краснухи. В результате подавляется передача генетического материала вируса в цитоплазму клеток хозяина и останавливается размножение вируса.

Важным процессом размножения вирусов, на который направлено действие препаратов, является синтез вирус-специфических нуклеиновых кислот. Ряд препаратов (зидовудин, абукав р, ганцикловир, фоскарнет, ацикловир,стокрин) блокируют ключевой фермент размножения вирусовобратную транскриптазу (вирус-специф ческую ДНК-полимеразу) и нарушают синтез вирусной ДНК. Вирусная об атная транскриптаза, как правило, в несколько раз чувствительнее к ингиби ующему действию противовирусных средств, чем полимераза ДНК клет к человека. Размножение вируса

“позднихÐепозиторий” структурныхÏолесÃÓбелков нарушается интерферонами (интерлок. реаферон, виферон). Эти препараты стимулируют выработку клетками хозяина

Идоксуридин является аналогом уридина, поэтому действует на этот этап размножения вирус в путем конкур нтного торможения включения уридина в

состав нуклеин вых кислот. Рибавирин угнетает образование

гуанозинмонофосфата, его вк юч ние в нуклеиновые кислоты вирусных частиц. В р зультатеподав яется активность вирусных РНК и репликация новых вирионов.

Отдельные против вирусные средства действуют на конечные этапы репликации вирусов в клетках х зяина – синтез вирус-специфических белков,

сборку выход вирусных частиц из клеток хозяина. Синтез так называемых

ингибиторов ферментов вируса, которые ограничивают процессы

синтезавирусных структурных белков (протеинкиназа нарушает начальный этап пролонгации вирусной пептидной цепи, фосфодиэстеразы разрушают конечные нуклеотиды тРНК, олиго-изо-аденилатсинтетаза активирует РНКазы, вызывая деградацию вирусных иРНК). В итоге блокируется репликация вирусов. Особенностью действия криксивана, атазанавира и саквинавира является угнетение образования вирусных полипротеинов и образованию незрелых вирионов. Ингибируя протеазы вирусных частиц, препараты вызываютзадержку выхода вирусных частиц из клеток хозяина и снижают

количество инфицированных вирусом клеток.

Полесскийгосударственныйуниверситет Страница 57

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

2.Спектр антивирусного действия и характеристика препаратов

Антивирусные средства обладают узким спектром химиотерапевтического действия и способны подавлять репликацию небольшого числа вирусов. Теброфен, идоксуридин, ацикловир, ганцикловир, фоскарнет, рибавирин, виферон, интерлок бактерицидно или бактериостатически действуют на возбудителей герпетических инфекций.

Ремантадин, оксолин, арбидол угнетают проникновение возбудителей

обрываютÐепозиторийпликациюÏолесÃÓвируса и уменьшает разрушение Т-хелперов хозяина. Одновременно с увеличением к личества лимфоцитов растет активность Т-

гриппа, ингавирин и рибавирин – его размножение. Цитотект подавляет проникновение в клетки хозяина возбудителей цитомегаловирусной инфекции, тогдакакганцикловиривифероностанавл вают хразмножение.

ИнтронА, реаферон, виферон подавляют репликацию возбудителей вирусного гепатита. Специальные гамма-глобул ны ингибируют репликацию вируса бешенства, кори, полиомиелита и опоясывающего лишая. Метисазон избирательно угнетает репликацию в збудителей оспы, Зидовудин, криксиван, атазанавир, абукавир, с окрин, из принозин действуют на размножение возбудителей ВИЧ-инфекции. Ингавирин и рибавирин направленно подавляют размножение респираторного синцитиального вируса и аденовирусов, арибавирин еще и вируса ветряной оспы, кори, геморрагической лихорадки и

лихорадки Ласса.

Зидовудин и абукавир применяют для лечения ВИЧ-инфекции, вызванной ретр вирусами иммунод фицита. Обладаясходствомстимидином, ЛВ влимфоцитах чел векафосфорилиру т ядонуклеозид-5трифосфата и после

этого соединяется обратной транскриптазойвируса (ДНК-полимераза).

Включаясь вм сто тимидинтрифосфата в провирусную ДНК, препараты

хелперов и цитотоксичн сть Т-лимфоцитов, уменьшается количество ЦИК и восстанавливается функция макрофагов. Активация функции иммунной системы сопровождается улучшением состояния больных ВИЧ-инфекцией. Клинический эффект при введении 5 мг/кг/сутки проявляется через 6 месяцев терапии (на 20 – 50% снижается летальность, уменьшается частота сопутствующих инфекций, смягчаются клинические симптомы,

восстанавливается трудоспособность и вес больных). У многих пациентов выявляются устойчивые штаммы ВИЧ инфекций. При длительном применении препарата возникают тяжелые побочные эффекты – угнетение костного мозга с тяжелой анемией, гранулоцитопенией, тромбоцитопенией. Криксиван, атазанавир и калетра относятся к новому классу средств для лечения ВИЧинфекции у взрослых и детей старше 2-х лет. Подавляя фермент протеазу в клетках хозяина, препараты препятствуют разрыву полимеразной связи

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

неспособных к инфицированию других клеток. Их назначают больным ВИЧинфекцией при неэффективности зидовудина и зальцитабина или в комбинации с ними. Рекомендуют по 2400 мг криксивана внутрь в сутки. При слабой и умеренной почечной недостаточности доза криксивана должна быть снижена. Стокрин является ненуклеозидным ингибитором обратной транскриптазы. Больным ВИЧ – 1с 3 лет, подросткам и взрослым его назначаютв комбинации с зидовудином и криксиваном.

Ацикловир действует на тимидинкиназу вируса герпеса ,фосфорилирующую гуанозин. Этот фермент вирионов в 30–100

разчувствительнее к действию ацикловира, чемтимидинкиназа человека. ОбразованиеÐепозиторийацикловир - трифосфата ингибирует ДНК-полимеразу и

подавляет синтез вирусной ДНК. Дл тельное введение препарата в вену (15мг/кг в сутки) или внутрь (1000 мг/сутки) способствует заживлению

герпетических повреждений, вызванных в русом герпеса (простым,

злокачественным и опоясывающим). Ацикловир эффективен при генитальном герпесе и герпетическом энцефалите. Слабее препарат влияет на рецидивирующий герпес обол чек слизистых.

антивирусной активности, поэ ому действует на ацикловир-устойчивые формы вируса герпеса. На начается внутривенно в дозе 150 мг/кг/сутки. Идоксуридин тормозит репликацию в руса герпеса в роговице и способствует ликвидации герпетического кератита. С этой целью идок уридин в виде 0,1% раствора апплицируют на р г вицу ( глюкокортикоидами).

Теброфен рименяют при виру ных заболеваниях глаз(аденовирусный конъюнктивит, кератоконъюнктивит, к ратит, вызванный вирусом простого герп са г р сзостер).Его назначают для лечения поражений кожи (простой и рецидивирующий вирус герпеса, опоясывающий герпес, красный плоский лишай). Теброфен сводит пл ские и простые бородавки у детей. Применяют в глазной практике в ф рме 0,5% мази, в дерматологии – 2 – 5% мазь. Ганцикловир фосфорилируется до ганцикловир-трифосфата. Подавляя вирусную ДНК-полимеразу, он прекращает элонгацию цепи ДНК и размножение вирусных частиц в инфицированных клетках. Его вводят в вену (5

Фоскарнет неÏолесÃÓнуждае ся в фосфорилировании для проявления

– 10 мг/кг/сутки) в течение 14 дней при цитомегаловирусной инфекции

(пневмония, желудочно-кишечные формы заболевания). Главные побочные эффекты ганцикловира: лейкопения, нейтропения, тромбоцитопения, нарушения функции почек и судороги.

