7.Какие реактивы используют для фиксации мазков по Граму?

8.Почему у бактерий разное отношение к окраске по Граму?

9.Какие микроорганизмы относятся к грамположительным?

10.Какие микроорганизмы относятся к грамотрицательным?

Самостоятельная работа на кафедре

1.Познакомиться с помещениями кафедры и оснащением микробиологической лаборатории.

2.Ознакомиться с оборудованием рабочего места студента,

техникой безопасности, расписаться в журнале за проведение инструктажа.

3.Познакомиться с принципами классификации прокариотов (по демонстрационной таблице).

4.Изучить по таблицам и демонстрационным микропрепаратам: смесь бактерий, стафилококк, кишечную палочку [зарисовать].

5.Под контролем преподавателя освоить основные приемы работы с бактериологической петлей и стерильными пробирками у пламени газовой горелки.

6.Приготовить микропрепараты из чистых культур стафилококка (кишечной палочки), окрасить по Граму.

Дополнительный материал

Правила работы в микробиологической лаборатории

1.Работа с заразным материалом требует особой тщательности и соблюдения правил безопасности при ее выполнении.

2.В помещении лаборатории необходимо строго соблюдать чистоту и порядок. На рабочем столе не должно быть никаких посторонних предметов. Запрещается прием пищи, излишние разговоры.

3.Работа в лаборатории обязательно проводится в халате, шапочке, сменной обуви.

4.Каждый студент имеет в лаборатории свое постоянное рабочее место.

5.Материал для работы принимает дежурный у лаборанта и раздает студентам в присутствии преподавателя.

6.Все предметы, использованные при работе с живой культурой, обезвреживаются в дезинфицирующих растворах или в пламени горелки.

7

7.В конце занятия студенты сдают весь материал лаборанту или преподавателю.

8.В конце занятия студент должен:

-привести в порядок свое рабочее место

-обработать руки дезинфицирующим раствором, а затем вымыть с мылом.

Приготовление микропрепарата для окраски

1.Предметное стекло обжигают в пламени газовой горелки. Восковым карандашом отмечают пределы будущего мазка в виде окружности диаметром 1-2 см и кладут стекло на стеклянные рельсы лотка. Прокаленной петлей вносят в середину кружка каплю стерильного физиологического раствора. Затем прокаленной петлей вносят небольшое количество культуры бактерий с питательного агара в пределах окружности, готовят мазок в пределах кружка. Петлю обеззараживают прожиганием.

2.Стекло оставляют на воздухе до полного высушивания.

3.Проводят фиксацию микропрепарата; фиксируют для того чтобы убить микробы, прикрепить микробы к стеклу, повысить восприимчивость к красителям. Для фиксации предметное стекло трижды накладывают на пламя горелки в верхней части на 2 секунды с интервалом 4 секунды, (суммарно в пламени 6 секунд).

Окрашивание по Граму

Этот метод позволяет все микроорганизмы разделить на две группы: грамположительные (Гр+) и грамотрицательные (Гр–). Грамположительные микроорганизмы окрашиваются в фиолетовый цвет, а грамотрицательные - в красный. Сущность окраски по Граму состоит в том, что отношение к краскам зависит от химического состава клетки и структурных особенностей клеточной стенки. В составе клеточной стенки грамположительных микроорганизмов большое количество пептидогликана, воздействие этиловым спиртом вызывает его разбухание, что приводит к уменьшению диаметра пор и снижению проницаемости клеточной стенки. Краситель не вымывается и микробная клетка не обесцвечивается. Кроме того, в поверхностном слое грамположительных микроорганизмов находиться магниевая соль рибонуклеиновой кислоты, которая в присутствии йода в кислой среде образует прочное соединение с основными красителями.

8

В клеточной стенке грамотрицательных микроорганизмов пептидогликановый слой меньше, диаметр пор больше и спирт легко проходит через клеточную стенку, вымывая краситель. Микробная клетка принимает цвет дополнительного красителя (красный). Например: Escherichiacoli (кишечная палочка Гр-) – окрашивается в розово-красный цвет.Staphylococcusaureus (Гр+) - окрашивается в фиолетовый цвет (рис. 1, таб. 1).

Escherichiacoli Staphylococcusaureus

Рисунок 3. Тинкториальные свойства Грам- и Грам+ бактерий

Техника окраски по Граму

1.На фиксированный мазок кладут фильтровальную бумагу, пропитанную 1%-ым спиртовым раствором генцианвиолета. Смачивают дистиллированной водой. Окрашивают 2 минуты.

2.Бумажку снимают и наносят раствор Люголя на 1 минуту.

3.Сливают раствор Люголя и препарат обесцвечивают 96%-ным этиловым спиртом в течение 20-30 секунд.

4.Тщательно промывают мазок дистиллированной водой.

5.Окрашивают мазок фуксином Пфейффера в течение 1 минуты.

6.Препарат промывают водой.

Высушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют с иммерсионной системой.

9

Палочки (спорообразующие): энтеробактерии, вибрионы;

бациллы, клостридии Извитые: спириллы, спирохеты,

Палочки (неспорообразующие): кампилобактерии.

коринебактерии, микобактерии, актиномицеты

Морфология бактерий

По форме бактерий подразделяют на три основные группы: шаровидные (кокки), цилиндрические (палочки) и извитые (рис.2).

