Микра_Практ
.pdf
109
В отличии от ассимиляционной нитратредукции, восстановления
нитратов в анаболических процессах, которые приводят к синтезу азот
содержащих клеточных компонентов, процессы денитрификации назы
ваются диссимиляцнониой интратредукцией. Процессы денитрифика ции протекают в анаэробных условиях и представляют собой анаэроб
ное нитратное дыхание.
Конечные продукты денитрификации выделяются из клетки в га зообразной форме в виде NO, N20 или N2 в зависимости от вида микро
организма и условий среды.
Число родов бактерий, представители которых способны к нитрат
ному дыханию, велико. Они распространены во влажных слабоаэрируе
мых почвах с высоким содержанием органичесI<ИХ веществ. Это факулъ
тативно-анаэробные-хемоорrаноrетеротрофы родов Pseudomonasи Bacillus. Процесс денитрификации могут осуществлять представи1'еJ!и хемо
литотрофных бактерий, например, Thiobacillusdenitrificans,нитраты для
которых выступают в качестве окислителей неорганических веществ.
|
___.02 |
|
·. |
АН2{аэробные условия-----.. HzO |
|
||
донор |
|
|
<NH3 |
анаэробны~ условия---+ N03 ___. |
N02 |
|
|
· |
акцептор |
|
N20 _. N2 |
Для получения накопительной культуры денитрифицирующих бактерий используют синтетическую среду Гильтая следующего соста-
ва (r): |
· |
· · |
|
I раствор ( 1 r/250 |
мл водъ1): КМО3 - |
2, 1; acnapamн - t ,О |
|
11раствор ( 1r/50 |
мл воды): КН2РО -=-7,0;MgSO4 - 2,0; СаС\2 - |
0,2; TeCl3 |
|
|
- следы; лимоннокислый натрий - |
5,0. |
|
Растворы I и II сливают и доводят объем до IООО мл дистиллиро ванной водой, рН 7,0. Среду разливают высоким слоем в пробирки и стерилизуют в автоклаве при 0,5 атм 20 мин.
Пробирки заражают комочком почвы, плотно закрывают пробками
и термостатируют при 30-35° С. Для создания анаэробных условий по
верхность жмдкости в пробирках покрывают тонким слоем вазелиново
го масла.
Через 7-1 О суток при анализе среды отмечают ее помутнение, обра
зование пены в результате развития микроорганизмов и выделения газов
COz и N2• Нередко при развитии бактерий Ps. aeruginosa, образующих зеленовато-синий пигмент, на9людается позеленение жидхости.
r 110
Ход процесса денитрификации контролируется также по исчезно
вению Нитратов И нитркrов И3 среды ПО качестаеющй )ХЩКЦИИ С дифе НИJ!аМИНО:М И реактивом ЦИИIC•AOд•ll:pWWIIП И ПО ПOЯВJ1eНJIJQаммиака В
среде с реактивом Несслер11. Для этого в фарфоровую. чац~ечку к 3 кan
JUIM реактива цинк-но.а-крахмал добавл•JОТ 1 каплю 20% H2S04и 1 кап
лю ИССЛедуеМОЙ ЖИДКОСТИ. 8 присутствии азотистой.IСИСЛоtы ЖИДКОСТJ,
окрашивается в темно-синий цвет. |
. |
Оценка присуrствu азотной кислоты в среде проводится по ~-
ции с дифенИJiамином. В фарфоровую чашечку к 3-4 каплям концен трированной H2SO4 добавшrют криСТWIЛик дифениламина и после его растворения 1 каплю исследуемой жидкости. При наличии азотной ки
слоты жидкость окрашивается в темно-синий цвет.
Для определения накопления аммиака в среде на фарфоровую пла стинку к нескольким каплям среды добавляют каплю реактива Несслера. В присутствии Jmедов аммиака жи.nкос:ть оrсрашивае'ГСЯ в желтый цвет, при большей концентрации аммиака образуется коричневый осадок.
