Микра_Практ
.pdf
62
2. Пересев кул,тур мuнpoopzt111111М0t1, шращенныхв :жuhl«Jii среде
-Из стерилъной бумаги вынимают rрадунро1'аННуЮ стерилъную пи петку за верхний конец, берут пипетку средним и большим паль цами правой руки, не касаясь поверхности той части пипетки, ко торая будет вводиться в сосуд с жидкой средой.
-Берут в левую руку пробирку (или колбу) с культурой микроорга
низмов, выращенной в жидкой среде, и держат ее в вертикальном
положении, чтобы не замочить пробку.
-Открывают пробку, соблюдая все правила стерильности, описан ные выше, и вводят пипетку в пробирку.
-Набирают в пипетку суспензию микроорганизмов, закрывают пробкой пробирку (или колбу), вносят определенное количество
суспензии в свежую стерильную питательную среду, соблюдая уже
описанные правила предосторожности.
-Пипетку помещают в сосуд с дезинфицирующим раствором (0,5-3%
водным раствором хлорамина или 3-5% водным раствором фенола),
не касаясь ею окружающих предметов.
Задание
1. Подготовить скошенный агар (косяки) с МПА и сусло-аrаром для
культивирования микроорганизмов.
2. Провести пQсев культур микроорганизмов (бактерий, дрожжей и грибов) из пробирки в пробирку с помощью бактериологической
петли.
3. Провести пересев культур бактерий и дрожжей, выращенных на
жидких питательных средах, в стерильные питательные среды.
3. Посев на плотн"е сред" в чашки Петри Посев в чашки Петри проводится несколькими способами. Поверхностный способ посева:
-Готовят в чашках Петри твердые пластинки из питательной среды. Стерильную твердую питательную среду расмавляют на водяной бане в пробирке или колбе и охлаждают до 50° С.
Вынимают чашки Петри из бумаги, в которой они стерилизова
лись, и ставят их на ровную горизонтальную поверхность.
Берут пробирку или колбу с охлажденной до 50° С питательной средой, вынимают ватную пробку, обжигают на пламени горелки края пробирки и держат ее в наклонном положении.
-Приоткрывают крышку чашки Петри левой рукой, а правой рукой
наливают среду на дно чашки Петри, заполняя всю ее поверхность.
63
Оставляют чашку Цетри на столе до полного застывания среды, за
тем став,~т в термостат на 15-20 мин для подсушивания.
На твердую среду наносят петлей или пипеткой каплю посевного
материала и затем .равномерно распределяют его по поверхности,
пользуясь стерильным шпателем (изогнутая стеклянная палочка). Шпатель вынимают из бумаги и беруr в правую руку.
Приоткрывают крышку чашки Петри левой рукой и вносят в нее
шпатель.
Размазывают каплю посевного материала шпателем вращатель
ными движениями по поверхности агаровой пластинки (надавли
вать шпателем на тверцую среду не следует, так как можно ее по
вредить).
-Переносят шпатель в сосуд с дезинфицирующим раствором.
Глубинный способ посева:
Приоткрывают стерильную чашку Петри и помещают п~тлей или
пипеткой каплю посевного материала на дно чашки.
Расплавляют аrаризованную питательную среду в пробирке или колбе и охлажщuот ее до 45--48° С.
Обжигают края пробирки или колбы в пламени горелки и выливают
среду в чашку Петри с внесенным посевным материалом, соблюдая
правила стерильной работы.
Распределяют равномерно посевной материал в питательной среде,
для чего осторожно круговыми движениями перемещают чашку
Петри по поверхности стола.
-Оставляют чашку Петри на столе до полного застывания cpe;u,1.
-Делают на чашке Петри надпись (число, название микроорганиз-
ма). Все посевы, выполненные описанными способами, помещают
в термостат для выращивания микроорганизмов при темпераrуре,
благоприятной для их роста.
Задание
1.Подготовить по 3 чашки Петри с МПА и сусло-аrаром.
2.Провести посев культуры микроорганизмов (дрожжей и грибов) поверхностным способом в чашки Петри с сусл'о-аrаром.
