Микра_Практ

75

r#~1litCIIO клеток в 1 мл суспензии (1 г вещества); а - сре.пнее коJШЧе­

Вi.,ti"iлirоi в'квадрате сетки; S1 - площадь мазка (6·101 или 4-101·мкм2),

К.:..>развеnение суспензии; S - площадь l(Вадрата сетки (поля зрения); 0,05

-объем взятой суспензии, мл.

Задан111е

1. Провести количественный учет дрожжей, содержащихся в пред­ ставленной суспензии.

2. Подсчет клеток дрожжей проводить в исходной (неразбавленной)

суспензии и суспензии, разбавленной в 2, 5 и IО раз, приготовив ·

препарат фиксированных клеток.

З. Подсчет клето1< дрожжей на фиксированных окрашенных мазках

проводить при объективе 90-1ООх, МИ.

4. Результаты работы оформляют в виде следующей таблицы.

Количественный учет микроорганизмов на окрашенных мазках

о

1

2

3

Тема 6. Физиология и генетика микроорганизмов

Работа 21. Рост микроорганизмов в периодической (статической» культуре. В11ияние условий

культивирования на показатели роста

микроорганизмов

К настоящему времени разработано несколько способов культиви­

рования микроорганизмов: периодическое, непрерывное культивирова­

ние и культивирование иммобилизованных клеток.

Наиболее распространен способ периодического культивирова­

ния.· При данном способе инокулят вносJПСя в питательную среду, ко­ торая содержит заданное количество всех необходимых питательных

77

инертных носителях. Питательная среда постоянно поступает в систему

и выводится из нее, т. е. это тоже открытая система.

Для культивирования микроорганизмов необходимо наличие жиз­

неспособной засевной культуры (инокулята), питательной среды, со­ держащей все необходимые элементы питания (источник энергии, утле­

рода, макро- и микроэлементов и, в случае потребности, факторы рос­ та), отсутствие в среде разного рода ингибиторов роста. Необходимо также поддержание оптимальных для роста микроорганизмов физико­ химических условий окружающей среды (температура, рН, давление, условия аэрации, источники света и др.).

Основные параметры роста микроорганизмов:

Х- концентрация. биомассы, r/л;

N - число клеток в единице объема (тиrр кулыуры, плотность популя­ ции), количество клеток в I мл;

µ - удельная скорость роста - прирост биомассы JfЛИ числа. клеток в

единицу времени, отнесенный к концентрации биомассы или коли­

честву клеток, ч·1 :

dtl dNI

µ= dtX; µ=dtN;

t,1- время генерации, время удвоения биомас<;ы или чиСJJа клеток, ч:

. ln2 0,693

td=-=--;

µ µ

У - экономический коэффициент (или выход биомассы от потребленно­ го субстрата),%:

У= ЛХ ·100

лs '

rде ЛХ - увеличение биомассы, соответствующее потреблению субстра­ та в количестве ЛS.

Для определения роста микроорганизмов используется ряд мето­

дов, которые подразделяются на прямые и косвенные методы определе­

ния. К прямым методам относятся:

-определение биомассы весовым или турбидиметрическим методом;

-определение количества клеток микроорганизмов при использова-

нии счетных камер или при высеве на твердые среды.

При использовании косвенных методов проводят определение мас­ сы отдельных компонентов клетки (белок, клеточный азот, нуклеиновые

78

кислоты, аденозинтрифосфорная кислота и др.), массы потребленного субстрата (источника углерода, азота, кислорода и др.), массы образуе­ мых продуктов метаболизма или др.

Работа заключается в экспериментальном проведении процесса пе­

риодического культивирования дрожжей и бактерий и определении па­

раметров их роста в зависимости от условий культивирования.