Рисунок 2. Основные формы бактерий:

а– микрококки; б, в – диплококки; г – стрептококки;

д- стафилококки; е – тетракокки; ж – сарцины; з, и, к - палочки; л –

вибрионы; м – спириллы

Тема практического занятия 2. Микроскопический метод исследования. Микроскоп с иммерсионной системой.

10

ЦЕЛИ:знать устройство микроскопа с «сухой» и «иммерсионной» системами;принципы работы темнопольного и фазовоконтрастного, люминесцентного микроскопов; уметь микроскопировать с использованием иммерсионной системы.

Порядок проведения занятия:

1.Вступительное слово преподавателя (цели и задачи) - мин.

2.Контроль теоретической подготовки студентов – мин.

3.Объяснение нового материала, методические и организационные указания преподавателя по проведению занятия – мин.

4.Самостоятельная практическая работа студентов под руководством преподавателя, оформление и проверка протоколов – мин.

5.Обсуждение полученных результатов, проверка протоколов, итоги практического занятия, заключительное слово преподавателя – мин.

Вопросы для самоконтроля

1.В чем преимущества и недостатки микроскопического метода исследования? Дайте характеристику свойств микроорганизмов изучаемых с помощью микроскопии.

2.Чем отличаются работа микроскопа с иммерсионной системой и "сухой" системой?

3.Какова разрешающая способность микроскопа с иммерсионной системой?

4.В каких случаях для световой микроскопии используют объективы х8, х40, х90?

Самостоятельная работа на кафедре

11

1.Изучить устройство микроскопа с иммерсионной и «сухой» системами, зарисовать ход лучей.

2.Изучить и переписать в протокол занятия "Правила работы с иммерсионной системой".

3.Изучить по таблицам и демонстрационным микропрепаратам: смесь бактерий, стафилококк, кишечную палочку [зарисовать].

4.Под контролем преподавателя изучить устройство и освоить

5.Микроскопировать в микроскопе с иммерсионной системой микропрепараты из чистых культур стафилококка (кишечной палочки), окрашенные по Граму.

Дополнительный материал

Устройство и работа светового микроскопа

Микроскоп - сложный оптический прибор, используемый для изучения морфологии и тинкториальных свойств микроорганизмов. Принципиально все микроскопы устроены одинаково и состоят из механической части и оптической системы. Механическую часть составляют: основание микроскопа, тубусодержатель, тубус, система винтов для передвижения поля зрения, предметный столик и револьвер с объективами. Оптическую часть составляют - окуляр, объективы и осветительный аппарат (рис. 3).

12

Рисунок 3. Микроскоп МБР-1

1-основание; 2-предметный столик; 3-винты для перемещения предметного столик а; 4-клеммы; 5-конденсор; 6-кронштейн конденсора; 7-винт, укрепляющий конденсор ; 8-рукоятка перемещения конде нсора; 9-рукоятка ирисовой диафрагмы конденсора; 10-зеркало; 11-тубусодержатель; 12-рукоятка макрометрического ви нта; 13-рукоятка микрометрического винта; 14-револьвер; 15-объектив; 16-наклонный тубус; 17-винт для крепления тубуса; 18-окуляр.

Работ а с иммерсионной системой

13

использования иммерсионных жидкостей, у которых показатель преломления близок к показателю преломления стекла (рис. 4).

Рисунок 4. Схема лучей в иммерсионной системе

1 - объектив микроскопа; 2 - предметное стекло; 3 - объект исследования; 4 - иммерсионное масло; 5 - лучи света; 6 - фронтальная линза объектива.

Правила работы с иммерсионной системой

1.Поставить микроскоп перед собой.

2.Поднять конденсор до уровня предметного столика.

3.Открыть ирис-диафрагму.

4.Глядя сбоку в верхнюю линзу конденсора и вращая зеркало, найти изображение источника света.

5.Установить иммерсионный объектив.

6.На предметный столик поместить препарат с каплей иммерсионного масла.

7.Закрепить препарат клеммами.

8.Макровинтом опустить тубус до соприкосновения линзы

иммерсионного объектива ( 90) с маслом. Осторожно погрузить линзу в масло (под контролем глаз с боку).

9.Глядя в окуляр, макровинтом медленно поднимать тубус до появления изображения в поле зрения. Иммерсионные объективы имеют короткое фокусное расстояние (до 2,3 мм) поэтому наводить на резкость следует путем поднимания объектива, а не опускания его, так как при небольшом рабочем расстоянии можно раздавить препарат и повредить фронтальную линзу.

10.Вращая микровинт, не более чем на пол-оборота, добиться четкого изображения.

11.После просмотра препарата привести микроскоп в исходное состояние: макровинтом поднять тубус, снять препарат, закрыть

14

ирисдиафрагму, опустить конденсор, установить малое увеличение и снять масло с объектива кусочком салфетки.

Тема практического занятия 3. Структура бактериальной клетки.

ЦЕЛИ:знатьструктурные элементы бактериальной клетки, их функции и методы выявления;принципы работы темнопольного и фазовоконтрастного, люминесцентного микроскопов; изучить сложные методы окраски при выявлении структурных элементов.

Порядок проведения занятия:

5.Вступительное слово преподавателя (цели и задачи) - мин.

6.Контроль теоретической подготовки студентов – мин.

7.Объяснение нового материала, методические и организационные указания преподавателя по проведению занятия – мин.

8.Самостоятельная практическая работа студентов под руководством преподавателя, оформление и проверка протоколов – мин.

9.Обсуждение полученных результатов, проверка протоколов, итоги практического занятия, заключительное слово преподавателя – мин.