3.Провести посев бактериальных культур в чашки Петри с МПА
глубинным способом.
64
Работа 17. Выдепение чистых кут.тур микроорrанизмов В микробиологической практике широко используются как чистые
культуры микроорганизмов, так и консорциумы.
Консорциумы - смешанные или ассоциативные культуры, состоя
щие из 2-х и более микроорганизмов, между которыми существуют раз личные формы взаимоотношений.
Чистой культурой называют культуру, состоящую из микроорга низмов одного вида. Чистая культура микроорганизмов, которая являет- - ся потомством одной единственной клетки, называется клоном.
Загрязненная или инфицированная культура - чистая культура, в которую случайно попали посторонние микроорганизмы.
Чистые культуры микроорганизмов, как правило, выделяют на по верхности или внутри твердой питательной среды.
Существует несколько методов получения чистых культур. Все
они основаны на выделении из популяции одной клетки.
Метод разбавлении Пастера. Из суспензии, содержащей смесь
микроорганизмов, делается ряд последовательных разведении в стериль
ной жидкой питательной среде. С каждым разведением количество мик роорганизмов, попадающих в пробирку, будет уменьшаться и можно
таким образом получить такие разведения, когда в объеме среды в про
бирке будетнаходиться только одна клетка, из которой и разовьется чис
тая культура. Однако этот метод не всегда дает возможность получить
чистую культуру и в настоящее время практически мало используется.
Выделение чистой культуры из 9дной клетки капельным мето дом. Предварительно подготавливается разведение культуры микроор
ганизма в питательной среде с таким расчетом, чтобы в небольшой капле
этой среды могли быть единичные клетки. Затем на поверхность сте рильного стекла с помощью простерилизованной иглы и стеклянной па
лочки наносят ряды мелких капель среды, содержащей микроорrаниз)'dы.
Стекло перевертывают и помещают над лункой предметного стек ла. Края лунки предварительно обмазывают вазелином. _Затем всtЫ(аПЛИ
просматривают под микроскопом и отмечают те из них, в которых на
ходится только одна клетка.
Стекло помещают в чашку Петри, на дне которой находится ув
лажненная фильтровальная бумага, и ставят в термостат; клетка раз множается, образуя микроскопическую колонию.
Полученную колонию снимают стерильной фильтровальной бума
гой, которую держат простерилизованным на пламени пинцетом, и пе реносят в пробирку с питательной средой.
65
Выделение чистой кудьтуры капельным методом используется при
рабаrе:с-~-~-<щюжжн. nпе<:ени). · Выделенне·чметоt ,кулi;туры с rtомощью миqюмаиirпутrтора.
д,r.я выделеlfЮI под контролем михроскопа одиночных микробных кле ток и их посева применяют специально оборудованные микроскопы -
микроманипуляторы. Отдельные микробные клетки в них вылавливают
ся из висячей микрокапли микропипеткой и микропетлей, перемещае
мыми в поле зрения микроскопа с микронной точностью с помощью
системы винтов и рычагов.
Наиболее распространен в микробиологической практике метод выделения чистой культуры с помощью твердых сред (метод Коха).
Метод заключается в получении чистой культуры из отдельной ко- . лонии, выросшей на твердой питательной среде в результате размноже
ния одной клетки.
Метод о~ .яа том, что при нанесении микроорганизмов из по
севного Jо1атериащt &а· твердую среду отдельные клеnи будут закреп
ляться -(ш.tмоби.пизироваться) в определенной точке твердой среды и, размножаясь, давать потомство (клон), представляющее чистую культу-
ру микроорганизма. |
, |
Для получения изолированных колоний на твердой среде иссле
дуе.щй материал высевают на поверхность твердой питательной среды, наносят петлей или пипеткой каплю исследуемого материала. Рассев
проводят либо методом истощающего мазка, либо методом истощаю
щего штриха. В первом случае шпателем равномерно распределяют на несенную каплю по поверхности твердой среды. Тем же шпателем де лают посев на поверхности второй пластинки и затем третьей, т. е. пе
ренося последовательно на твердую среду клетки микроорганизмов,
. которые ·остались на шпателе. Таким образом, количество микроорга низмов, вносимых последовательно на мастинки, будет уменьшаться:
на вторую - меньше, чем на первую; на третью - еще меньше, чем па
вторую и т. д.
