Микра_Практ
.pdf
82
элективную жидкую среду предотвращают рост сопутствующих микро
организмов, которые могли бы использовать продукть1 метаболизма или
даже автолиза первичной культуры и, таким образом, позволяют полу
чить обогащенную накопительную культуру.
При получении накопительных культур лучшим материалом для инокуляции служат субстраты, в которых происходит естественное «обо гащение». Так, например, для выделения микроорганизмов, окисляющих нефтепродукты, - это почвы, загрязненные нефтью; для выделения мик роорганизмов, способных использовать органические соединения, загряз няющие сточные воды химических производств, - пробы сточных вод
этих же производств или почвы, заrрязненные этими стоками и т. 11.
О получении накопительнрй культуры судят визуально, по прояв
лению признаков роста микроорганизма: помутн~нию среды, появлению
пленки, осадка, пигментов, выделению газообразных веществ и т. д.
Из накопительных культур выделяют чистую культуру микроорга-
низмов.
Получение накопительной культуры BacШus suЬtilis var. mesentericus (картофельной палочки)
Картофельная палочка широко распространена в природе, особен но на картофеле, куда она n<шадает из почвы. Карrофельная палочка
образует очень стойкие центральные споры, которые выдерживают на
гревание при l00° С в течение 6 ч.
Накопительную культуру картофельной палочки получают сле
дующим образом: очищенный картофель нарезают ломтиками, поме щают в чашки Петри и прогревают lО мин при 100° С в стерилизаторе
(инактивируются все вегетативные клетки микроорганизмов), после чего помещают в термостат на 2-3 дня при 25-30° С. На картофеле про растают споры и образуется крепкая морщинистая пленка, при микро скопировании которой видны подвижные палочки длиной до 4-5 мкм,
часто соединенные в цепочки.
Получение накопительной культуры молочнокислых бактерий
Общим признаком молочнокислых бактерий является·способность
осуществлять сбраживание углеводов (моно- и дисахаров) с образова нием молочной кислоты (молочнокислое брожение).
Инокулятом для получения накопительных культур молочнокис лых бактерий моrут служить кисломолочные продукты.
В качестве питательной среды используют стерильное молоко. В пробирку со стерильным молоком виосят I мл кислоrо молока или .аруго го молочнокислого продукта.. Пробирку с п~м и хоmро.льную (со
83
стерильным молоком) ставят в термостат при 30-32° С. Через 24 ч отме чают свертывание молока, характер роста микроорганизмов (образование сrустка - плотного, рыхлого, слизистого), газообразование. Далее прово
дят микроскопирование препарата фиксированных клеток, приготовлен
ного из культуральной жидкости. Отмечают морфологические особенно
сти бактериальных клеток: форму, спорообразование, подвижность и т. д.
Учиrывая особенность субстрата (молока), препарат фиксирован
ных клеток готовят следующим образом: на предметное стекло из про бирки наносят каплю культуральной жидкости, которую равномерно
размазывают покровным стеклом. Мазок высушивают на воздухе, фик сируют и одновременно обезжиривают смесью спирта и эфира (l:l) в
течение lО мин, которую наносят непосредственно на мазок. После ис
парения смесь наливают повторно. Высушенный ·мазок окрашивают
синькой Лефлера.
Получение накопительной культуры углеводородокш:ляющих
микроорганизмов
Углеводороды в качестве единственного источника углерода и
энергии моrут использоваться широким кругом микроорганизмов среди
бактерий и дрожжей, относящихся к разным систематическим группам.
Наиболее активно усваивают углеводороды бактерии - представители родов Pseudomonas,AcinetoЬacter, Arthrobacter,MycoЬacterium, а среди грибов - дрожжи рода Candida,Rhodotorulaи др.
Углеводородокисляющие микроорганизмы ширQКО распростране ны в природе. Их распространение не связано строrо с присуrствием
нефти и нефтепродуктов в местах их обитания. Однако при нмичии нефти и нефтепродуктов в природных субстратах наблюдается естест
венное обогащение их микроорганизмами, активно использующими
углеводороды для роста.