Вопросы для самоконтроля

1.Перечислите постоянные структурные элементы бактерий? Какова их функция?

2.Перечислите непостоянные структурные элементы бактерий? Какова их функция?

3.Какие структуры можно выявить, используя методы окраски?

4.Какие методы используются для выявления подвижности бактерий?

15

Самостоятельная работа на кафедре

1.Изучить по таблицам обязательные структурные элементы бактерий: клеточную стенку, цитоплазматическую мембрану, цитоплазму с нуклеоидом.

2.Изучить по таблицам необязательные структурные элементы: жгутики, капсулу, споры, включения и пили бактерий.

3.Изучить по демонстрационным препаратам споры антракоидной палочки (Bacilluscereus, окраска по Цилю-Нильсену), капсулу клебсиеллы пневмонии (Klebsiellapneumoniae, окраска по БурриГинсу), включения волютина дифтерийной палочки

(Corynebacteriumdiphtheriae, окраска уксуснокислым генцианвиолетом) [зарисовать].

4.Познакомиться с приготовлением препаратов "раздавленная капля" и "висячая капля" из культуры бактерий (демонстрация).

5.Изучить подвижность бактерий в ультрамикроскопе. Отметить особенности микроскопии (свет, объектив).

6.Познакомиться с другими методами изучения подвижности бактерий (посев уколом в столбик полужидкой среды подвижных и неподвижных бактерий). Отметить в протоколе.

Дополнительный материал

Рисунок 5.Строение бактериальной клетки

16

Обязательные (постоянные) структурные элементы.

Обязательными структурными элементами бактерий являются:

цитоплазма с рибосомами, нуклеоид, цитоплазматическая мембрана (ЦПМ), клеточная стенка(рис. 5).

Цитоплазма прокариотов не содержит митохондрий и хлоропластов, аппарата Гольджи, лизосом, эндоплазматической сети. Нуклеоид выполняет в клетке бактерий функцию ядра, т.е. является носителем генетической информации.Нуклеоид состоит из замкнутой в кольцо нити ДНК. В генетическом отношении ДНК нуклеоида является единственной бактериальной хромосомой. В связи с этим бактерии имеют гаплоидный набор генов, контролирующих все их жизненно важные функции. Органеллы цитоплазмы выявляются при электронной микроскопии.

Цитоплазматическая мембрана ограничивает снаружи цитоплазму и состоит из тонкого слоя фосфолипидов и белка. Функции ЦПМ: получение энергии в результате биологического окисления, участие в питании посредством активного транспорта веществ, участие в биосинтезе веществ, делении клетки. В состав ЦПМ входят окислительные ферменты, пермеазы, различные биосинтетические ферменты. ЦПМ выявляют при электронной микроскопии. Клеточная стенка у Гр+ бактерии, как правило, содержит многослойный пептидогликан, который придает клеточной стенке прочность. Клеточная стенка определяет форму бактерий, служит для механической защиты, участвует в питании за счет диффузии и осмоса. У Грбактерий клеточная стенка представлена тонким слоем пептидогликана, покрытогонаружной мембраной, в состав которой входят белки, фосфолипиды и липополисахариды (ЛПС). Наружная мембрана клеточной стенки патогенных микробов во многом определяет специфичность их взаимодействия с организмом хозяина и помогает в распознавании близкородственных микробов. Клеточную стенку бактерий выявляют при электронной микроскопии, специальным окрашиванием или в опыте плазмолиза.

Необязательные (дополнительные) структурные элементы

К необязательным структурным компонентам бактериальной клетки относятся: спора, капсула, жгутики, пили,

внутриклеточные включения (зерна волютина, жира,

17

гликогена)(рис. 5). Для выявления данных структурных элементов используют сложные методы окраски. Сущность этих методов заключается в воздействии на мазок двух или более красящих веществ. Сложные методы окраски имеют важное дифференциальнодиагностическое значение.

При неблагоприятных условиях для микробов (отсутствие питательной среды, высушивание, неблагоприятная температура и др.) в цитоплазме некоторых микроорганизмов образуются споры. Формируются они внутри вегетативной клетки, являясь эндоспорами. Палочковидные грамположительные микроорганизмы, образующие споры, диаметр которых не превышает ширину микробной клетки, относятся к роду Bacillus и называются бациллами. Микроорганизмы рода Clostridium имеют споры, диаметр которых превышает ширину микробной клетки, и называются клостридиями (рис. 6). Споры устойчивы к воздействию высоких температур, химических веществ, к высыханию, длительно сохраняются в почве, что объясняется их особым строением и химическим составом, в особенности ее оболочки. Поэтому споры стойки к действию красителей. Все методы окраски спор основаны на обеспечении проникновения красителя через оболочку споры (окраска по Цилю-Нильсену, Ожешке, Пешкову, Вертцу-Канклину). При окраске методом Циля-Нильсена спора приобретает розово-красный, клетка – голубой цвет.

Рисунок 6.Споры бацилл и клостридий

Капсула - муциноподобное вещество, высокомолекулярный полисахарид. Наличие капсулы является важным диагностическим признаком при идентификации и дифференциации возбудителей некоторых инфекций (сибирской язвы, пневмококковой пневмонии и др.). Патогенные микроорганизмы образуют капсулу в инфицированном организме. Она является фактором вирулентности и защищает бактериальную клетку от фагоцитоза и бактерицидного действия сыворотки крови (рис. 7).