Ингавирин активен при аденовирусной инфекции, гриппе А и В. Помимо противовирусного действия обладает иммуностимулирующим ипротивовоспалительным эффектом. Повышает содержание интерферона в лейкоцитах, вызывает пролиферацию и дифференцировку цитотоксических NK и T лимфоцитов. Подавляет продукцию провоспалительных цитокинов (ФНО,

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

аденовирусной инфекции. Уменьшает токсические проявления инфекции, укорачивает продолжительность заболевания, снижает частоту осложнений. Назначают 1 раз в сутки в течение 5 дней.

Рибавирин ингибирует репликацию как РНК-, так и ДНК -содержащие вирусы: гриппа типа А и Б, респираторный синцитиальный вирус, вирус кори и ветряной оспы, вирус гепатита Б. Благодаря сходству с нуклеозидами рибамидил в клетках хозяина фосфорилируется,образуярибамидила-трифосфат. Ингибируя инозинмонофосфатдегидрогеназу, препарат изменяет концентрацию ГМФ. Оба эффекта тормозят синтез вирусных ДНК и РНК, не затрагивая обмен нуклеиновых кислот в клетках хозяина. Его применяют при гриппе типа А и Б (3 – 5 дней), респираторном синцитиальном вирусе, ветряной оспе и кори у детей (7 – 14 дней), лихорадке Ласса. Изопр нозин стимулирует продукцию

препаратаÐепозиторийможно ÏолесÃÓназначать 1 раз каждые 3 недели. Специальные гипериммунные гамма-глобулины применяют при бешенстве, опоясывающем

протекающие на фоне иммунодефицита. Наиболее часто им лечат ветряную оспу, корь, паротит, цитомегал ви ус, гепатиты В и С, острый вирусный энцефалит 500 тыс.. Доза препара а – 50 мг/кг/сутки

Оксолинимеетширокийспек рвируцидногодействия:вирусгриппаАиБ,вир

успростого герпеса, опоясывающего лишая, аденовируса. Назначают местно в форме мази. Ремантад н на начают по 200 мг/сутки в течение 2 – 3 дней до начала заболевания и 5 – 7 дней после. Препаратуменьшают проявления гриппа и краснухи.

Метисаз н действует на размножение вируса натуральной оспы вследствие угнетения вирусной РНК-полимеразы или ДНК-полимеразы и подавления сборки структурных б ков. Препарат обладает профилактическим

действи м облегчает течение поствакцинальных осложнений.

Гамма-глобулины. Внутримышечное введение гамма-глобулинов в дозе

0,025 – 0,25 мл/кг массы тела в время раннего инкубационного периода может

тормозить развитие инфекции, вызываемой вирусом кори, гепатита, бешенства

и полиомиелита. Защитный эффект длится от 2 до 3 недель. Инъекции

лишае, гепатите типа В.

Цитотект содержит специфические цитомегаловирусные антитела, которые экстраклеточно соединяются с гликопротеинами оболочки частиц вируса и нейтрализуют частицы свободного вируса, в том числе выходящие из клеток хозяина. Кроме того, цитотект проявляет цитотоксичность по отношению к клеткам хозяина, пораженным вирусом. Применяется при острой цитомегаловирусной инфекции у больных с иммунодефицитом, в том числе новорожденных. Препарат вводят в вену в дозе 50 МЕ/кг/сутки.

Интерлок является очищенным α-интерфероном, неспецифически

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

фагоцитарную активность макрофагов. Препарат применяют для лечения кератита и конъюнктивита, вызванных вирусом герпеса.

Реаферон (рекомбинантный α2– ИФН) обладает противовирусной, иммуномодулирующей и противоопухолевой активностью. Его используют при вирусном гепатите типа В, вирусном конъюнктивите и кератите. Виферон является комплексным препаратом, включающим рекомбинантный α2в– ИФН, витамин Е и С. Препарат применяют при ОРВИ, герпетической и цитомегаловирусной инфекции у новорожденных, детей и взрослых. Назначается для терапии пневмоний, менингитов, сепсиса, острого и

хронического гепатита В, С, Д. Побочных явлений при приеме виферона не

выявленоÐепозиторий. ÏолесÃÓ

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

ТЕМА 11.

СОВРЕМЕННЫЕ РАЗРАБОТКИ В ОБЛАСТИ БОРЬБЫ С НЕИЗЛЕЧИМЫМИ ВИРУСНЫМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ

1.Вирус иммунодефицита человека.

2.Онковирусы.

1. Вирус иммунодефицита человека

(Retroviridae), роду лентивирусов (Lentivirus). Ретровирусы, имеют в структуре вирионов обратную транскриптазу – фермент, с нтезирующий ДНК на матрице РНК вируса. Название Lentivirus п о сход т от латинского слова lente – медленный. Такое название отражает одну из особенностей вирусов этой группы, а именно – медленную и неодинаковую скорость развития инфекционного процесса в макр рганизме. Для лентивирусов также

антигенной изменчивостью, значи ельно превышающей таковую у вируса

гриппа, что является одн м з факторов, затрудняющих разработку методов специфической проф лакт ки болезни. Вирус иммунодефицита человека

(ВИЧ) имеет шар видную форму ( унок 11.1).

ÐепозиторийВирус иммунодефицита человека относят к семейству ретровирусов

характереy длительныйÏолесÃÓинкубаци нный период. ВИЧ обладает выраженной

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

Его диаметр составляет 110 нм. Оболочка вируса имеет форму многогранника, составленного из 12 пятиугольников и 20 шестиугольников. В центре и углах каждого шестиугольника расположена молекула гликозилированного протеина gp120. Всего на поверхности вириона располагаются в виде своеобразных шипов 72 молекулы gp120, каждая из которых связана с внутримембранным белком gp41. Сердцевина ВИЧ похожа на усеченный цилиндр. Под оболочкой находятся матриксный протеин р17, капсидный протеин р24, нуклеокапсидные протеины (р7, р9 и др.), а также протеины протеазы (р10, pll), интегразы (р3132) и обратной транскриптазы

(рбб/р51). Капсид заключает две идентичные копии плюс-нити РНКгенома, содержащиеÐепозиторийструктурные гены gag, pol, env. Ген gag (groupspecificantigen)

кодирует группоспецифические антигены сердцевины, матрикса. Ген pol (polymerase) кодирует обратную транскр птазу, протеазу и интегразу. Ген env (envelope) кодирует образование гликоп оте новой оболочки. Имеются также функциональные гены tat, rev, nef, vif, vpr, vpx, vpu, которые регулируют жизненный цикл вируса. Геном ВИЧ-2 тличается от генома ВИЧ-1 структурой

реплицирующие един цы, звес ные человечеству. Состоя примерно из 15 белков и двух молекул РНК, ВИЧ способен проникать в клетки, реплицируя

гена env и заменой гена vpu на ген vpx. Ретро-вирусы,ÏолесÃÓтакие как ВИЧ, представляют собой наименьшие

свой генетический матер ал формируя ряд прогенных вирусов, способных

заражать другие клетки. Все эти белки кодируются генами gag, pol и env, которые транскрибируются и транслируют я вбольшие белки Gag, Pol и Env с

использованием а парата кл тки-миш ни. ПолипротеинGag содержит следующие структурные бе ки: матричный (MA), капсидный(CA) и

нукл ока сидный (NC), которые важны для вирусной сборки. Белок Pol содержит обратную транскриптазу (RT) и интегразу (IN), обязательных для процессаобратной транскрипции вирусной геномной РНК и интеграции образующейся ДНКв ген м клетки-мишени, тогда как Env содержит поверхностные (SU) трансмембранные (TM) гликопротеины.