Из углеводородов наиболее доступны для микроорганизмов и-ал
каны с числом атомов углерода С10-С18.
Для окисления углеводородов микроорганизмам необходима хо
рошая аэрация питательной среды.
Для получения накопительной культуры углеводородокисляющих
микроорганизмов в качалочную колбу на 750 мл вносят 100 мл синтети ческой минеральной среды следующего состава (г/л):
аммоний фосфорнокИСJlld· |
нный |
10 |
калий фосфорнокнс:8Q11 |
1 |
lО |
магний сернок · |
|
0,7 |
84
железо сернокислое-7Н20 |
0,013 |
цинк сернокислый-7Н20 |
0,012 |
марганец сернокислый-7Н20 |
0,012 |
Для получения накопительной культуры углеводородокисляющих
бактерий устанавливают рН 6,8-7,0, углеводородокисляющих дрожжей
-4,5-5,0.
В колбу вносят 2 мл жидкого и-парафина и ииокулируют небольшим
количеством почвы, загрязненной иефтепродуiсrаМи. Колбу помещают на
качалку (200-300 об/мин) в термостат при 30-32° С на 3-5 суrок.
Наличие смеси углеводородов (к-парафина) в среде в качестве един
ственного источника углерода и хорошая аэрация способствуют развиrию
углеводородокисляющих микроорганизмов, а различное значение рН
среды определяет преимущественное развитие либо бактерий, либо дрожжей. После инкубации через 3-5 суrок отмечают и записьшают из
менения, которые произошли со средой, и микроскопируют.
При получении бактерий готовят фиксированный препарат и мик роскопируют с объективом 1ООх, а при получении дрожжей - препарат
«раздавленная капля», окрашенный метиленовой синью, и микроскопи
руют с объективом 40х.
Получение накопительной культуры масл11нокислых бактерий Маслянокислые бактерии сбраживают углеводы (глюкозу, сахаро зу, крахмал) с образованием масляной кислоты. Кроме масляной кисло
ты образуе~;ся некоторое количество уксусной кислоты, водорода и уг
лекислоты.
Маслянокислые бактерии строгие анаэробы, поэтому при их куль
тивировании необходимо создавать ·условия, которые обеспечивают
отсутствие кислорода. ·
Для получения накопительной культуры маслянокислых бактерий
в большую пробирку (емкостью 50 мл) Ц()мещают несколько кусочков
неочищенного картофеля, четверть чай~,ь ложки мела, заливают водо проводной водой (расстояние до прt·· 2-3 см), закрывают ватной
пробкой и пастеризуют при 80° С вт |
·ние 10 мин в водяной бане, по |
сле чего помещают в термостат при 37 . |
|
Через 1-2 сут в жидкQсти на дне |
обирки при микроскопировании |
обнаруживается большое количество подвижных палочек. Отличитель
ной особенностью маслянокислых ~рий является их способность
накапливать в клетках з~rао - rранулезу, а также образо
вывать споры. При споро . _ ilQIIC'ПOI утолщаются либо в сере
дине (клостридиальный тм). ~.-~;J(Jlетки (плектридиальный тип). После созревания спор rpa!lyJJeЗa.a·XIJe'rXaX исчезает.
85
После 5-6 дней культивирования анализируют накопительную культуру. Для приготовления микроскопического препарата культу ральную жидкость с микроорганизмами берут пипеткой со дна пробир ки, вблизи ломтиков картофеля. Для обнаружеНИJ1 в культуральной жидкости масляной кислоты проводят две качественные реакции:
1. В сухую чистую пробирку вносят 3-5 мл культуральной жидко сти, взятой из середины пробирки с накопительной культуроji. Добав
ляют 1-2 мл 5 %-ного раствора хлорного железа. Слегка подогревают.