Задание
1. Получить накопительную культуру денитрифицирующих бакте рий. Описать характер ее роста (помуrнение, вспенивание, пигмен
тация).
2.Приготовить фиксированный препарат со дна пробирки. Микро скопировать при объективе 1ООх. Описать морфологию денитри фицирующих бактерий. Зарисовать.
3.Провести качественные реакции на содержание в среде азотной, азотистой кислоты и аммиака. Записать·результаты.
Работа 33. Поnучение накоnителЫtОй qm.туры
микроорганиэмов,аммонификаторов
Процесс аммонификации, разложения (мииерализациц) орrаииче
ских IIЗQ'l'C()Дepжaщroc веществ (белки, пептидЫ, а1о1инокислоты, нуклеи
новые КИСЛОТЫ, мочевина, ХИТИН, f'Y'NYCOBЫe вещества) С ВЩедеиием
аммиака осуществляется широкой группой микроорганизмов (бактерий,
акrинщ.и~в. rрибов) в широком диаnазо'не тем~ератуrных условиА и '
аэрации (см. схему), |
. |
. |
· |
Ам.Ж>нификация белков (гниение) является наиболее динамичным |
|||
звеном • цикле азота. |
· |
|
|
ДЦ1i ~HUJI |
амt~(ОIЦl:фикаторов щwробов получают их НВJСОПИ· |
||
тельную культуру на мясном бульоне с доб~щлением 2% пептона. Среду наливают высоким слоем в большие пробирки, плотно закрывают ват
ными пробками и стерилизуют.
111
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Белки |
|
Полмnеnтиды nеnткдазы Аминокисnоты |
||||||
олиrоnептиды |
||||||||
|
|
|
||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
дезамини |
декарбокси |
~реами |
синтез |
рование |
лирование |
нированме |
белка |
NН3, С02 и |
NH3, жирные и аромсrтические кислоты, |
оксиды серы |
спирты, дурнопахнащие (индол, скатол, |
|
метилмеркаптаны), ядовитые амины |
|
(кадоверин, путресцин) |
Среду заражают комочком почвы. Для обнаружения выделяю щегося аммиака под пробку пробирки подвешивают полоску красной
лакмусовой бумаги, а для обнаружения сероводорода - поло.ску
фильтровальной бумаги, смоченную 10% раствором уксуснокислого свинца. Для герметичности пробирку плотно закрывают целлофано
вым колпачком.
Пробирки инкубируют при 25-28° С. Через 3-5 суток определяют присутствие в среде продуктов аммонификации белков. Выделение ам миака - по посинению лакмусовой бума~,~, выделение сероводорода - по почернению бумаги, смоченной уксуснокислым свинцом.-
Задание
1. Получить накопиrельиую культуру анаэробных микроорrанизмов,
аммонифи~щих бе.rюJС. ·
2. Описать качеоnаенвую роакцИJQ на присутствие продуJ<Тов. аммонификации: аммонЮ1 и сероводорода. · ·
3. Приготовить фихсиро111U1ныЯ препарат из нижних .слоев жидкости. Мmqюскопировать,.о ~ивом IOOx;Опж:аn. иорфолоrию вы
деленных·в накопительной· культуре микроорrанизмов - аммони фикаторов.
112
Работа 34. Обнаружение свободноживущих
аэотфмксирующих микроорганизмов
Свободноживущие азотфиксирующие·· организмы распространены повсеместно и встречаются среди бактерий самых разных токсономиче
ских групп, относящихся как к хемотрофам, так и фототрофам к аэро-
бам и анаэробам. |
· |
· |
. Наиболее хорошо изученным среди свободноживущих аэробных азотфиксирующих бактерий является азотобактер.
Azotobacterchroococcum- это соединенные в пары одиночные кок
ковидные клетки размером 3-7 мкм, в старой культуре клетки обычно
окружены слизистой капсулой, а колонии темнеют до темно-серого и
темно-коричневого цвета. Активность азотфиксации до 20 мг азота на 1 г
потребленного органического вещества.