Вирусная протеаза (PR) ответственна за созревание предшественников полипротеиновGag и Pol в зрелые вирусные энзимы и структурные протеины. Этот процесс, названный созреванием вируса, связан с морфологическими изменениями вирусной частицы и делает вирусную репликацию инфекционной. Химическое ингибирование или инактивация посредством мутации этой протеазы блокирует инфекционность вируса. Таким образом, ретровирусные протеазы становятся главной мишенью для терапевтического вмешательства в такие заболевания, как СПИД и HTLV-зависимая лейкемия. Общими усилиями ученых HIV-1 PR(EC 3.4.23.16) сделалась одной из наиболее изученных молекул в природе, что привело к быстрой разработке многих эффективных

ингибиторов, уже применяющихся при лечении указанных заболеваний.

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

после нескольких лет интенсивных и успешных исследований, по-прежнему являются перспективными объектами исследований. Наиболее важным является тот факт, что СПИД остается серьезной медицинской проблемой и необходимость в эффективном и легко доступном виростатике по-прежнему существует. Во-вторых, те объемы данных, которые были собраны по структуре, активности и регуляции этих ферментов сделали их превосходной моделью для анализа отношений «стуктура-свойство», механизма действия, фолдинга и эволюции протеолитических энзимов целом.

Структурные белки ретровирусов синтезируются как большие (длинные)

предшественники, которые нуждаются в протеолитическом расщеплении, приводящем к зрелым белкам, обнаруженным в инфекционных вирионах. Кодирующая область для протеазы, ответственной за эти расщепления в ВИЧ

субъединицÐепозиторий. ВнутреннееÏолесÃÓядро ф рм нта (включая каталитическую триаду Asp- Ser/Thr-Gly) образует характерную Ф-петлю, как это описано для схожих

кодированна к 5’- концу pol ORF энз м был идентифицирован как

аспарагиновая протеаза. Аспарагиновые п отеазы – это протеолитические ферменты, найденные и охаракте изованные в животных, растениях и грибах. Структурной особенностью их п след вательности является пара Asp-Thr/Ser- Gly триад, которые прису с вуют в двух доменах фермента и составляют ядро активного сайта. Присутс вие единичн го мотива Asp-Thr/Ser-Gly в первичной структуре предполагаемых ре ровирусных протеаз приводит к мнению, что они относятся к аспараг новым протеазам пепсинового семействаи что они действуют в качестве гомод мера. Ретровирусные протеазы представляют

аспарагиновых протеаз. Карб кси ьные группы остатков аспарагиновых кислот активного сайта из обеих субъединиц практически параллельны. Эта структура фиксируется при пом щи сети в дородных связей, известных как «пожарный захват» (“fireman’sgrip”) в которой каждый атом кислорода боковой цепи, принадлежащий Thr, образует водородную связь с NH-фрагментом трипрофанов главной цепи на противоположной субъединице и отдает водородную связь карбонильному атому кислорода Leu, находящемся в

основной цепи противоположной субъединицы, придавая таким образом значительную стабильность димеру протеазы ВИЧ. Другой важной структурной особенностью, помогающей удерживать обе субъединицы вместе, является наличие скрученной вчетверо антипараллельной β-складчатой структуры, включающей в себя как амино-, так и карбоксильный концы отдельных субъединиц. Полость для связывания субстрата находится между обеими субъединицами и покрыта «крышей» из двух β-шпилек (называемых

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

Ile50 и Ile50’. Эта молекула воды отделена от остальных молекул воды, окружающих фермент, и много подходов к дизайну ингибиторов протеазы связанно именно с заменой этой молекулы воды. Аминокислотные остатки, критичные для активности фермента, были выявлены путем мутогенеза как invitro, так и invivo. Были найдены три области, критичные для активности фермента: каталитическое ядро фермента, мобильная flap-область и домен димеризации на N- и С-концах протеазы.

С поступлением в распоряжение врачей лекарственных средств, способных ингибировать активность обратной транскриптазы, появилась

реальная возможность помочь людям, инфицированным ВИЧ. Среди инфицированных лиц уже в 1989 году заболевших и умерших от СПИДа было только 20%, поскольку для лечения ВИЧнфекции был внедрен первый

предшÐепозиторийств нника. МутацииÏолесÃÓподвержены все вирусные белки, в том числе и те, на которые направлено действие антиретровирусных средств. В результате

антиретровирусный препарат азидот м д н, который вскоре стали

использовать в качестве базисного для всех последующих схем комбинированной терапии.

Однако довольно быстро выяснил сь, что уже через несколько месяцев от

начала применения одного ингиби ра братной транскриптазы (монотерапия)

возникает резистентность ВИЧ к назначенному препарату. Это обусловлено прежде всего тем, что для ВИЧ характерна высокая частота генетических изменений (мутаций) в процессе самовоспроизведения. Частота появления спонтанных мутаций у в русов составляет 10-3–10-4 ошибок/(геном•цикл репликаци ), что на несколько порядков больше аналогичной величины у эукариот. Длина ген ма ВИЧ составля т примерно 104 нуклеотидов. Краткий

мутаций происходит изменение белковой структуры вирусных ферментов и лекарственные препараты теряют способность тормозить их активность. Следовательно, не назначение противовирусной терапии является причиной развития резистентности вирусов, а спонтанные мутации.

Вирусы с устойчивостью к лекарственным препаратам существовали задолго до того, как появились антиретровирусные средства. Однако до встречи

с антивирусным препаратом у таких вирусов не было никаких преимуществ перед другими штаммами ВИЧ. При назначении противовирусных средств мутантные штаммы получают преимущества для победы в конкурентной борьбе за существование. Для успешной борьбы с резистентностью ВИЧ появилась необходимость не только в создании новых антивирусных средств с иными механизмами действия, но и в изменении тактики их применения. Следует лишить резистентные штаммы возможности реализовать свои преимущества при размножении, а это можно сделать при использовании

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

репликации ВИЧ. Ингибиторы протеазы (ИП) Proteaseinhibitors(PIs) Ингибиторы протеазы были созданы после внедрения в клиническую практику ингибиторов обратной транскриптазы. Лекарственные средства новой группы, в отличие от ингибиторов обратной транскриптазы, обладают более селективным действием в отношении вирусной протеазы, и практически не влияют на работу собственной ферментативной системы клетки. Кроме того, поскольку ингибиторы протеазы обладают высокой противовирусной активностью, и действуют на возбудителя в очень небольших количествах, то риск развития побочных эффектов в ВИЧ инфицированных пациентов при их

применении минимален. Они проявляют активность в отношении клинических

ингибиторовÐепозитпротеазыÏолесÃÓперв гоорийп ко ения (индинавир, ритонавир, саквинавир, нелфинавир, азатанавир, ф сампренавир) было установлено, что у вирусов

изолятов как ВИЧ-1, так и ВИЧ -2. Известно, что зараженная ВИЧ клетка

содержит в своем геноме провирус, который с способен производить материал для новых вирусов[2]. Первоначально на в русной РНК синтезируется длинная белковая цепочка. Чтобы получились новые полноценные вирусы, эта цепочка должна 3 разделиться на части - будущие отдельные элементы структуры

разрезать длинную белковую м лекулу-предшественник и образовывать полноценные вирусные белки. Ингибиторы протеазы специфически связываются с участком фермента, который осуществляет «разрезание» вирусного белка-предшественн ка в инфицированной клетке. Ингибиторы

протеазы не дают в м жности формировать я новым вирусным частицам,

поскольку из б льш го белка-пр дш тв нника не образуются белки нужного

размера с ределенными функциями. В результате этого фермент перестает

довольно быстро развивается резистентность к назначаемым препаратам. Возникновение резистентности обусловлено появлением одной или более первичных мутаций, а области активных протеазных зон. По мере увеличения числа мутаций может развиваться перекрестная резистентность к другим ингибиторам протеазы. Второе поколение ингибиторов протеазы (даруннавир, типранавир) сохраняют свою активность при наличии резистентности к препаратам первого поколения. Для появления у ВИЧ резистентности к препаратам второго поколения ингибиторов протеазы требуется аккумуляция множества мутаций.