18

Капсульное вещество плохо окрашивается, основной метод окраски по Бурри-Гинсу. При этом бактерии окрашиваются в красный цвет, капсулы не окрашиваются и контрастно выделяются на темном фоне препарата (рис. 7).

Рисунок 7. Капсула у бактерий а - бацилла сибирской язвы; б – клебсиелла пневмонии

Подвижности бактерий важный видовой признак микроорганизмов. У подвижных видов способность самостоятельного движения обусловлена наличием жгутиков - специальных тонких нитевидных образований. Жгутики бывают различной длины. Их диаметр настолько мал, что они невидимы в световом микроскопе. В зависимости от расположения и количества жгутиков микробы подразделяют:

а) монотрихимикроорганизмы, имеющие на одном из полюсов один жгутик, движения активные, поступательные (псевдомонады);

б) лофотрихи - микробы, имеющие на одном из полюсов пучок жгутиков (листерии);

в) амфитрихи - микробы, имеющие жгутики на обоих полюсах микробной клетки;

г) перитрихимикробы, у которых жгутики расположены по всей поверхности клетки (кишечная палочка) (рис.8).

Рисунок 8 . Типы расположения жгутиков у бактерий

19

Жгутики плохо воспринимают красители. Основные методы окраски: серебрение по Морозову, методы Грея, Леффлера, Шенка.

Для определения подвижности у бактерий используют косвенные методы: темнопольную микроскопию препаратов «раздавленная» или «висячая» капля, посев в полужидкую питательную среду.

Приготовление микропрепарата для темнопольной микроскопии

1.«Раздавленная капля» - на середину предметного стекла петлей наносят каплю бульонной культуры микроорганизма; сверху накрывают покровным стеклом так, чтобы не появились пузырьки воздуха; жидкость не должна выступать за пределы покровного стекла

2.«Висячая капля» - каплю бульонной культуры микроорганизма петлей наносят в центр покровного стекла, края которого смазывают вазелином; затем на покровное стекло накладывают предметное стекло с лункой (лункой к покровному стеклу); осторожно переворачивают, чтобы капля висела на покровном стекле в пределах лунки (рис. 9). Препарат микроскопируют при затемненном поле зрения, сначала при малом, затем при среднем или большом увеличении. На светлом фоне микробы темно-серые.

Рисунок 9. Определение подвижности микробов

а - стекло с луночкой; б - «висячая капля»

Метод посева уколом в полужидкий агар

Для этого бактериологическойпетлей производят посев исследуемой культуры уколом до дна пробирки с полужидкой питательной средой. Подвижная культура растет по всей питательной среде, образуя равномерное помутнение, а неподвижная - только по

20

уколу в виде стержня, сохраняя прозрачность незасеянного участка среды.

Тема практического занятия 4. Питание бактерий. Питательные среды.

ЦЕЛИ: знать механизмы и типы питания бактерий; классификацию питательных сред и их применение; уметь обосновать выбор питательных сред культивирования бактерий;

Порядок проведения занятия:

1.Вступительное слово преподавателя (цели и задачи) - мин.

2.Контроль теоретической подготовки студентов – мин.

3.Объяснение нового материала, методические и организационные указания преподавателя по проведению занятия – мин.

4.Самостоятельная практическая работа студентов под руководством преподавателя, оформление и проверка протоколов – мин.

5.Обсуждение полученных результатов, проверка протоколов, итоги практического занятия, заключительное слово преподавателя – мин.

Вопросы для самоконтроля

1.Как делятся бактерии по типу усвоения углерода? Азота?

2.Назовите основные механизмы питания бактерий.

3.Какие требования предъявляются к питательным средам?

4.Какие питательные среды относят к «простым»? Примеры.

5.Чем отличаются «специальные» и «элективные» питательные среды? Примеры.

6.Скакой целью используются «дифференциальнодиагностические» среды? Примеры и принципы их работы.

7.Что понимают под культуральными свойствами бактерий?

Самостоятельная работа на кафедре

1.Изучить по таблице механизмы питания бактерий.

2.Изучить и внести в протокол классификацию искусственных питательных сред (с примерами).

21

3.Познакомиться с рецептами приготовления питательных сред по этикеткам сухих сред. Записать в протокол рецепт приготовления одной из них. Определить ее назначение (принадлежность к группе).

4.Познакомиться с набором приготовленных питательных сред: ПБ, ПА (столбик и скошенный, в чашке Петри), сывороточный ПА, среды Эндо, Плоскирева, висмут-сульфитный агар, пестрый ряд Гисса, среда Сабуро, казеиново-угольный агар (КУА), среда КиттаТароцци, тиогликолевая среда.

5.Изучить характер роста различных бактерий на жидких средах: пленка, осадок, равномерное помутнение. Отметить в протоколе.

6.Изучить и описать характер колоний на плотных средах: стафилококка - на кровяном ПА, брюшнотифозной и кишечной палочки - на среде Эндо.

Дополнительный материал

Культуральные свойства - это способность микробов расти на определенных средах с образованием характерного роста (скоплений). По мере размножения в жидкой среде одни микробы образуют помутнение, другие - плёнку или осадок, которые могут появиться уже через 18-24 ч после посева. На плотной среде в месте посева бактерии могут образовывать колонии - макроскопические скопления микробов одного вида, потомство одной микробной клетки. В состав сред, применяемых для выращивания бактерий, входят необходимые для построения белков цитоплазмы азот, углерод. Потребность в кислороде и водороде бактерии удовлетворяют главным образом за счет поступающей в клетку воды. Кроме этого, микробам необходимы неорганические соединения макро и микроэлементы. Они выполняют роль катализаторов химических процессов и и необходимы в малых количествах.