Наиболее изученными анаэробными свободноживущими азотфик сирующими организмами являются маслянокислые бактерии Clostridium pasteurianum,активность азотфиксации которых достигает до 12мг азота на 1г потребленного органического вещества.
Для обнаружения азотфиксирующих организмов в природных сре
дах используют метод получения накопительных культур на синтетиче
ских средах, в которых отсутствуют источники азота. В частности ис пользуется среда Эшби, г/л: маннит (или глюкоза, или сахароза) - 20;
К2НРО4 - 0,2; MgS0 4 - 0,2; NaCI - 0,2; K2S04 - 0,1; СаСО3 - 5,0; рН сре
ды 6,~,5
Питательную среду по 30 мл, не стерилизуя,· разливают в колбы_ объемом 100-150 мл и вносят комочек почвы (1/2 чайной ложки), за
крывают ватными пробками и термостатируют при 28-30° С.
· На 5-6 сутки на поверхности жидкости образуется бурая пленка,
при микроскопиро1_1ании которой обнаруживаются клетки азотобактера
в виде коIСJСов и диIШОкокков. Некоторые клетки покрыты слизистой капсулой.
Элективными условиями для азотобактера, ·способного фиксиро
вать азот атмосферы, являются аэрация, отсутствие в питательной среде
азота и присутствие в среде фосфора и кальция, к которым требователен
азотобактер.
В некоторых случаях наблюдвется вспенивание жидкости в колбе и nollВJlelilfe запаха масляной кислоты, что ука1ывает ка развитие в среде
на дне колбы в анаэробных условиях бактерий Clostridiumpasteurianum. Для изучения морфологии микроорганизмов готовят два препара та: один из пленки с поверхности среды JJJIЯ выделения азотобактера
113
(фиксированный препарат, негативно окрашенный тушью. Микроско
.пируют с объективом 1ООх); второй препарат готовят из нижних слоев жидкости для выявления клостридий. Готовят препарат «раздавленная
каrшя» с добавлением раствора Люrоля (реактив, окрашивающий rра-
нулезу). Микроскопируют с объективом 40х. |
· |
Образование масJiяной кислоты в среде обнаруживают по реакции
с хлорным железом. 5. мл жидкой среды из накопительной культуры переносят в пробирку, добавляют 2 мл 2% раствора хлорнокислоrо же леза и нагревают до кипения. Пары образующегося раствора масляно кислого железа в проходящем свете имеют кроваво-красный цвет.
Задание
1.Получить накопительную культуру свободноживуших азотфикси рующих микроорганизмов. Описать характер роста.
2.Приготовиrь фиксирGванный препарат из образовавшейся пленки,
негативно окрашенный тушью. Микроскопировать с объективом 1ООх. Зарисовать.
3.Приготовить со дна накопительной культуры препарат «раздавлен
ная капля», окрашенный раствором Люголя. Микроскопировать с
объективом 40х. Зарисовать.
4. Провести качественную реакцию с хлорным железом на присутст вие масляной кислоты. Описать результат реакции.
Работа 35. Получение накопительной культуры сульфатредуцирующих бактерий
Восстановление сульфатов микроорганизмами может иметь разное
значение. Большое число видов способны использовать сульфаты как
источник серы. Эrо требует восстановления so/- до s2-, необходимой
ДЛЯ биосинтеза серосодержащих органических веществ кл~к. Такой
процесс носит название а,ссимиляционной суль_фатредукции.
Изв~н также ряд бактерий, которые используют сут,фат в каче
стве конечного акцеmора электронов при анаэробном дыхании. Эrот
процесс, ведущий к нако.мению в среде сероводорода, называют дис
симИJ1ЯЦИонной сулl,фатредукцией или сульфатным дыханием, а бакте- .
рии, ero осуществmпощие, - сульфатредуцирующими.
К числу сульфатредуцирующих бактерий относится значительное
. ЧИСЛО анаэробных баК1°ерий С разной морфологией. Среди НИХ есть ге
теротрофные и автотрофные виды. Некоторые из них способны не толь
ко к сульфатному дыханию, но и брожению.