Индинавир (Indinavir) C36H47N5O4

Белый или почти белый гигроскопичный кристаллический порошок. Хорошо растворим в воде и метаноле.

Является ингибитором протеаз ВИЧ-1 (в меньшей степени ВИЧ-2),

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

приеме натощак препарат быстро всасывается (пища замедляет процесс всасывания). Показан для лечения ВИЧ-инфекции у взрослых, в том числе и в случае резвившейся резистентности к антиретровирусным средствам, ингибирующим активность обратной транскриптазы. Применяют индинавир в комбинации с антиретровирусными препаратами других групп в составе комплексной высокоактивной антивирусной терапии

Ритонавир (Ritonavir) C37H48N6O5S2.

Противовирусное средство, пептидный ингибитор ВИЧ-1 и ВИЧ -2 протеаз. Является ингибитором протеазы, который специфически связывается с

участком фермента, осуществляющего «разрезание» вирусного белкапредшественника в инфицированной клетке. Он обладает селективной способностью ингибировать активность аспарт лпротеаз как ВИЧ-1, так и ВИЧ-2. Ферментное расщепление протеаз делает невозможным активацию белкового предшественника и п ивод т к с нтезу незрелых ВИЧ частиц,

неспособных инициировать дальнейшее азвитие инфекции. В 2014г FDA

США одобрила применение рит нави а для лечения вирусного гепатита С

ингибиторов вирусной протеазы. Его применяют для ингибирования изофермента печени цитохрома Р450 (CYP3A4), который обычно

метаболизирует и безврежива т ингибиторы протеаз. Препарат на

молекулярном ур вне ингибиру т этот цитохром, потому низкие дозы можно использовать для усиления д йствия других ингибиторов протеаз, путем стабилизации их концентрации в крови. Назначают ритонавир для лечения

ÐепозиторийСаквинавир (Saquinavir)ÏолесÃÓC38H50N6O5.

Саквинавирамезилат– белый или почти белый порошок, растворимость в воде при 25 °C – 2,22 мг/мл, молекулярная масса 766,96.Является первым селективным ингибитором протеазы ВИЧ, которая обладает способностью

расщеплять белки-предшественники в инфицированных клетках, что является важнейшим этапом образования окончательно сформированных вирусных частиц. Вирусные белки-предшественники содержат участки расщепления, которые распознаются только протеазой ВИЧ и близкородственными 7 вирусными протеазами. Саквинавир стимулирует такие участки расщепления, в точности приспосабливаясь к активным участкам протеазы ВИЧ-1 и ВИЧ-2, и действует как обратимый и селективный ингибитор. Сродство саквинавира к протеазе ВИЧ приблизительно в 50 000 раз выше, чем к протеазам человека. Саквинавир блокирует формирование инфицированных вирусных частиц и,

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

применении саквинавира, особенно в случае монотерапии, развивается резистентность возбудителей, что обусловлено мутацией гена вирусной протеазы (кодон 90, кодон 48).

Нелфинавир (Nelfinavir)C32H45N3O4S.

Непептидный ингибитор протеазы ВИЧ-1 и ВИЧ-2. Обратимо связывается с активным участком ВИЧ-протеазы. Препятствует расщеплению полипротеинов, что приводит к образованию незрелых вирусных частиц, неспособных к инфицированию других клеток, замедляет прогрессирование

заболевания. Он снижает вирусную нагрузку и увеличивает количество лимфоцитов CD4 в крови. Применяется нелфинавир для лечения пациентов с ВИЧ-инфекцией в составе комплексной терапии.

участкамиÐепозисвязыванияÏоторипротеазылесÃна вирусныхйÓ белкахпредшественниках (молекула точно соответствует активным участкам протеазы ВИЧ−1 и ВИЧ−2). Ингибирует активность протеазы ВИЧ, расщепление вирусных белков-

способность вирусной протеазы расщеплять пол протеины-предшественники, необходимые для репликации ви уса. Амп енавир является избирательным

ингибитором репликации ВИЧ-1 и ВИЧ-2.

Фосампренавир сам не бладает противовирусной активностью. В

организме человека он гидролизуе ся бразованием неорганического фосфата и фармакологически акт вного ампренавира, который блокирует способность вирусной протеазы расщеплять полипротеины-предшественники, необходимые

фосампренавир для лечения ВИЧ-инфицированных взрослых пациентов и

Атазанавир (Atazanavir)C38H52N6O7.

Явля тся азапептидным ингибитором протеазы ВИЧ. Селективно

ингибирует вирус-специфический процессинг вирусных Gag-Pol протеинов в

ВИЧ-инфицированных клетках, предотвращая образование зрелых вирионов и

заражение других клеток.Препарат взаимодействует со специфическими

предшественников в инфицированных клетках и образование активных белков, необходимых для окончательного формирования вирусных частиц, способных вызвать инфекционный процесс. Поскольку атазанавирметаболизируется в основном изоферментом CYP3A4, поэтому не рекомендуется принимать его вместе с препаратами, индуцирующими активность изофермента (препараты зверобоя) и лекарственными средствами, являющимися субстратами изофермента CYP3A4 цитохрома P450 с узким терапевтическим диапазоном (астемизол, терфенадин, цизаприд, пимозид, хинидин, алкалоиды спорыньи,

особенно эрготамин и дигидроэрготамин).

Полесскийгосударственныйуниверситет Страница 68

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

Дарунавир (Darunavir) C27H37N3O7S.

Является селективным ингибитором димеризации и каталитической активности протеазы ВИЧ-1. Избирательно ингибирует расщепление полипротеиновGag-Pol ВИЧ в инфицированных клетках, предотвращая образование полноценных вирусных частиц. Дарунавир устойчив к мутациям, вызывающим резистентность к ингибиторам протеазы. После приема внутрь дарунавир быстро абсорбируется из желудочнокишечного тракта. Cmax в плазме крови достигается через 2,5-4,0 ч. Характерно, что концентрация

дарунавира в плазме была выше у пациентов, инфицированных ВИЧ-1, чем у здоровых людей. Это обусловлено тем, что у лиц, инфицированных ВИЧ-1, в крови выше концентрация α1-кислого гликопротеина, с которым связывается ингибитор протеазы. Связывание дарунав ра с белками плазмы составляет около 95%. Дарунавир интенсивно метабол з руется в печени в основном

ÐепозитПрежде всегоÏолесÃÓ, раннееориначало противовируснойй терапии, которое повышает эффективность сокращает продолжительность терапии. Перед

изоферментами CYP3А4. Ритонавир нг б рует изоферменты CYP3A4 в

печени и, тем самым, существенно повышает концентрацию дарунавира в плазме.