Наблюдают появление кирпично-бурого окрашивания из-за образова
ния маслянокислого железа.
2. В сухую чистую пробирку вносят 3-5 мл культуральной жидко сти, взятой из середины пробирки с накопительной культурой. Добав ляют 1-2 мл 96 %-НО(О этилового спирта, 1 мл концентрированной сер ной кислоты.
После охлаждения пробирки обнаруживают ананасный запах обра зовавшегося масляноэтилового эфира.
Для обнаружения гранулезы в клетках маслянокислых бактерий на
каплю культуральной жидкости с бактериями наносят на 5-10 мин кап
лю концентрированного раствора Люголя, после чего накрывают по
кровным стеклом (витальный препарат) и микроскопируют. Гранулеза
окрашивается в темно-коричневый цвет.
Задание
1. Получить накопительную культуру картофельной палочки. Опи сать характер роста. Приготовить препарат фиксированных клеток
и промикроскопировать. Объектив 100х. Зарисовать.
2.Получить накопительную культуру молочнокислых бактерий из кислого молока, ацидофилина либо кефира. Описать характер рос та. Приготовить препарат фиксированных клеток. Промикроскопи ровать. Объектив l0Ox.Зарисовать.
3.Получить накопительные культуры уrлеводородокисляющих мик
роорганизмов бактерий и дрожжей. Описать характер роста. При
готовить препараты разбавленной капли (дрожжей) и фиксирован
ных клеток (бактерий).· Промикроскопировать. Объектив l00x и
40х.Зарисовать. ·
4.Получить накопительную культуру маслянокислых бактерий. Опи
сать характер роста, ~ и цромикроскопировать препарат
фиксированных J(,JIЩO,~~J~
Провести окраску.~•....- rраиулезы с помощью раство ра Люголя (витальныйnрепарвт). ~пировать. Объектив IООх.
&7
Анrибиотики, диффундирующие в толщу arapa, предотвращают
или задерживают рост чувствительных к ним культур микроорганизмов,
что проявляется в образовании вокруг соответствующих дисков зоны уrнетеНИJ1 роста, четко выделяющейся на фоне сплошного газона роста
тестируемой культуры.
Величина зоны угнетения определяет степень чувствительности микроорганизмов к данному антибиотику:
Диаметр зоны задержки |
Степень чувствительности к |
роста, мм |
антибиотику: |
более 25 |
высокочувствительные |
15-25 |
чувствительные |
10-14 |
малочувствительные |
менее 1О и полное отсутствие |
устойчивые |
Для определения спеюпра антимикробного дейсmвия продуцен та анn~ибиоти"ов на наружной поверхности дна чашки Петри с агари
зованной пептоно-rлюкозной средой по диаметру чашки на расстоянии
1 см друг от друга проводят две параллельные линии. Петлей проводят посев спор культуры актиномицета вдоль отмеченных полос. При посе ве чашки держат агаровой пластинкой вниз (чтобы споры не разлете
лись). Через 6-7 дней перпендикулярно штриху выросшего актиноми
цета проводят посев штрихов тест-организмов. Посев делают петлей нз густых суспензий тест-организмов в стерильной водопроводной воде. Чашки инкубируют при 30° С в течение 1-2 суток.
Воздействие антибиотика, продуцируемого актнномицетоы, на тес
тируемые микроорганизмы onpeдe.llJIIOт по величине расстояния между краем штриха ахтиномицета и началом роста тест-организма.
Задание
1. Провести тестирование чувствительности к 4-5 антибиотикам культуры микроорганизма (рекомендованной преподавателем) ме
тодом бумажных дисков. Определить степень чувствительности по
величине зоны задержки роста.
2. Определить спектр антимикробного действия культуры актиноми
цета по методу перпендикулярных штрихов и степень чувстви- .
тельности тест-организмов к продуценту по величине зоны подав
ления роста.
3.Обосновать степень·чувствительности тестируемых культур к изу
ченным антибиотикам, исходя из их химического строения и меха
низма действия.