При ж:nо.lIЬЗОВаНИИ метода истощающего штриха исследуемый ма
териал наносят петлей в верхнюю часть твердой среды в чашке Петри и аккуратно, зигзагообразно петлей по поверхности чашки (рис. 23). За
тем посев проводят аналоГИ'lно на второй и третьей чашке.
После посева чашки необходимо перевернуть вверх дном и поста вить в термостат при температуре, благоприятной для данного микроор ганизма. Инкубируют посевы обычно в термостате в течение 2-3 дней. В
результате на поверхности среды вырастают колонии микроорганизмов.
66
Выросшие колонии сначала рассматр)fВают невооруженным гла
зом, а затем при помощи лупы или при малом увеличении микроскопа.
Рис. 23. Метод посева
зигзагообраз
ной петлей
При описании колоний микроорганиз
мов отмечают следующие морфологические
и культуральные признаки:
Размер колоний - их диаметр в мм (ес
ли колонии не превышают I мм, их назы вают точечными).
Форма колоний - округлая, неправиль ная, мицелевидная, ризоидная, амебовидная, складчатая, концентрическая, сложная и др.
Цвет колоний - белый, желтый, розо
вый и т. д. и способность выделять пигмент
в среду. |
|
Поверхность колоний |
гладкая, |
складчатая, с радиальной или концентриче ской исчерченностью, шероховатая, бугри
стая и др.
Оптические свойства-· прозрачная, полупрозрачная, непрозрачная, блестящая, матовая, флуоресцирующая и т. д.
Профиль.колоний - плоский, слабовыпуклый, сильновыпуклый, во
гнутый, кратерообразный и др.
Край колоний - ровный, извилистый, зубчатый. лопастной, волни стый, неправильный, реснитчатый, нитчатый, ворсинчатый, ветвистый.
Консистенция колонии - маслянистая, тестообразная, вязкая,
пленчатая.
Для описания колоний из имеющихся чашек Петри берут ту, на ко
торой колонии достаточно изолированы друг от друга. В отобранной
чашке выбирают хорошо изолированные и различающиеся внешним
видом колонии, которые описывают, указав все характерные признаки
их роста.
Из отобранных колоний приготавливают препараты, микросколи~
руют для проверки морфологической однородности клеток. При приго товлении препаратов необходимо соблюдать все правила отерильности (не открывать широко крышку чашки, хорошо простерилизовать петлю).
Далее пересевают культуру из колонии в пробирку со скошенной
плотной питательной средой (косяк). Посев проводят следующим образом.
\.Зажимают пробирку средним пальцем левой руки (скошенная по
верхность arapa должна быть обращена вверх).
67
2.Обжигают петлю.
3.Приоткрывают крыt.uку чаmkИ Петри, берут nетлея материал из
колонии и :JаКрЬiвают крышку.
4.Быстро делают посев штрихом по поверхности косого агара.
5.Делают на пробирке надпись, число, номер колонии и др., и ставят
посев в термостат.
Для выделения чистых кульrур многих бактерий используют
МПА, для дрожжей - сусло-агар.
Недостатком этого метода является то, что иногда получаются не чистые, а смешанные культуры. Это является результатом того, что ко лонии моrут образоваться не из одной, а из двух или нескольких клеток, попавших в одну точку. Поэтому этот метод выделения чистых культур требует двухили трехкратного повторения выделения кульrур из од ной колонии. Для этого готовят суспензии культур микроорганизмов
изолирован~ «олоний в, стерильной водопроводной воде. Из каждой
суспензии стерильной пипеткой делают разведение в стерильной водо
проводной воде (l капля суспензии на 8-10 мл воды) и взвесь микроор
ганизмов рассевают на поверхность плотной питательной среды в чаш
ки Петри, которые помещают на 3-4 суток в термостат.