Типранавир (Tipranavir)C31H33F3N2O5S.

инфицированию других клеток. При приеме внутрь максимальная концентрация в плазме достига тся в т ч ние 1-5 ч и ее величина зависит от

дозы. Ти ранавир п чти полностью вязывается с плазменными белками

(>99,9%). Пре арат находится в организме в неизменном виде и мало метаболизиру тся ферментами. Применяют типранавир для лечения пациентов, инфицированных ВИЧ, в ставе комплексной терапии. Весьма часто его комбинируют с 14 ритонавир м, который в низкой дозе способствует достижению эффективн й к нцентрации типранавира в плазме.

началом лечения ХГС должна быть определена причинно-следственная связь

между инфицированием вирусом гепатита С и поражением печени. Выявление

такой связи позволяет исключить возможность поражения печени, обусловленное сопутствующей патологией (метаболический синдром, хронический алкоголизм, аутоиммунные и другие заболевания). До начала лечения необходимо оценить тяжесть поражения печени, то есть необходимо установить, есть или нет у пациента цирроз печени. Его наличие может изменить тактику проведения противовирусной терапии. Обязательным условием осуществления терапии является оценка функции почек с определением креатинина сыворотки крови и скорости клубочковой

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

схемы противовирусной терапии основывается на анализе ожидаемой эффективности, безопасности режима терапии и экономической целесообразности применения той или иной схемы лечения. В настоящее время внедрение новых схем безынтерфероновой терапии с использованием противовирусных препаратов прямого действия в РФ затруднено из-за слишком высокой стоимости этих препаратов. Поэтому в условиях ограниченного экономического ресурса применение схем комбинированной терапии ВГС при помощи препаратов интерферона в сочетании с рибавирином сохраняет свою актуальность. Показанием к началу проведения противовирусной терапии

гепатитом С (2017) предусматривается возможность отсрочки начала противовирусной терапии у пациентов с ост ым гепатитом на 8–12 недель от начала заболевания из-за возможности спонтанного выздоровления. Пациенты с острым гепатитом С (ОГС) п лучают м нотерапию препаратами интерферона без рибавирина. Курс терапии с с авляет 24 недели. Контроль эффективности

осуществляют на 12-й и 24-й неделе п сле окончания лечения.

терапию осуществляютÏолесÃÓпринципу «терапия согласно вирусологическому ответу», то е сть длительность курса терапии определяется сроком получения вирусологического ответа, который оценивается на 4-й неделе лечения

При лечении ОГС можно акже прибегнуть к пангенотипической схеме

использования препаратов прямого действия: комбинации софосбувира и даклатасвира в течен е 8 недель. При наличии ВИЧ-инфекции или уровня РНК ВГС > 1 млн МЕ/мл курс может быть удлинен до 12 недель. При проведении

противовирусн й терапии паци нтам ХГС необходимо выполнить

вирусологические тесты (установить уров нь РНК ВГС, генотип и субтип ВГС, выявить наличие вируса гепатита В и D), определить степень поражения печени с помощью эластометрии на аппарате FibroScan или с помощью ФиброТеста,

эффективности и обеспечения без пасности терапии.

При лечении ХГС препаратами интерферона (ИФН) противовирусную

(быстрый вирусологический ответ), 12-й неделе (ранний вирусологический ответ) и 24-й неделе (медленный вирусологический ответ). Если ответ наблюдается на 4-й и 12-й неделе от начала терапии, то продолжительность лечения для пациентов со 2-м генотипом вируса и вирусной нагрузкой ниже 800 000 тыс. МЕ/мл может составить 16 недель, а для пациентов с 3-м генотипом и такой же вирусной нагрузкой – 24 недели. При вирусной нагрузке более 800 000 тыс. МЕ/мл независимо от вирусологического ответа и генотипа вируса оптимальным является курс терапии 72 недели. У пациентов с вирусной

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

только на 24-й неделе; если вирусологический ответ регистрируется на 24-й неделе, рекомендуемая продолжительность терапии составляет 72 недели. В настоящее время появились сообщения о циркуляции среди больных ХГС нового варианта 2-го генотипа. Этот вариант генотипа образовался в результате комбинации генотипа 1 и генотипа 2 вируса гепатита С и приобрел свойства генотипа 1.

Диагностические тест-системы определяют комбинированный вариант генотипа как генотип 2. В связи с этим пациентам с генотипом 2 рекомендуется проводить противовирусную терапию препаратами ИФН с длительностью

курса, соответствующей генотипу 1 ВГС. В процессе противовирусной терапии ХГС ведут динамическое наблюдение, включающее два направления: оценку эффективности терапии и контроль разв т я нежелательных явлений. Активность АЛТ для выяснения биох м ческого ответа определяют в те же сроки, что и РНК ВГС. Клиническ й анал з крови с подсчетом числа тромбоцитов и других форменных элементов крови осуществляют через 2, 4 недели от начала лечения и затем 1 аз в 4 недели до окончания лечения. Один раз в 3 месяца исследуют ур вень тиреотропного гормона и свободного тироксина. Дозу ИФН снижают при развитии таких нежелательных явлений, как депрессия, уменьшен е абсолю ного числа нейтрофилов ниже 750/мм3 и снижение уровня тромбоц тов менее 50 000/мм3. Если количество нейтрофилов становится ниже 500/мм3 , а тромбоцитов менее 25 000/мм3 ИФН отменяют. Дозу рибавирина снижают на 200 мг за один прием, если у пациента

рибавирина уменьшают при пад нии г моглобина на > 20 г/л от исходного. Использование интерферонотерапии в сочетании с противовирусными препаратами прямого действия позволяет повысить ее эффективность, сократить ее длительн сть, а следовательно, значительно уменьшить число побочных явлений. У пациент в с 1-м генотипом ВГС применяют такие препараты, как симепревир (курс – 48 недель), нарлапревир (курс – 24 недели).

ÐепозиторийКомбинация ИФНÏолесÃÓсимепревиром более мягкая по сравнению с нарлапревиром и не дает побочных эффектов, требующих отмены терапии.

Пациентов с генотипом 1 ВГС можно лечить в течение 24 недель комбинацией ПегИФНα, вводимого 1 раз в неделю, рибавирина, даклатасвира и асунапревира, назначаемых ежедневно. Данная схема терапии может применяться как у пациентов без цирроза печени, так и с компенсированным циррозом. Эффективность оценки противовирусной терапии при использовании противовирусных препаратов прямого действия должна проводиться с помощью высокочувствительных тест-систем. Так, при интерферонотерапии в комбинации с симепревиром оценку осуществляют на 4- й неделе и, если уровень РНК ХГС > 25 МЕ/мл, лечение прекращают.

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

наиболее эффективный метод лечения ХГС с меньшим развитием побочных эффектов. Обязательным условием их применения является анализ терапии, которую может получать пациент по поводу сопутствующих заболеваний. Это необходимо для учета лекарственного взаимодействия противовирусных препаратов прямого действия и препаратов, получаемых пациентом.

Рекомендуется, если есть возможность, отменить или заменить лекарственные препараты, назначенные для лечения сопутствующих заболеваний, с целью уменьшения риска неблагоприятного лекарственного взаимодействия (информация о лекарственных взаимодействиях более 700

ÐепозиторийК сожалениюÏолесÃÓ, в РФ имеется только одна схема терапии противовирусными препаратами прямого действия, которая может

препаратов представлена на сайте http:// www.hep-druginteractions.org).