88
Работа 24. Исследование бактериофагии. Фаrотипиро вание бактерий (метод Фюрта)
Вирусы микроорrанизмt>в называются фагами, вирусы бактерий - бактериофагами, грибов - микофаrами, актиномицетов - актинофаrами.
Фаrи могут быть вирулентными и умеренными. Вирулентные фаги
проникают в микробную клетку, репродуцируются и вызывают ее ли зис. Умеренные фаги, проникнув в Юlетку, включаются в хромосому
бактерий и реплицнруются вместе с ней. Бактерии, несущие умеренный
фаг, получили название лизоrенных, а фаг, присутствуюПIИЙ в них, - nрофагом. Яаление лизиса бактерий под действием бактериофагов на зывается бактериофагией.
Фаги характеризуются высокой степенью специфичности. Фаг мо жет лизировать только бактерии одного вида или даже типа. Эrо свойство
фагов 0спользуетс11 при фаrотипировании, для идентификации бактерий.
С помощью фаrа можно определить видовую принадлежность или
фаготип исследуемой культуры (фаготипированне).
Ход вьfпuлненш, работы: к 20 мл расплавленного н остуженного
до 45-46° С МПА добавляют l мл суспензии колибактернофаrа. Смесь выливают в стерильную чашку Петри. После застыванИ11 агаровой сре ды дно чашки делится на четь,ре сектора. На каждый сектор засевается петлей штрихом бульонная культура кишечной палочки. Чашки инку бируются 18-24 ч при 37° С.
Обнаружение баюпериофаzа (,1'1еmод Onuno) . Агаризован11ая среда МПА в чашке Петри засевается rустым газо ном 16-18-часовой бульонной культурой, гомологичной искомому фаrу. Спустя 5-10 мин после посеВ;t, на подсушенную поверхность среды на носят каплями исследуемый фильтрат (фаг). Чашку делят на сектора и в каждый сектор вносят по капле фильтрата. После того, каJС жидкость
(суспензия фага} вnитаеn:и в среду, чашки перев'ертыаают вверх дном и
инкубируют 18-24 ч при 37" С. . · Бurериофаг будет лизИ))ОtаТI, .1СJ1етки nmоспецифической культу
ры. На 11екоторых секторах чашек будет OТ(:)"l'C'l'lllвaть рост КОJЮний тех lll'l'8)ЩOB бактерий, JСОТОрые бу.аут чувствителЫП,1МИ по оnюшению к
ВЗЯТОМ}' фаFуИ лизироааllЬl ИМ. .
Полное отсуrетвие роста 6-периал1>;ноl ~льтуры в м~ нанесе
ния капли фильтрата сви.цетельnвует о присуrствии активного бакте
риофага.
Наличие мелких стерильных Пl!ТеН - колоний бактериофага свиде тельствует о присутствии бактериофага слабой активности.
89
Задание
1.Провести фаrотипирование четырех куль1УJ) бактерий {представ ляются преподавателем) по отношению к колибактериофаrу. Опи
сать результаты исследования.
2.Исследовать наличие колибактериофага в ч~:тырех фильтратах {предСТ81IJIJIЮТСЯ преподавателем на занятии). Описать характер
зон лизиса.
Работа 25. Летальное и мутаrеиное действие ультрафиолетовых дучей на Кl\8ТКИ
микроорганизмов
Ультрафиолетовый свет оказывает на микроорганизмы как леталь
ное, так и мутагенное воздействие. Наибольший эффект ультрафиолето
вых лучей {УФЛ) наблюдается при длине волны 260 им, так как это сов
падает с максимумом поглощения УФЛ ДНК. Основным результатом облучения бактериальных клеток в этих условИJIХ является образование в
ДНК тиминовых димеров. Зависимость леталъноrо эффекта {выживае
мости клеток) от дозы УФЛ имеет экспоненциальный характер.
