антитоксической сывороткой, выдерживают определенное время и вводят животным. Контрольной группе животных вводят фильтрат исследуемого материала без сыворотки. Если произойдет нейтрализация токсина антитоксическими антителами, животные опытной группы останутся живы. Животные контрольной группы погибнут в результате действия экзотоксина.

Проба Шика - внутрикожная проба с дифтерийным токсином, применяемая для установления противодифтерийного иммунитета. Внутрикожно в ладонную поверхность предплечья вводят 0,2 мл стандартного дифтерийного токсина, результат учитывают через 72 - 96 ч. У людей, не имеющих АТ против токсина, на месте введения образуются краснота и инфильтрат (положительная реакция). У людей с напряженным иммунитетом инфильтрат не развивается или он меньше 1 см (отрицательная реакция).

Реакция флокуляцииосновананавыявлении «инициальной» флокуляции - помутнения при образовании комплекса экзотоксин (анатоксин) + антитоксин в оптимальных количественных соотношениях ингредиентов. Реакция применяется для определения специфической активности токсинов (анатоксинов) по стандартной антитоксической сыворотке или для титрования антитоксических сывороток по известному анатоксину или токсину. Например, эта реакция применяется для определения активности дифтерийного, столбнячного, ботулинического, анатоксинов и титрования противодифтерийной, противостолбнячной и других антитоксических сывороток.

Постановка реакции флокуляции:

С помощью пипетки вносят в 5 пробирок равное количество дифтерийного анатоксина (по 2,0 мл). Затем другой пипеткой вносят возрастающее количество противодифтерийной сыворотки (200 АЕ/мл): в первую пробирку – 0,5 мл; во вторую – 1,0 мл; в третью – 1,5 мл; в четвертую – 2,0 мл; в пятую – 2,5 мл. Ставят для нагревания на водяную баню. После инкубирования 30-40 мин. учитывают результат инициальной флокуляции, по этой пробирке производят расчет силы анатоксина.

Тема практического занятия 12. Иммунологические реакции: реакция связывания комплемента, ПЦР.

60

ЦЕЛИ: Знать принципы реакции и методы постановки, учетные признаки, практическое применение.

Порядок проведения занятия:

1.Вступительное слово преподавателя (цели и задачи) – мин.

2.Объяснение нового материала, методические и организационные указания преподавателя по проведению занятия - мин.

3.Самостоятельная практическая работа студентов под руководством преподавателя, оформление и проверка протоколов – мин.

4.Обсуждение полученных результатов, проверка протоколов, подведение итогов практического занятия, заключительное слово преподавателя - мин.

Вопросы для самоконтроля

1.В чем состоит сущность реакции связывания комплемента (РСК) каковы ее разновидности, ингредиенты, учетные признаки?

2.Можно ли использовать в РСК непрогретую сыворотку больного?

3.В чем состоит сущность ПЦР? Практическое использование метода?

4.Что такое праймеры?

5.Каким методом обнаруживают ДНК в ПЦР?

Самостоятельная работа на кафедре

1.Записать схему постановки основного опыта РСК [с таблицы].

2.Познакомиться с постановкой основного опыта РСК [демонстрация]

3.Учесть и оценить результаты РСК. Зарисовать.

4.Изучить схему ПЦР по таблице и стенду, зарисовать.

Дополнительный материал

61

Реакция связывания комплемента (РСК) заключается в том,

что при соответствии друг другу антигенов и антител они образуют иммунный комплекс, к которому антител присоединяется комплемент, т.е. происходит связывание комплемента комплексом антиген - антитело. Если же комплекс антиген - антитело не образуется, то комплемент остается свободным. PCK проводят в две фазы: 1-я фаза - инкубация смеси, содержащей антиген + антитело + комплемент; 2-я фаза - выявление в смеси свободного комплемента путем добавления к ней гемолитической системы, состоящей из эритроцитов барана и гемолитической сыворотки, содержащей антитела к ним. В 1-й фазе реакции при образовании комплекса антиген - антитело происходит связывание им комплемента, и тогда во 2-й фазе гемолиз сенсибилизированных антителами эритроцитов не произойдет (реакция положительная). Если антиген и антитело не соответствуют друг другу (в исследуемом образце нет антигена или антитела), комплемент остается свободным и во 2-й фазе присоединится к комплексу эритроцит - антиэритроцитарное антитело, вызывая гемолиз (реакция отрицательная) (рис. 28).

Рисунок 28. Учетный признак отрицательной РСК

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – это циклическое удвоение (амплификация) определенного участка ДНК с помощью специфических праймеров( рис. 29) - особых ферментов-полимераз. Схема этапов ПЦР приведена на рис. 30.

62

Рисунок 29. Компоненты ПЦР

Каждый цикл амплификации включает 3 этапа, протекающих в рвзличных температурных режимах:

1 этап: Денатурация ДНК (расплетение двойной спирали). Протекает при 93-95ов течение 30-40 сек.