По консистенции различают плотные и жидкие питательные среды. Плотные питательные среды готовят из жидких посредством прибавления к ним агара. Агар-агар - продукт растительного происхождения, добываемый из морских водорослей.

Питательные среды должны:

содержать необходимые для питания микроба питательные вещества.

22

иметь реакцию рН, оптимальную для выращиваемого вида микроба.

иметь достаточную влажность, так как микробы питаются по законам диффузии и осмоса.

быть стерильными, обеспечивая тем самым возможность выращивания чистых культур микробов.

обладать изотоничностью.

Питательные среды подразделяются на среды общего назначения и специальные. К первой группе относятся пептонные: агар, бульон, питательный желатин. Среды общего назначения используют для выращивания многих патогенных микробов и применяют в качестве основы для приготовления специальных сред, добавляя к ним кровь, сахар, молоко, сыворотку и другие ингредиенты, необходимые для размножения того или иного вида микроба. К специальным питательным средам относятся элективные (избирательные) и дифференциально-диагностические. Принцип создания элективных питательных сред основан на удовлетворении основных биохимических и энергетических потребностей определенного вида микроба. Элективные среды: селенитовый бульон, солевой бульон, желточно-солевой агар, щелочной агар. В

состав дифференциально-диагностических сред, предназначенных для выявления сахаролитических и окислительно-восстановительных ферментов, вводят индикаторы (среда Гисса, Эндо, Клиглера, Олькеницкого). Изменяя свою окраску при различных значениях рН, индикатор указывает на наличие или отсутствие расщепления, окисления или восстановления введенного в среду ингредиента.

Тема практического занятия 5. Методы культивирования. Ферменты. Пигменты бактерий.

ЦЕЛИ:знать основные принципы и методы культивирования микроорганизмов;уметь обосновать выбор питательных сред для культивирования бактерий; знать диагностическую значимость ферментов и пигментов бактерий; учитывать результаты определения биохимических признаков на средах Гисса и, пользуясь таблицей, определять вид бактерий.

23

Порядок проведения занятия:

1.Вступительное слово преподавателя (цели и задачи) - мин.

2.Контроль теоретической подготовки студентов – мин.

3.Объяснение нового материала, методические и организационные указания преподавателя по проведению занятия – мин. 4.Самостоятельная практическая работа студентов под руководством преподавателя, оформление и проверка протоколов

– мин.

5.Обсуждение полученных результатов, проверка протоколов, итоги практического занятия, заключительное слово преподавателя

– мин.

Вопросы для самоконтроля

1.На чем основаны принципы и методы культивирования микроорганизмов?

2.Что понимают под культуральными свойствами бактерий?

3.Какие вы знаете ферменты бактерий?

4.Как ферментативную активность бактерий используют для их идентификации?

5.Какие Вы знаете пигменты бактерий их роль для бактерий? Для чего их изучают?

Самостоятельная работа на кафедре

1.Познакомиться с техникой посевов и пересевов микроорганизмов на жидкие, плотные питательной среды, на «скошенный» ПА и со «скошенного» ПА на жидкую среду.

2.Изучить и описать характер колоний на плотных средах: стафилококка - на кровяном ПА, брюшнотифозной и кишечной палочки - на среде Эндо.

3.Учесть результаты демонстрационных посевов двух видов бактерий на среды Гисса и ПБ с индикаторными бумажками на сероводород и индол, отметить в протоколе и по демонстрационным таблицам определить вид.

4.По демонстрационным посевам познакомиться с ферментами стафилококка: плазмокоагулазой и лецитиназой, отметить в протоколе.

5.Изучить по таблице пигменты бактерий и демонстрационные посевы с пигментобразующими бактериями.

24

Дополнительный материал Техника посева микроорганизмов.

Жидкий материал для посева берут петлей или пипеткой. При взятии петлей жидкость должна образовать в кольце петли тонкую прозрачную пленку - “зеркало”. Пипетками пользуются в том случае, когда материал засевают в большом или точно отмеряемом объеме. Способ взятия плотного материала определяется его консистенцией. При посевах чаще всего пользуются бактериальной петлей. Все манипуляции, связанные с посевом и выделением микробных культур, производят над пламенем горелки. Бактериальную петлю прокаливают над пламенем непосредственно перед взятием материала, затем петлю остужают. Для этого при пересеве микробной культуры с пробирки горячую петлю погружают в конденсационную жидкость, а при пересеве с чашек Петри прикасаются к поверхности питательной среды, свободной от микробного роста. Достаточно остуженная петля не вызывает шипения конденсационной жидкости и не растапливает агар при соприкосновении со средой. После окончания посева петлю прожигают повторно для уничтожения находящейся на ней микробной культуры или инфицированного микроорганизмами материала. Пипетки и шпатели, используемые для посевов и опускают в дезинфицирующий раствор. После посева на чашках Петри со стороны дна, на пробирках в верхней трети надписывают название засеянного материала, ставят номер анализа и дату посева.

Техника посевов на плотные и жидкие питательные среды:

1. При посеве в жидкую питательную среду петлю с находящимся на ней материалом погружают в среду. Если материал вязкий и с петли не снимается, его растирают на стенке сосуда, а затем смывают жидкой средой. Жидкий материал, набираемый в пастеровскую или градуированную пипетку, вливают в питательную среду.