Техника периодического культивирования микроорганизмов вклю­

чает следующие операции:

1. Подготовка питательной среды

Состав основной питательной среды (I) для вьrращив11ния дрожжей

Состав основной питательной среды (II) для выращивания бакте­

рий (r/л): глюкоза - 10,0; NH 4H2PO4 - 10,0; MgSO 4 •7H2O - 0,7;

Na 2HPO 4 • 12Н2O- 7,0; КН2РО4 -6,8; дрожжевой автолизат- 1 мл.

В зависимости от варианта опыта помимо основной питательной

среды (1) готовят питательную среду без добавления дрожжевого авто­ лизата, а также среду, содержащую 50% глюкозы, и среду, в которой присутствует только 10% источника фосфора и 10% источника азота от их ко~ентрации в среде I.

Помимо питательной среды (11) готовят питательную среду, не со­ держащую дрожжевого автолизата, среду, содержащую 50% глюкозы, а

также среду, содержащую 10% источника азота от их концентрации в

Подготовленная питателЫ1ЗЯ среда разливается по 100 мл в кони­ ческие качалочные колбы и стерилизуется при 0,5 атм 20 мин.

2. Подготовка инокулята (засевиого материала)

Чистые культуры дрожжей и бактерий выращиваются соответст­ венно на твердой питательной среде (косяки), сусло-аrаре и МПА (мясо­ пептонный агар) в течение 48 ч при температуре соответственно 32-34 и

37-38° С. Выросшие культуры засевают в жидкие питательные среды I и II и выращивают на качалке в течение 24 ч. Выросшие культуры исполь­

зуются в качестве посевного материала.

3. Засев подготовленной питательной среды

J:Iзмеряют на фотоэлеК1роколориметре величину светорассеяния

суспензии выросших культур, используемых в качестве инокулята.

Питательная среда дrlЯ микроорганизмов, в которой предполагается определять биомассу по светорассеянию, должна быть оптически про-

79

зрачной. Если помутнение среды связано с выпадением в осадок солей, чаще всего фосфатов, то перед измерением светорассеяния среду под­ кисляют несколькими каплями концентрированной соляной кислоты.

Для измерения светорассеяния выбирают светофильтр, обеспечи­

вающий максимум пропускания .света данной суспензии. Светорассея­

ние суспензии дрожжей и бактерий в бесцветных средах измеряют с

зеленым или сине-зеленым фильтром против воды и выражают в еди­ ницах оптической плотности.

При высоких концентраW1ЯХ клеток в культуральной среде рассея­

ние света усиливается, что приводит к получению заниженных резуль""

татов. Поэтому суспензии с высокой плотностью клеток пере'д измере-

Для исследуемых культур по имеющимся графикам зависимости показаний фотоэлектроколориметра от числа клеток и биомассы, опре­

деляют содержание клеток или сухой биомассы в единице объема сре­ ды. Засевают подготовленную к опыту питательную среду таким объе­ мом засевной суспензии, чтобы обеспечить в опытной колбе количество

засевного материала 0,5% и 1% (в зависимости от варианта опыта). Инокулят вносят при использовании техники, обеспечивающей

стерильность операции.

4. Культура инкубируется в термостатированных качалках, или в

термостатных комнатах на качалке при определенной температуре, в

зависимости от варианта опыта.

5. В динамике определяются параметры роста культуры. Для это­

го каждые 2 ч при соблюдении стерильности операции отбирается 1 мл

суспензии культуры. Определяется· оптическая плотность суспензии, при

выращивании дрожжей подсчитывается количество клеток в камере Го­

ряева, культуры микроскопируются. При микроскопировании дрожжей готовится препарат «раздавленная капля», окрашенный метиленовым си­

ним, и микроскопируется с объективом 40х; при микроскопировании бак­ терий готовится фиксированный окрашенный препарат и просматривается с иммерсионным объективом 1ООх.

Опыт заканчивается при снижении прироста биомассы.

6. По мере получения данных строится график - кривая роста,

определяется продолжительность лаг-фазы, рассчитывается величина

удельной скорости роста в логарифмической стадии и выход биомассы от заданного субстрата при завершении эксперимента (табл. 3).