114
Для получения накопительной культуры сульфатредуцирующих
бактерий применяют среду ПQСтrейта следующеrо состава:
Раствор 1 (r): К2НР04 - |
1, NН.CI - |
1, CaCl2·H1O- 0,1, MgS04•7H20 |
|||
- 2, лактат Na (70% |
~щетвор) - 3,5;дрожжевой экстракт - 1, рН 7,4, дис· |
||||
тиллированная. |
вода. |
-980 мл. |
. |
. .. |
r |
Pacnop 2 (r): F.eS04·7Н20- (),5;дистИЛJ1.ированиая ВО.1(8 - |
1О мл. |
||||
Раствор 3 (r): а~ор(jиновая кислота-О,!; Nа-тиQrлихолп-0,1, рН 7,4, дистилл"рованнщr вода.- 10 мл.
Растворы стер11Лизуют отд~ьно, затем их сливают и разливают по
стерильным пробиркам до самого верха. Инокулируют почвой (лучше
болотной). Пробирки закрывают резиновыми или притертыми пробками и заливают парафином. Инкубируют в течение 20-25 дней при 30° С.
Развитие сульфатредуцирующих бактерий регистрируют по почер нению осадка в пробирках вследствие образования сернистого железа.
Задание
Получить накопительную культуру сульфатредуцирующих бакте рий. Описать характер роста. Приготовить фиксированный препарат. Микроскопировать с объективом 90х. Зарисовать.
Методические указания к выполнению
самостоятельной работы по микробиологии Требования к содержанию_и оформлению
/. Цель и задачи ,ьтолнения самостоятельнойработы
Основной цедью .выполнения самостоятельной работы является
развитие навыков экспериментальных микробиологических l!Сследова
ний, правильного использования освоенных на qраnических занятиях
МеtодОВ при ВЫПОЛНеНИИ ИССЛедоваfЩЙ И ре~JЧIИ ПраkТИЧеtКlfХ Задач,
а также озtiакомление с требованиями к офорw~енщо результатов науч-
ных исследований. |
. . |
•· |
. |
.в задачу самосrопельной работы, как nравило, вхо.мт два основ-
ных этапа: |
' |
. |
. |
,, |
' |
·. |
1.-Выделение чистой культуры микроорганизмов (из объек:rов ок
ружающей среды,· ТСХНОrеlfНЬIХ _llOТOkOB, лабораторffЫХ ,ИЗОЛJIТОВ, за- .
rр,rзненных культур идр.); |
· |
· |
2. Характеристика чистой культуры. Второй этап работы включает:
-описание культуральных признаков, морфологии колоний, штриха;
115
-морфgлоГИJI клеток, размер клеток, тип окраски по.Граму и др.;
-физиологические свойства куль1)1)Ы: кривая роста, отношение к
темnера,уре культивироsамн14; рН. среды, к аэрация с;ре,1р,1, 9'ПIО
шениеJС.аиrибИОТИkам, с~к антиб~;
- о~~ метаболиmqесхо#I активности (~ |
роста при |
испо.11ЬЭО11811ии различных источНИ1Сов yrnc,poдa и а3(iта, образова
нно определенных метаболмтов, способносn. дeq,IIJW1ИR ксено
биотиков, других загрязняющих вещее-в и др.).
2. Порядок вwполненuя ра6от•1
2.1. Студент получает от преподавателя индивидуа,яыюе задание.
Работа вы11олняется в лаборатории кафедры биотехнолоrии;:либо в дру
гих организациях, если студент участвует в проведении научных иссле
дований. В последнем случае.тема самосто,mтьноrо задания обязатель
но должна быть согласована с преподавателем.
2.2.1.Выполнение работы начинается с определения цели ее и за
дач, что должно быть отражено и в названии работы.
2.2.2.Проведению исследований должно предшествовать состав ление плана работы, а также подбор методов исследований.