Противовирусные препараты прямого де ствия запрещается назначать совместно с лекарственными средствами, кл ренс которых зависит от

цитохрома Р450. При взаимодейств с эт ми препаратами значительно

снижается концентрация препаратов п ямого действия, а следовательно, снижается эффективность терапии. Те апия противовирусными препаратами

прямого действия является к мбини ванной, то есть назначаются два

препарата или один комбинир ванный препарат, причем эти препараты должны иметь различные точки приложения на процессы репликации ВГС.

Так, например, препарат софосбувир представляет собой ингибитор полимеразы, а препарат, в сочетании с которым он используется, даклатасвир – ингибитор NS5A-комплекса. При использовании препаратов, близких по своему действию на репликативный проце ВГС, уменьшается эффективность

противовирусн й терапии.

При назначении противовиру ной терапии препаратами прямого действия необходимо также учитывать их метаболизм. Если препараты

противовирусных препарат в прямого действия является оценка степени поражения печени.

использоваться у пациентов декомпенсированным циррозом печени – это комбинация софосбувира и даклатасвира. Зарегистрированные в РФ препараты прямого действия представлены в табл. 1. При лечении противовирусными препаратами прямого действия без интерферона у пациентов с генотипом 1 ВГС необходимо определять подтип генотипа. От подтипа генотипа 1 зависит длительность и эффективность терапии. При 1в подтипе длительность курса колеблется от 8 до 12 недель. У пациентов без цирроза она составляет 8 недель,

у пациентов с циррозом – 12.

При проведении противовирусной терапии пангенотипными препаратами не требуется определение генотипа вируса. Длительность курса колеблется

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

печени. При лечении пациентов с сопутствующим гепатитом В используют те же схемы, что и для пациентов с ВГС-моноинфекцией (табл. 2).

внепеченочными пр явлениями курс терапии должен быть не менее 12–24 недель. Пациенты бычно хорошо п р но ят лечение противовирусными препаратами рям го действия. Выраж нных побочных эффектов, требующих прекращ ния л чения, практич ски не наблюдается. Наиболее часто пациенты жалу тся на тошноту, абость, головную боль, усталость. Мониторинг эфф ктивности против вирусн й терапии препаратами прямого действия в процессе лечения не пр в дят. Однако в Российских рекомендациях по диагностике лечению взрослых больных гепатитом С от 2017 г. оценку РНК ВГС в сыворотке крови рекомендуют выполнять до начала лечения, на 2-й неделе (оценка приверженности лечению), 4-й, 12-й или 24-й неделе (в конце лечения для пациентов, получавших лечение на 12 или 24 недели соответственно) и на 12-й или 24-й неделе после завершения лечения. Окончательную оценку осуществляют на 48-й неделе.

По результатам оценки устойчивого вирусологического ответа (УВО) на 48-й неделе после окончания лечения пациенты без цирроза печени могут быть сняты с диспансерного наблюдения, если у них нормальный уровень АЛТ и неопределяемый уровень РНК в сыворотке крови, оцененные методом ПЦР на высокочувствительных тест-системах (< 15 МЕ/мл). Пациенты с циррозом печени остаются под наблюдением из-за риска возможного развития первичного рака печени. В процессе динамического наблюдения им 1 раз в год

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

Уровень α-фетопротеина кратен его повышению от исходного. Если при проведении контрольного УЗИ брюшной полости определяется гомогенное образование в печени или кратность повышения α-фетопротеина превышает 1– 1,5 раза от исходного, рекомендуется консультация гепатохирурга по поводу дополнительного обследования для исключения первичного рака печени.

1908 г. В. Эдлерман показал, что фильтрующиеся агенты вызывают лейкозы у кур. Затем аналогичные агенты были выделены П. Раусом в 1911 г. из куриной саркомы. В 1933 г. Р. Шоуп установил фильтруемость возбудителя папилломы и рака кроликов. В 1936 г. Д. Биттнер – рака молочной железы у

мышей. В начале 40-50 г. было окончательно доказано, что все ранее открытые фильтрующиеся агенты являются вирусами. В 1946 г. А. Зильбер сформировал теорию вирусного канцерогенеза. В 1951 г. А. Гроссе открыл вирус лейкоза мышей.

опухолÐепозвых кл точныхÏолесÃÓиторийкультур и возможной роли онкогенных РНК-вирусов. В настоящее время известно уже более 200 вирусов – возбудителей

2. Онкови усы

В 1957 г. С. Стюарт о крыл вирус полиомы мышей. В 1960 г. из культур клеток почек обезьян резус был выделен вирус SV-40. В начале 60-х г. была доказана возможность онкогенной трансформации клеток in vitro, индуцированных вирусами культур клеток. В настоящее время установлена вирусная природа ряда опухолей млекопитающих и птиц. Многие онкогенные вирусы получены в клет чных культурах, хорошо изучены в морфологическом

лейкозов у животных, вх дящих в состав разных семейств и 2 вируса – вызывающие Т-лейкозы человека.

Вирусная этиология большинства форм рака, сарком, лейкозов человека – остается гипотезой. Сейчас можно считать установленной вирусную этиологию рака шейки матки и некоторых других опухолей урогенитального тракта.В 1946 г. А. Зильбер впервые сформировал теорию вирусного канцерогенеза.

Основные положения этой теории:

•Геномы вирусов в виде провируса встраиваются в хромосомный аппарат клетки, вызывая ее трансформацию и создавая опухолевый фенотип.

•Вирус наследственно превращает нормальную клетку в опухолевую.

•Опухолевое действие вирусов на клетки принципиально отличается от инфекционного действия.

•Вирус не играет роли в размножении возникших клеток.

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

встраиваться в клеточный геном в виде провируса. Трансформированные клетки приобретают ряд новых свойств (способность вызывать злокачественные опухоли у лабораторных животных).

Серьезным возражением против теории Л. А. Зильбера явилось открытие большого числа онкогенных РНК-содержащих вирусов (онкорнавирусов), вызывающих опухоли у птиц и млекопитающих. РНК этих вирусов не могла встраиваться в клеточную ДНК соглавно триаде ДНК – РНК – белок. Однако в 1940г. после открытия обратной транскриптазы (РНК-зависимая ДНКполимераза), была доказана возможность образования на матрице Вирусной

РНК ее ДНК-копии.

остроконечныеÐепозиторийкондиломыÏолесÃÓ, папилломы гортани. Предположительно вирус принимает участие в развитии злокачественных новообразований мочеполовых

Молекулярно-генетические исследования вируса саркомы Рауса позволили выявить конкретный ген, ответственный за трансформацию клеток. В настоящее время выявлено более 20 так х генов. Они получили название онкогенов. В геноме клеток всех о ган змов существует набор генов, аналогичных вирусным онкогенам по последовательности нуклеотидов – протоонкогены., что на определенных этапах эмбриогенеза протоонкогены

доброкачественных эпителиальных опухолей: кожные бородавки,

путей и других форм рака. Особенно высокой трансформирующей активностью обладают 11, 16, 18 и 30 серовары, геномы которых обнаруживаются в клетках остроконечных кондилом, карцином шейки матки и гортани, бородавчатой эпидермодисплазии.

Полиомавирус обнаружен в латентном состоянии в хромосомах различных млекопитающих. У человека развития опухолей не вызывают, однако при введении новорожденным мышам, крысам, кроликам вызывают саркомы и карциномы. Вирус симиан 40 или ОВ вызывают острые вакуолизирующие нефриты у зеленых мартышек. Вирусы ВК и JC вызывают поражения (нефриты) только у лиц с иммунодефицитами.