Через 3-4 суток просматривают выросшие КОЛQНИИ и сверяют их
признаки с отмеченными признаками при выделении кульrуры.
Однородность колоний и совпадение признаков с описанными ра
нее свидетельствуют о чистоте кульtуры.
Изолированные колонии рассевают в две пробирки на поверхность
скошенной питательной агаризованной среды и помещают в термостат при определенной температуре, благоприятной для данного микроорга низма, на 2-3 суток.
Задание
Выделить чистые кульtуры бактерий по методу Коха на среде МПА
~и сусло-агар из предоставленной суспензии кульtур микроорганизмов.
Тема 5. Методы количественного учета
микроорганизмов
Работа 18. Методы количественного учета
микроорганизмов на твердых средах
Метод Коха - наиболее распространенный способ количественного учета микроорганизмов. Сущность метода заключается в высеве опре-
68
деленного объема исследуемой суспензии микроорганизмов на твердую среду в чашки Петри и последующем подсчете числа выросших коло
ний. При этом принимаю,:, что каждая колония образуете,~ при размно
жении одной клетки.
Этот метод позволяет вести учет только жизнеспособных клеток
микроорганизмов. При анализе берут стерильно 1 мл суспензии и по
мещают в 9 мл стерильной водопроводной воды или физиологического
раствора (рис. 24), затем последовательно новой пипеткой (!) переносят по 1 мл в ряд пробирок с 9 мл с1;ерильной водопроводной воды.
fмл |
1.мл |
fмл |
fмл |
9.мл |
9.мл |
9ил |
9мл |
|
|
|
|
1:10
Рис. 24. Схема пpиroтoaneнlfJI разведенной суспензии
,микроорганизмов н посева
Степень разведения определяется предполагаемым КQличеством |
|
микроорганизмов в образце, и соответствешю число разведений тем |
|
больше, чем больше микроорганизмов в исходном субстрате. |
|
Из полученных разведений, предварительно nцателъно перемешан |
|
ных, производят высев на поверхность агаровой пластинки в чашки Пет: |
|
ри. Посев производят пипеткой обычно по 0,05;О, 1или 0,2 мл, начиная с· |
|
наибольшего разведения, при этом может применяться для посева одна |
|
стерильная пипетка. Объем внесенной суспензии распределяют по по- |
1 |
1
69
верхности среды стерильным шпателем. Если высев проводят, начиная с
больших разведении, то используют новую стерильную пипетку и новый
шпатель дu каждого разведения.
Чашки Петри с засеянными средами помещают в термостат при
определенной температуре, благоприятной для развития учитываемых
микроорганизмов.
Подсчет выросших колоний проводят через определенное время.
после посева (3-5 суток). Колонии, как правило, считают, не открывах чашки Петри, повернув их кверху дном. Дnя счета берут те чашки Пет. ри, на которых колонии хорошо отделены одна от другой. Каждую от считанную колонию помечают точкой с нижней стороны чашки Петри чернилами или стеклоrрафом. При большом количестве колоний дно
чашки делят на секторы, ~одсчитывают количество колоний в каждом
секторе и результаты суммируют. |
. |
Слецует иметь в виду, что з-очность метода зависмт от числа под•
счманных колоний: лучшим ~деиием· ciurraют то, при высеве цз которого на rшотной питательной среде вырастает от 50 до 150колоний.
Если число выросших колоний меньше 10, то эти результаты отбрасы
вают и для расчета количества клеток в исходном субстрате не исполь
зуют. Желательно, чтобы общее количество подсчитаииых колоний при высеве из данного разведения было не менее 300.
Зная количество выросших колоний и степень разбавления, легко .
определить количество микроорганизмов в I мл исследуемой суспен
зии, пользуясь формулой:
N=(а±2ст0)к,
V
tде N - количесnю микроорганизмов в I мл суспензии; К - разведение, :
из которого проведен высев; ii - среднее количество колоний на чашке
Петри при разведенИJt К; V - объем суспензии, взятый ддя посева, мл;
il ....критерий при 9% уровне значимости; 0-0 - среднее квадратичное
отклонение,равное ± JI,а, п- числоповторностей.