25

Рисунок 10. Схема пер есева микробов из пробирки в пробирку.

2.При посеве на скошенный ПА пробирку беру т в левую руку между 1 и II пальцами, чтобы основание пробирки находилось на поверхности кисти руки и посев осуществлялся под контролем глаза. Пробку из пробирки вынимают правой рукой V и IV пальцами, не прикасаясь к той част и пробки, которая входит внутрь пробирки. Остальные 3 пальца правой руки остаются свободн ыми для взятия бактериальной петли, посредством которой производится посев. Петлю держат, как писчее перо. После вынимания про бки пробирку с питательной средой д ержат в наклонном положени и во избежание попадания в нее посторонних микроорганизмов из во здуха. Петлю с находящимся на ней пе ресеваемым материалом вводят в пробирку до дна, опускают плашмя на поверхность питател ьной среды и скользящими движениями наносят штрих снизу вверх, от одной стенки пробирки к дру гой смотри рис.10.

3.При посеве н а поверхность плотной питательной среды в чашки Петри чашку держат в левой руке. Дно ее с одной стороны придерживают 1 и II пальцами, а с другой —IV и V пальцами.

Крышку, приоткрытую настолько, чтобы в образов авшуюся щель свободно проходили п етля или шпатель, фиксируют 1 и III или 1 и II пальцами (рис.11). Небольшое количество исследуе мого материала втирают бактериальной петлей в поверхность питат ельной среды у

26

края чашки. Затем петлю прожигают, чтобы уничтожить избыток находящегося на ней м атериала. Линию посева начи нают с того места, в котором наход ится материал. Бактериальную петлю кладут плашмя на питательную среду, чтобы не поцарапать ее поверхности, и проводят штрихи по всей среде или по секторам, разграфив предварительно дно чашки (при условии, что среда прозрачна) на несколько равных частей. Нужно стараться, чтобы штрихи, наносимые петлей, располагались как можно ближе друг к другу, так как это удлиняет общ ую линию посева и дает во зможность для равномерного распред еления засеваемого материала по поверхности плотной питательной среды. Можно пользоваться вместо петли тампоном или шпателем.

Рисунок 11.Посев на плотную питательную среду в чашки Петри.

При обилии в засе ваемом материале микробов он и растут в виде пленки, покрывающей всю поверхность питательно й среды. Такой характер микробного роста получил название с плошного, или газонного. Посев газоном производят, когда нужно по лучить большие количества микробной культуры одного вида.

4. Из материал а, подлежащего посеву в толщу плотной питательной среды, го товят взвесь в стерильной водопроводной воде или в изотоническом растворе. Набирают 0,1—1 мл взвеси в пипетку (в зависимости от степени предполагаемого микробного загрязнения) и выливают в пустую стерильную чашку Петри. Всле д за этим чашку заливают 15 - 20 мл ПА, расплавленного и остуженного до температуры 40 – 450С (при такой температуре проби рка со средой, приложенная к щеке, не должна вызывать ощущения ожога). Для равномерного распред еления исследуемого материал а в питательной

27

среде закрытую чашку с содержимым слегка вращают по поверхности стола.

5. Посев уколом в столбик питательной среды производят в пробирку со средой, застывшей в виде столбика. Пробирку берут в левую руку, как обычно, и в центре столбика до дна пробирки вкалывают петлю с находящимся на ней материалом.

Ферменты бактерий – это высокоспециализированные белки, специфически катализирующие многочисленные химические реакции, происходящие в микробной клетке.

Классификация бактериальных ферментов:

По локализации:

-экзоферменты – ферменты, выделяемые наружу, в окружающую среду; расщепляют сложные органические вещества до более простых молекул, которые способны проходить через ЦПМ;

-эндоферменты функционируют внутри клетки, осуществляя дальнейшее расщепление питательных веществ, а также участвуют в синтезе структур бактериальной клетки.

По субстрату воздействия:

-сахаролитические;

-протеолитические;

-липолитические.

По концентрации в окружающей среде:

-конститутивные – это ферменты микроорганизов, всегда синтезирующиеся с постоянной скоростью и присутствующие в клетке в постоянных концентрациях (синтез их запрограммирован), например, ферменты гликолитического пути;

-индуцибельные (адаптивные) – это ферменты, концентрация которых резко изменяется в зависимости от наличия или отсутствия в среде субстрата;

-репрессибельные – это ферменты, синтез которых подавляется в результате избыточного накопления продукта реакции, катализируемой данным ферментом.

Методы изучения ферментативной активности.

Для определения сахаролитических ферментов используют среды с сахарами:

28

среды Гисса (пестрый ряд):

-жидкие – пептонная вода, индикатор Андреде (кислый фуксин), углеводы, спирты;

-полужидкие – пептонная вода, 0,5% агар-агар, индикатор бромкрезол, углеводы, спирты; -короткие – содержащие моносахара и дисахара (глюкоза, мальтоза, лактоза, сахароза, маннит);

-длинные – короткий ряд + моносахара (арабиноза, ксилоза, рамноза, галактоза и др.), полисахариды (инулин, крахмал и др.), спирты (глицерин, дульцит, инозит и др.).

среда Ресселя – двухсахарныйагар (лактоза, глюкоза) и

индикатор бромтимоловый синий, Олькеницкого – трехсахарныйагар (лактоза, сахароза, глюкоза), индикатор нейтральный красный и соль Мора для выявления H2S.