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

240 нм, сложноорганизованный. Геном – двунитевая кольцевая ДНК. Герпесвирусы трансформируют клетки invitro, их геномы обнаружены в различных опухолях. Вирус герпеса 4-го типа (Эпштейн -Барр) вызывает лимфомуБеркитта и назофарингеальную карциному. ВПГ 2-го типа – рак шейки матки и опухоли урогенитального тракта.

Семейство Poxviridae вирионы кирпичеобразной формы с закругленными углами, размер 200-300 нм, сложноорганизованный. Геном – двунитевая кольцевая ДНК. Для человека онкогенен вирус контагиозного малюска, вызывающий одноименное заболевание.

Семейство Adenoviridae, вирионы сферической формы, размер 70-90 нм, симметрия кубическая, организация простая. Геном – двунитевая кольцевая

ДНК. Обладают онкогенным действием у ж вотных.

короткимÐепозиторийинкубационнымÏолесÃÓпериодом.Вирусы умеренной активностью вызывают неоплазмы п сле длительного инкубационного периода.

Семейство Hepadnaviridae может обуславл вать развитие первичного рака

печени.

Онкогенные РНК – геномные ви усы.

Их онкогенный потенциал бусл влен наличием обратной транскриптазы

(РНК-зависимая ДНК-полимераза).

Семейство Retroviridae

Род Oncoviridae

Выделяют 3(4) группы – А,В,С,Д. К типу А относят ефектные вирусные

частицы или незрелые формы других онковирусов.Вирионы разнообразной формы, размер 90-130 нм, сложноорганизованные.Онковирусы типа С вызывают лейк зы и саркомы у животных. Н-р: вирус Рауса вызывают саркомы

у птиц, млек итающих.Онковирусы типа В – рак молочных желез мышей, лейкоз морских свинок.Онковирусы типа Д – рак молочных желез обезьян, рак гортани ч лов ка.Высокоактивные вирусы индуцируют новообразования с

По характеру распр странения выделяют:

• Экзогенные ретровирусы – аспространяются горизонтально. К ним относят: вирус саркомы Рауса, Т - лимфотропные вирусы человека I и II типа.

• Эндогенные ретровирусы – распространяются вертикально.

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

ТЕМА 12 ЭВОЛЮЦИЯ ВИРУСОВ

1.Происхождение и филогения вирусов.

2.Эволюция вирусов.

3.Молекулярные механизмы изменчивости вирусов.

1. Происхождение и филогения вирусов

результаты анализа вирусных генов и белков дают повод надеяться, что в будущем удастся объяснить происхождение вирусов, их филогению и коэволюцию с хозяевами. В свою оче едь, на основе реконструированной филогении вирусов можно будет аз аботать их объективную классификацию.

Поскольку филогения вирус в тн сится к сфере макроэволюции, ее

невозможно моделировать опы ным путем. Косвенными подходами к решению этой проблемы служат секвенир вание и сравнительный анализ геномов у максимально возможного ч сла вирусов.

В настоящее время господствует мнение, что вирусы полифилетичны, и их филогения имела ра ный сценарий. Поэтому невозможно реконструировать единую фил гению вирусов; более того, невозможно реконструировать филогению вирус в на уровне отдельных классов или даже семейств.

Графическая схема, тражающая эволюцию вирусов, не похожа на

ÐепозиторийЭволюционные аспекты вирусологии – самые проблемные, хотя

Гипотеза 1. ВÏолесÃÓупрощенном виде она сводится к тому, что современные вирусы произошли от эндопаразитов исходно клеточным строением, которые

однокорневое древо клеточной жизни. В отличие от более или менее убедит льной реконструкции протоклетки (англ. progenote; last uпiversal

common ancestor), давшей нача трем стволам глобального древа живых

организмов – Bacteria, Archaea и Eucarya, невозможно реконструировать гипотетического прот вируса.

В настоящее время обсуждаются три гипотезы происхождения вирусов;

их доказательная база сильно различается.

потеряли большинство информационных и операционных генов, однако частично сохранили механизмы, обеспечивающие инфицирование хозяина и репродукцию в его клетках. Очевидно, что эта гипотеза мало убедительна, поскольку ей противоречат богатейшее разнообразие вирусов и отсутствие кандидата на роль протовируса.

Гипотеза 2 (вирусы как потомки субклеточных структур). Согласно ей, вирус – это обладающая наследственной информацией органелла (хромосома или рибосома), которая приобрела способность к паразитической репликации в

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

гипотеза более правдоподобна, по крайней мере, в отношении ДНКсодержащих вирусов. Однако она не может объяснить происхождение РНКсодержащих вирусов из-за отсутствия сходства между их геномами и рибосомной РНК.

Гипотеза 3 (вирусы, как самостоятельно возникшие живые существа,

альтернатива живой клетке). В настоящее время эта гипотеза самая популярная и наиболее аргументированная. Она постулирует, что вирусы эволюционировали совместно с клетками с момента возникновения органической жизни. Ее более радикальный вариант предполагает, что вирусы возникли раньше клеток и даже могли быть их предками.

Основанием для таких предположений в первую очередь служат результаты анализа геномов «гигантск х» ядерно-цитоплазматических ДНК-

содержащих вирусов (англ. nucleo-cytoplasmic large DNA viruses; NCLDV). У

одного из семейств этой группы – Mimiviridae, самые крупные (для вирусов)

геномы, и продукты некоторых генов даже участвуют в трансляции.

несмотряÐепозиторийна значительную внутреннюю дивергенцию (ее представители различаются многим признакам и инфицируют взаимно удаленных хозяев),

К группе NCLDV принадлежат семейства Ascoviridae (вирусы насекомых,

(вирусы амеб и жгут коносцев), Nimaviridae (представители этого семейства

вызывают летальную нфекц ю у креветок), Phycodnaviridae (вирусы

водорослей) и Poxviridae (на более известным представителем этого семейства служит вирус натуральн й оспы).

Максимальный размер генома у виру ов NCLDV составляет 1200 тыс. п.н. Для сравнения – у бактерий самый маленький геном, 145 тыс. п.н., имеет облигатный симбионт цикадок «Candidatus Hodgkinia cicadicola.»Число кодиру мых б лков у них приб ижается к 1000 (в то время как протеом облигатной патогенн й бактерии Mycoplasma genitalium насчитывает 470

белков).

Группа NCLDV служит редким примером монофилетичности у вирусов;

Установлено, что геном общего предка вирусов NCLDV содержал 47 обязательных генов, которые отвечали за основополагающие функции: репликацию ДНК, транскрипцию и сборку вирионов. Дальнейшая судьба данных генов в разных эволюционных линиях (подгруппах) оказалась различной.

Все вирусы группы NCLDV имеют 9 кор-генов (группа I); еще 22 гена (группа II) обнаружены у представителей, по крайней мере, трех семейств. Анализ инфраструктуры этих генов позволяет проследить эволюцию данной

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

Как показывает филогенетический анализ, отдельные подгруппы в группе NCLDV диверrировали раньше, чем родоначальники основных эволюционных ветвей (царств) ядерных организмов, т.е. 2 – 3 млрд. лет назад. Интересно, что у всех NCLDV кор-rены расположены в центральном участке геномной ДНК, а гены, приобретенные путем горизонтального переноса – преимущественно на флангах.