При выполнении экспериментальной работы должно быть преду
смотрено использо.вание максимально возможного количества методов,
из освоенных при выполнении лабораторных занятий.
З. Методическиерекомендации по ,wполнениюpa6omw
3.1. Выделение чистой культуры Ос11ооные понятия о чистых и смешанных культурах
Чистой культурой микроорганизмов называется куль1')1)8, в кото
рой присутствуют КJIСТkИ ЛИШЬ ОДНОГО Вида {ИJIИ штамма) аtикроорrа-
НИЗМОВ. |
. ,:,· ·. |
Культура, в которую случайно попали постороюще мвроорrаннз- |
|
мы, назьаwrrся зараженной. |
' |
Совокуnвоtт~, И/111 8СООЦWЩ1U двух ИfП1 более организмов в куль
туре ~КOНCOJJ'IIIYMoAl'~МOB.
Различitюттри осйов~·-·•сорциумов микроQРnЩИЗмов:
1,.,.ЯС· 1Сусствеино coз•iiЩI\~ микроорrаннзмоiJ;:ко'rорые на-
зываютt:111ешt1Ннwми ~; |
'·.. |
' . . ' |
2 - консорциумы, ·выделенные непосредственно из природных ис точников, какфункцио~ьно неделимое целое. Такие консорциумы на
зываются ассоциативные культуры, ИJIИ ассоциации микроорганизмов.
118
3 -, консорциумы, образовавшиеся в результате nрактической дея
тельности человека при приготовлении пищевых продуктов, это разного
рода «закваска}>. |
. |
При выделении чистой культуры из объектов окружающей среды,
техногенных потоков, при расчистке заrрязнениых \1.")'ЛЬтур следует
учитывать, что ·однократный пересев ми1,.-роорrанизмоii из выросшей
колонии на друrую среду не всегда гарантирует чистоту культуры. На
пример, колонии слизеобразующих бактерий могут содержать в ·виде
примеси другие микроорганизмы, захваченные со слизью - контами-
.нанты. Тру~ возникают таюке и пр11 выделении культур на селек
тивной с• а;;Щ)М случае контаминаи'iы моrут существоваn. а ла- - тентном се<:'Юянии и вызывать загрязнение при отборе II пересеве коло
ний. Наилучшая очистка достигается на:nолноА питатеJ;Jьной среде, на
пример, МПА. Но даже в этом·~ае пересевать следует из.оформив шихся колоний, так как возможiJо присуrствие медленно pac'J)'Щltf( кон
таминантов.
3.2. Рост на плотных n11тателы1ых средах
На поверхности плотных шtтател~ных.сред в зависимости от посе
ва микроорганизмы могут расти в виде kолонии, штриха или сплошного
газона. Колонией называют изолированное скопление клеток одного
вида, выросшее в большинстве случаев из одНОА клетки. В зависимос-n1
01· toro; где растет микроорrаниэм к.летки (ка ПС?верхности плотной_m1-
тательиой среды, в толще ее щ на me сосу.11а), р33Jlичаюt по~кост
ные, глубинные и донные J(OJJOIDUt.Колонии, выросшие kanовеmшости
среды, отличаются большим разнообразием и являются kаиболее'\:уще
ственной особенностью роста многих микрооргакизмов на плотном
субстрате. При их описании учитывают <;-чедующие·признаки: ·форма,
профl{ль, край, структура, размер, поверхность, циет колонии,.
Кр.ай и структуру колонии определяют с помощью лупы щ~и при малом увеличении микроскопа. Для этого чашку Петри помещают иа
столих микроскопа крыwкой,вниз.
·Размер (диаметр) колонии измеряют в мишiимс:-rрах; если размеры
.колонии ке превышают l мм, то их называютточечными.
Поверхность колонии - шадкая, шероховатая, бороздчатая, _склад
чатая, морщинистая, с концентрическими кругами илц радиально ис
черченная.
Блеск к nрозрачкостr. - ко,,ония блестяпщ, матовая, тусклая, муч
нистая, прозрачная.