Под действием сахаролитических ферментов бактерий углеводы и многоатомные спирты расщепляются до кислоты/кислоты и газа.Для обнаружения газа в жидкие среды помещают поплавки, которые при образовании газа всплывают, а в полужидких – заметно появление пузырьков. Для обнаружения кислоты добавляют индикатор, который под ее действием изменяет цвет.

среды Эндо, Левина, Плоскирева – МПА с лактозой и индикаторами – фуксином, метиленовым синим и нейтральным

красным соответственно.

У бактерий, ферментирующих лактозу (лактоза+), колонии окрашиваются в цвет индикатора и приобретают металлический блеск, у лактоза– бактерий колонии остаются бесцветными.

Для определения протеолитических ферментов используют:

определение конечных продуктов распада белков (индол, H2S, аммиак);

Сероводород, индол и аммиак определяют, помещая под пробку пробирки с растущей на МПБ культурой индикаторные бумажки:

-индол (выделяется при разложении триптофана), окрашивает в розовый цвет индикаторную бумажку, пропитанную щавелевой кислотой;

-H2S (продукт распада серосодержащих аминокислот – цистеина, метионина), реагируя с ацетатом свинца на индикаторной

29

бумажке, превращается в сульфат свинца и окрашивает бумажку в черный цвет; - о наличии аммиака свидетельствует посинение лакмусовой бумажки.

способность разжижать желатин (в виде воронки, перевернутой елочки);

способность свертывать или пептонизировать плазму крови и

молоко.

Пигменты бактерий – это специфические фоторецепторные молекулы, вторичные метаболиты, образующиеся на свету и придающие бактериям окраску. (Наличие у бактерий пигментов обычно связано с их способностью существовать за счет энергии света. Некоторые микроорганизмы утратили способность к фотосинтезу, но сохранили пигменты.Способность образовывать пигменты детерминирована генетически и используется в качестве диагностического признака. Образование пигментов зависит от состава среды и условий культивирования. У многих микроорганизмов образование пигмента происходит только на свету. Пигменты различают по химическому составу и цвету.

Значение пигментов:

защита от действия видимого света и УФ-лучей;

ассимилируют углекислый газ;

обезвреживают токсичные кислородные радикалы;

участвуют в синтезе витаминов;

обладают антибиотическим действием и свойствами биологически активных веществ;

цвет пигмента используют в идентификации бактерий.

и окрашивать не только колонии, но и питательные среды);

спирторастворимые (каротиноидные, пирроловые);

нерастворимые ни в воде, ни в сильных кислотах (меланиновые).

Таблица 2 Классификация пигментов по химическому составу и цвету.

5.Как выделяют чистую культуру аэробов? Перечислите этапы исследования по дням.

6.Чем отличается выделение чистой культуры анаэробов и аэробов?

Самостоятельная работа на кафедре

1.Познакомиться с устройством термостата.

2.Познакомиться с техникой выделения чистой культуры аэробов из материала, содержащего смесь бактерий (демонстрация преподавателя).

3.Познакомиться с методами культивирования анаэробов рода Clostridium в высоком столбике сахарного агара, на среде КиттаТароцци, в анаэростате, системе «Gas-Pack», эксикаторе (демонстрация преподавателя).

4.Познакомиться по схемам с особенностями выделения чистых культур аэробов и анаэробов (зарисовать).

5.Познакомиться с ходом исследования по выделению чистой культуры клостридий: а) изучить микропрепарат из раневого отделяемого при газовой гангрене, зарисовать; б) изучить и зарисовать демонстрационный препарат из чистой культуры

Clostridiumperfringens (окраска по Граму).

Дополнительный материал

Получение чистых культур.

Чистая культура необходима для изучения морфологических, культур культуральных, биохимических и антигенных свойств, по совокупности которых определяется видовая принадлежность исследуемого микроорганизма.

Наибольшее распространение получил метод механического разъединения микроорганизмов, находящихся в исследуемом материале, с целью получения изолированных колоний на поверхности или в глубине питательной среды. Очень широко применяются элективные питательные среды, стимулирующие развитие тех микроорганизмов, чистую культуру которых предполагается выделить. Из чистой культуры обычно вырастают одинаковые колонии и при микроскопировании выявляются похожие клетки, в частности по размеру и окраске по Граму. Однако

32

возможны исключения, например, колонии, вырастающие из чистой культуры, могут быть гладкие (S) и шероховатые (R). Кроме того, в чистых культурах различных микроорганизмов могут появиться кокковидные клетки, цисты и споры. Наконец, некоторые микроорганизмы проявляют грамвариабельность. Посев штрихом. Существует много методов посева штрихом в чашки с твердыми средами (“штрихованные чашки”), но лишь некоторые из них почти всегда дает хорошо изолированные колонии даже при отсутствии навыков у экспериментатора. Кроме того, можно наливать разведенные растворы смешанной культуры на поверхность твердых сред в чашках. При работе с анаэробами “штрихованные чашки” или чашки с внесенной в них жидкой культурой в атмосфере воздуха инкубируют затем в анаэростате. Для анаэробов необходимы свежеприготовленные среды, и посев штрихом следует проводить в течение первых 4 ч после их автоклавирования, чтобы избежать накопления растворенного кислорода.

Посевы инкубируют опрокинутые вверх дном чашки для того чтобы конденсирующаяся вода с крышки не попала на поверхность агара. В секторе 1 вырастает большое число колоний, тогда как в секторах 2 и 3 появляются отдельные хорошо изолированные колонии.