Точки зрения на эволюцию этих вирусов противоречивы. Существуют альтернативные, в равной степени обоснованные гипотезы:

1) дивергентная потеря генов из состава исходно большого предковоrо

новых генов от разных доноров путем гор зонтального переноса.

вирусного (или даже клеточного) генома, Ðепозиторий2) приобретение исходно небольшим предковым геномом все новых и

С эволюционной точки зрения очень важно, что отдельные гены вирусов NCLDV обладают низким сходством с х о тологами у эукариота-хозяина, но зато хорошо группируются д уг с другом. Следовательно, роль

горизонтального переноса ген в т х зяина относительно невелика, что

противоречит сценарию эв люции этих вирусов путем приобретения

эукариотных генов.ÏолесÃÓВ то же время мн гие гены в геномах фиковирусов и,

особенно, мимивирусов меют явно бактериальное происхождение. Хозяева мимивирусов (амебы) – пр родный реактор, в котором фагоцитируемые микроорганизмы интенс вно обмениваются генами. Внутри фагосом

мимивирусы п ст янно встречаются бактериями, что создает предпосылку

для эволюции вирусных геномов благодаря горизонтальному переносу бактериальных ген в.

Независимо от того, буд м мы считать вирусов потомками клеток,

генетич ски обособившимися частями клетки или альтернативными живыми сущ ствами, следует признать, что их экологическая роль и значение в

эволюции клеточных организм в громны.

2. Эволюция вирусов

Биологическая эволюция – это процесс накопления изменений в

организме и увеличение их разнообразия во времени.

Вирусы – это не организмы, это неклеточные формы жизни, основой которой является функционально активный геном. На генетическом уровне эволюция представляет собой накопление изменений в генетической структуре популяций и включает два этапа: первоначально происходит возникновение изменений в результате известных молекулярных механизмов изменчивости, затем их накопление и закрепление в популяции под действием естественного отбора.

Вирусы, являясь генетическими паразитами и представляя собой

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

мира и обладают необходимыми атрибутами жизни – наследственностью и изменчивостью, а также подвержены естественному отбору. Изменчивость вирусов затрагивает различные биологические свойства – морфологию, антигенную структуру, иммуногенность, тканевой тропизм, патогенность, круг восприимчивых хозяев, биохимические свойства, устойчивость к физическим и химическим воздействиям. Основу наследственной изменчивости вирусов составляют изменения их генетического материала.

3. Молекулярные механизмы изменчивости вирусов

вирусов несут в качестве генетического матер ала ДНК, 80% – РНК. Как генетический материал ДНК и РНК обладают разным эволюционными возможностями, так как с разной эффект вностью реализуют внутренние источники наследственной изменчивости. Внутренними источниками изменений являются спонтанные генные мутации и рекомбинационные процессы, включающие ин еграци нные взаимодействия с геномом хозяина.

Мутации (точковыеÏолесÃÓи мн жественные) представляют собой изменение генетического кода в резуль а замены (транзиции, трансверсии), выпадения

(делеции) или вставки ( нсерции) одного или нескольких нуклеотидов в геномной последовательности. Большинство мутаций носит нейтральный характер. К изменению фенотипа ведут только мутации, затрагивающие функционально активные последоват льно ти белковой молекулы.

В естественных условиях размнож ния движущей силой изменчивости вирусов являются спонтанные мутации, частота которых существенно

варьиру внутри различных генетических групп вирусов. Скорость

ÐепозиторийВирусы имеют полифилетическое происхождение. В связи с этим, 20%

спонтанных мутаций в ДНК-ген мах чрезвычайно мала и составляет 10-8 – 10-11 на цикл репликации независимо от размера генома, в РНК-геномах эта величина составляет 10-3 – 10-4. Относительно низкая мутабельность ДНКгеномных вирусов компенсируется высокой численностью вирусных популяций (108 – 109 вирионов в мл тканевой суспензии), где имеет значение не столько частота возникновения мутаций, сколько их абсолютное количество.

Сами по себе мутации, изменяющие генетические признаки отдельных вирусных частиц не могут привести к изменению наследственных свойств вирусной популяции в целом. Для этого необходим второй фактор – селекция, или направленный отбор мутантов, обладающих преимуществами для размножения в измененных условиях. Классическим примером выживания вируса за счет присутствия в популяции мутантов является выработка устойчивости к противовирусным препаратам. Другим широко известным проявлением естественной изменчивости вирусов является изменение антигенной структуры вируса гриппа A. В этом случае основной причиной

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

антигенный дрейф, который используется вирусом как механизм ухода из-под иммунологического надзора.

Рекомбинация – физическое взаимодействие между вирусными геномами в смешанно-зараженной клетке, при котором потомство, называемое рекомбинантами, содержит последовательности нуклеотидов, происходящие от обоих родителей.

У ДНК-содержащих вирусов внутримолекулярная рекомбинация является основной причиной эволюционных изменений и происходит обычным образом по механизму разрыв-воссоединение. Кроме этого, источником наследственной

вирусной инфекции.

изменчивости вирусов может служить включение в вирусный геном генетическогоÐепозиторийматериала хозяина, которое наблюдается при интегративной

У РНК-геномных вирусов в основе внутр молекулярной рекомбинации лежит механизм смены матрицы путем так называемого «прыжка» РНКполимеразы на гомологичную область нуклеотидной последовательности. Рекомбинационные взаимоотн шения м гут наблюдаться на уровне одного

вируса, между разными серо ипами вируса и между разными вирусами.

Реассортация ÏолесÃÓ– перераспределение фрагментов сегментированного генома, является разнов днос ью рекомбинации. При реассортации вирусы с сегментированным геномом обмениваются сегментами, в результате у потомства, называемого реассортантами, в геном входят гены каждого из родителей. У вирус в с сегментированным геномом при реассортации сегменты перемешиваются случайным образом. Наиболее вероятно, что обмен происходит на стадии морфог н за при у ловии двойного инфицирования клетки разными штаммами вируса. Явл ние реассортации в естественных условиях широко распространено у реовирусов, ротавирусов, бирнавирусов, вирусов гриппа. В м с учае, ес и в результате реассортации произошла замена гена, определяющего антигенные характеристики вируса, и образовавшееся потомство при бретает новые антигенные свойства, речь идет

об антигенном шифте.

Реассортация генов при смешанном инфицировании клеток вирусами разной видовой специфичности может служить причиной возникновения

реассортантов не только новыми антигенными свойствами, но и с новым эпидемическим потенциалом, дающим возможность реассортантам преодолевать межвидовые барьеры (межвидовая трансмиссия, переход от одного вида хозяина к другому). В общебиологическом смысле межвидовая трансмиссия – процесс смешения популяций, приводящий к нарушению их изоляции, влекущий за собой одно-, или двусторонний обмен генами и приводящий к увеличению запасов наследственной изменчивости популяций за счет поступления генов из генофонда другой популяции. Явление межвидовой

Неклеточные инфекционные агенты микроорганизмов, животных и человека

источников формирования пандемичных штаммов. Известные в настоящее время пандемичные штаммы вируса гриппа A возникли в результате реассортации генов вируса гриппа человека и вируса гриппа птиц при смешанной инфекции в организме свиней. Для ротавирусов человека показано появление новых штаммов, связанных с трансмиссией от кошек, свиней, собак, овец, крупного рогатого скота. Реассортанты, несущие гены ротавирусов животных, привнесли в популяции ротавирусов человека новые серотипопределяющие гены.

ÐепозиторийÏолесÃÓ