При изучении зависимости выживаемости бактериальных клеток
от дозы УФЛ необходимо учитывать следующие факторы:
\.Большое значение имеет плотность облучаемой суспеюии. УФЛ интенсивно поглощаются клетками, поэтому при большой плотно сти суспеюии клетки экранируют друг друга. Это обстоятельство
не играет существенной роли при концентрациях суспензии, не
превышающих 108 кл/мл. При использовании более густой суспен
зии ее следует непрерывно перемешивать во время облучения.
2.Выживаемость клеток зависит и от состава среды, в которой их
суспеидирУJQТ. Лучше проводить облучение в буферlfЫХ растворах.
Питательный бульон поrлоЩllеТ УФЛ интенсивнее, чем буферные
растворы, поэтому получаем_ая.·клетками доза УФ уменыnается. Кроме того, после облучения в буJJьоНе могут образовываться ток сичные органические nероксиды, увеличивающие летальный эф
фект УФЛ.
3. Действие УФЛ зависит также от физиологического сосtояния IСЛе
ток, прежде всего O'f.~~ста. Обычно клеткк куль1УР в стадRИ
экспоненциального роста более чувствителыrы к УФЛ, чем в ста
ционарной фазе.
Кроме летального эффекта облучение клеток УФЛ вызывает в них
различные мутации.
91
соответственно. Селективные среды служат для выявления обратных мутаций по локусам thr и leu.
Бактерии выращивают в колбах, содержащих 50 мл бульона Хоттин гера, на качалке при 37° С в течение 18ч. Выросшую культуру центрифу гируют, клетки отмывают от среды К-фосфатным буфером (50 мМ, рН 7,0) и суспендируют в том же объеме буфера. Полученная суспензия
должна содержать примерно 2· 9 кл/мл. Каждому сtуденту выдают 15мл
10
суспензии клеток.
Облучение клеток. Суспензию клеток E.coli облучают различными дозами УФЛ. Часть суспензии оставляют необлученной (контроль). Из обработанной и контрольной суспензий высевают пробы на чашки с
МПА и с селективными средами (ТАРВ1 и LAPBi). По числу колоний,
выросших'на чашках с МПА, определяют количество жизнеспособных клеток в I мл облученных и контрольной суспензий. О летальном дей
ствии УФЛ судят по соотношению числа жизнеспособных клеток в кон
троле и облученных пробах. По числу колоний, выросших на селектив
ных средах, определяют концентрацию обратных мутаций по двум ло
кусам (the, leu). Мутагенное действие УФЛ оценивают по разнице кон
центраций муrаций в контрольной и облученных пробах.
Суспензию бактерий облучают с помощью лампы БУФ-15. Ис
пользуемые дозы облученИJ1 около 1, 2, 3 и 4 тыс. эрr/мм2• Этим дозам
соответствуют экспозиции в 8, 16, 24 и 32 с на расстоянии 5 см от лам
пы. Облучение бактерий проводят в открытых чашках Петри диаметром 100-1 IO мм. Для каждой дозы используют отдельную чашку, содержа щую 3 мл суспензии. Во время облучения суспензию тщаrельно пере
мешивают покачиванием чашки.
Для определения количества жизнеспособных клеток беруr по 0,5 мл
каждой из облученных суспензий и делают ряд lО-кратных разведении:
Вариант опыта |
Экспозиция, с |
Конечноеразведение |
к |
о |
10-' |
l |
8 |
10-6 |
2 |
16 |
10-s |
3 |
24 |
10-4 |
4 |
32 |
10·3 |
Из двух последних разведении каждого варианrа отбирают по О,I мл
суспензии и вносят на поверхность двух чашек Петри с МПА. Для опре деления концентрации обраmых мутантов по О,1 мл суспензии каждого варианта высевают без разведеНЮI на чашки с селе~тmной средой. Все
засеянные на занятии чашки инкубируют при 37° С: с МПА - 24 ч, с се
лективными средами - 48 ч.