2 этап: Присоединение праймеров (отжиг). Присоединение праймеров происходит комплементарно к соответствующим последовательностям на противоположных цепях ДНК на границах специфического участка. Для каждой пары праймеровсуществет своя температура отжига, значения которой располагаются в интервале 5065оС. Время отжига -20-60 сек.

3 этап: Достраивание цепей ДНК. Комплементарное достраивание цепей ДНК происходит от 5’-конца к 3’-концу цепи в противоположных направлениях, начиная с участковприсоединенияпраймеров. Материалом для синтеза новыхцепей ДНК служат добавляемые в раствор дезоксирибонуклеотидтрифосфаты (дНТФ). Процесс синтеза катализируется ферментом термостабильной ДНК-полимеразой (Taqполимеразой) и проходит при температуре 70-72оС. Время протекания синтеза - 20-40 сек.

Образовавшиеся в первом цикле амплификации новые цепи ДНК служат матрицами для второго цикла амплификации, в котором происходит образование искомого специфического фрагмента ДНК (ампликона).. В последующих циклах амплификации ампликоны служат матрицей для синтеза новых цепей. Таким образом происходит накопление ампликонов в растворе по формуле 2n, где n- число циклов амлификации . Поэтому, даже если в исходном растворе первоначально находилась только одна двухцепочечная молекула ДНК, то за 30-40 циклов в растворе накапливается около 108 молекул ампликона. Этого количества достаточно для

63

достоверной визуальной детекции этого фрагмента методом электрофореза в агарозном геле. Процесс амплификации проводится в специальном программируемом термостате (амплификаторе), который по заданной программе автоматчески осуществляет смену температур согласно числу циклов амплификации( рис. 30).

Рисунок 30. Схема ПЦР

Тема практического занятия 13. Иммунологические реакции: иммуноферментный анализ, иммуноблотинг.

ЦЕЛИ: знать принципы реакции и методы постановки, учетные признаки, практическое применение.

Порядок проведения занятия:

1. Вступительное слово преподавателя (цели и задачи) – мин.

64

2.Объяснение нового материала, методические и организационные указания преподавателя по проведению занятия - мин.

3.Самостоятельная практическая работа студентов под руководством преподавателя, оформление и проверка протоколов – мин.

4.Обсуждение полученных результатов, проверка протоколов, подведение итогов практического занятия, заключительное слово преподавателя - мин.

Вопросы для самоконтроля

1.В чем состоит сущность реакций иммунитета с пименением меченых антигенов и антител :иммуноферментного анализа (ИФА) и иммуноблотинга?

2.Какие Вы знаете разновидности ИФА, ингредиенты, учетные признаки?

3.Каков механизм метода - иммуноблотинг, в диагностике каких заболеваний используют этот метод?

Самостоятельная работа

1.Учесть результаты экспресс-диагностики методом ИФ. Зарисовать.

2.Записать схемы постановки ИФА для определения АГ и АТ.

3.Познакомиться с диагностическими тест-системами для ИФА.

4.Учесть демонстрационный опыт ИФА. Зарисовать.

5.Изучить схему иммуноблотинга, зарисовать.

Дополнительный материал Методы проведения ИФА.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИГЕНОВ В ИССЛЕДУЕМОМ МАТЕРИАЛЕ

Стадии:

1. Сорбция известных антител на поверхности лунок полистироловой пластинки.

65

2.Отмывка неадсорбировавшихся антител.

3.Внесение в лунки планшета антигенсодержащего материала. Если антитела соответствуют антигену происходит образование невидимого комплекса АГ+АТ.

4.Отмывка несвязавшихся с антителами антигенов.

5.Добавление в лунки соответствующих антител, меченных пероксидазой хрена или другим ферментом. При этом происходит связывание меченных ферментом антител с имеющимся комплексом АГ+АТ.

6.Отмывка несвязавшихся антител, меченных ферментом.

7.Добавление хромогенного субстрата (5-аминосалициловая кислота с перекисью водорода).

При положительной реакции в течение 1 часа развивается коричневое окрашивание, интенсивность которого зависит от количества меченных антител, связанных в иммунный комплекс. Учет результатов производят при помощи специальных сканеров, позволяющих регистрировать незначительное изменение окраски субстрата (рис.31). Схема определения антител в сыворотке крови представлена на рисунке 32.

Иммуноблотинг - высокочувствительный метод выявления белков, основанный на сочетании электрофореза и ИФА.Антигены возбудителя разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, затем переносят их из геля на активированную бумагу (1) или нитроцеллюлозную мембрану и проявляют с помощью ИФА. Фирмы выпускают такие полоски с "блотами" антигенов. На эти полоски наносят сыворотку больного(2). Затем, после инкубации, отмывают от не связавшихся антител больного и наносят сыворотку против иммуноглобулинов человека, меченную ферментом (3). Образовавшийся на полоске комплекс - антиген + антитело больного + антитело против Ig человека выявляютдобавлением хромогенного субстрата (4), изменяющего окраску под действием фермента (рис. 33).

66