п
Например, если при разведении 1:105 вьiросло 85 колоний, количе
ство бактерий в 1 л исследуемого вещества при объеме суспензии, взя той w~я посева, равном 0,1 мл, будет равно
s |
1 |
. . 6 |
7 |
85·10 |
-=85-10 |
=8,5·10 +20';;. |
|
0,1
70
Причинами ошибок определения мoryr быть: неrомогенное рас
пределение клеток микроорганизмов, в объеме жцкости за счет недос
таточной продолжительности· взбалтывания пробы, сорбирование мик роорrанизмов на стенке сосудов, ошибки пересчета и др.
Наиболее надежные результаты получаются при соблюдении сле
дующих условий:
-В разведениях дnя счета число колоний должно быть от 50 до 150.
При большем количестве колоний подсчет становится затрудни
тельным и неточным.
-Количество параллельно засеваемых чашек должно быть не менее 2.
Задание
Провести количестsенный учет дрожжей по методу Коха, содер жащихся в суспензии, предоставленной для анализа.
·Результаты работы оформляют в виде следующей таблицы.
Количественный учет дрожжей по методу Коха
. |
Количество |
|
|
|
|
•• |
|||||
|
колоний, |
Среднее |
|
|
|
Количество мик- |
|||||
|
Значение |
|
роорганизмов в |
||||||||
Разве: |
выросших |
|
|||||||||
значение |
|
||||||||||
о-=±!Га |
|
l мл исследуемой |
|||||||||
|
|
|
|||||||||
к |
на чашке Петри |
а=~ |
|
||||||||
дение, |
|
|
|
|
суспензии |
||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
N = (а±20-0)К |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Повторность |
п· |
п |
|
|||||||
|
n1 |
|
|
|
n2 |
|
|
|
|
V |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
1
10--'
10"'
10""
ит.д.
Работа 19. Коnичественный учет МИlфО()рrанизмов
с nомощыо счетных камер
Метод прямого подсчета клеток микроорганизмов в счетных каме
рах успешно применяют для определения общего количества микроор
ганизмов, содержащихся во взвесях (суспензиях).
Известны счетные камеры разных конструкций, принцип устройст
ва которых одинаков (Горяева, Фукс-Роэенталя, Петрова-Хауссера, То ма-Цейса и др.).
71
,,: (><''<\ifirr9д КОЛИЧестаеННОГО учета михроорrанИЗМОВ С ПОМОЩЬЮ счет•
иых Jaif,repимеет ограничения применения, свизаины:е с тем, что в счет
J{ЫХ камерах проводите,~ учет всех клеток микроорганизмов без их
дифференuиации на живые и мертвые клетки. Кроме того, счетные ка меры моrут быть использованы лишь дnя подсчета относительно круп
ных объектов - клеток водорослей, дрожжей, спор грибов, микроскопи
руемых при объективе 8-40х.
Счетная камера представляет собой толстое предметное стекло с
нанесенными на нем поперечными прорезами, которые образуют три
поперечно расположенные плоские площадки (рис. 25, а). Средняя
площадка продольным прорезом разделена пополам, причем на каждой половине нанесена квадратная сетка (рис. 25, а). Две боковые площадки расположены на О, 1 мм выше средней (рис. 25, б).Эти площадки служат
для притирания,покровноrо стекла.
1111~1111
а
Рис. 25. Счетная камера Горяева:
а - вид сверху; б - вид сбоку, h - высота к:амеры; в - вид при ма
лом увеличении мик:роск:опа
Сетка разделена на определенное число больших и маленьких
квадратов, по-разному сгруппированных (рис. 25, в).
Постоянной величиной во всех сетках является маленький квадрат
(ABCD, рис. 25, в), сторона которого равна 1/20 мм, площадь его - 1/400 мм2, а объем при высоте камеры 1/10 мм - 1/4000 мм3 или
1/4000000мл. Так называемый большой квадрат ABCD,состоит из 16
малых квадратиков.