Выделение чистой культуры по способу Дригальского. Расплавленную питательную среду разливают в три чашки Петри. Застывшую среду обязательно подсушивают, так как влажная поверхность ее способствует образованию сливающегося роста. В первую чашку вносят одну каплю исследуемого материала и стерильным шпателем втирают его в поверхность питательной среды. Далее, не прожигая шпателя и не набирая нового материала, шпатель переносят во вторую и третью чашки, втирая в поверхность питательных сред оставшийся на нем материал. Метод рассева по поверхности, предложенный Дригальским, является наиболее употребительным для получения чистой культуры микробов. Вместо шпателя можно пользоваться петлей. Материал на питательной среде распределяют параллельными штрихами по всей чашке в одном направлении. Затем, повернув чашку на 180°, проводят штрихи в направлении, перпендикулярном первым штрихам. При таком способе посева материал, находящийся на петле, расходуется посте-

33

пенно, и по линиям сетки, нанесенным в конце посева, вырастают изолированные колонии микробов.

Выделение чистой культуры бактерий-аэробов занимает 3 дня:

1 день:

а) микроскопия мазка из материала (для ориентировочного суждения о составе микрофлоры); б) посев материала на МПА в чашке истощающим штрихом (для

получения изолированных колоний); в) инкубирование в термостате (37°С) 2 день:

а) изучение и выбор изолированных колоний; б) микроскопия мазков из изолированных колоний для суждения об однотипности микробов в колонии;

в) пересев остатка колонии на скошенный питательный агар(для получения чистой культуры); г) инкубирование в термостате (37°С).

3 день:

а) микроскопия мазков из чистой культуры на скошенном ПА (для контроля чистоты просматривают не менее 40 полей зрения); б) изучение других свойств выделенной чистой культуры.

Методы культивирования анаэробов основаны на удалении кислорода из питательной среды и из атмосферы (используют механическое и физическое удаление или замещение, химическое или биологическое связывание О2)

-перед посевом среды регенерируют (кипятят и быстро охлаждают);

-делают посевы в высокие столбики среды Китта-Тароцци в пробирках;

-наслаивают поверх питательной среды вазелиновое масло;

-культивируют ванаэростате, из которого откачан воздух и замещён инертным газом или бескислородной смесью (рис. 12,13);

-культивируют в эксикаторе, на дно которого помещены химические поглотители кислорода (щелочной раствор пирогаллола и др.);

-культивируют в герметично закрытой чашке с плотной, средой, на две половины которой отдельно засевают анаэробы и аэробы, которые в ходе размножения поглощают кислород (метод Фортнера) (рис. 14).

34

Рисунок 12. Анаэростаты

Рисунок 13. Рост анаэробов в среде Китта-Тароцци (помутнение и газообразование)

Рисунок 14. Культивирование анаэробов методом Фортнера

35

Выделение чистой культуры анаэробов занимает 4 дня,

исследование ведут в анаэробных условиях на специальных средах: 1 день:

а) микроскопия мазка из материала (для ориентировочного суждения о составе микрофлоры); б) посев материала в среду Китта-Тароцци. Посев заливают вазелиновым маслом;

в) инкубирование в термостате (37°С) 2 день:

а) отмечают признаки роста на питательной среде (помутнение и газообразование); б) пересев в высокие столбики сахарного агара методом Вейнберга

(для получения изолированных колоний). Посев заливают вазелиновым маслом; в) инкубирование в термостате (37°С).

3 день:

а) просматривают посевы, отмечают изолированные колонии, проводят микроскопию и пересев на среду Китта-Тароцци для выделения чистой культуры. Посев заливают вазелиновым маслом; б) инкубирование в термостате (37°С).

4 день:

а) микроскопия мазков из чистой культуры (для контроля чистоты просматривают не менее 40 полей зрения); б) изучение других свойств выделенной чистой культуры.

Тема практического занятия 7. Стерилизация.Дезинфекция. Принципы работы центрального стерилизационного отделения.

ЦЕЛИ: знать влияние физических и химических факторов на микроорганизмы и их использование в медицине, методы, аппаратуру и режимы стерилизации; важнейшие методы и средства дезинфекции; принцип работы ЦСО; уметь обосновать методы стерилизации и дезинфекции, их контроля; подготовить материал к стерилизации.

Порядок проведения занятия:

1. Вступительное слово преподавателя (цели и задачи) – мин.

36

2.Объяснение нового материала, методические и организационные указания преподавателя по проведению занятия - мин.

3.Самостоятельная практическая работа студентов под руководством преподавателя, оформление и проверка протоколов – мин.

4.Обсуждение полученных результатов, проверка протоколов, подведение итогов практического занятия, заключительное слово преподавателя - мин.

Вопросы для самоконтроля

1.Дать определение дезинфекции и стерилизации.

2.Перечислите методы дезинфекции. От чего зависит выбор метода?

3.Перечислите химические группы препаратов для дезинфекции с примерами.

4.Назовите уровни и технику обеззараживания рук медицинского персонала.

5.Как контролируют эффективность дезинфекции?

6.Что такое асептика?

7.Что понимают под антисептикой? Примеры.

8.Перечислите методы стерилизации. От чего зависит выбор метода?

9.Какие материалы можно стерилизовать дробными методами теплового воздействия?

10.Назовите аппаратуру, основные режимы и стерилизуемые материалы при тепловых методах стерилизации.

11.Какие материалы стерилизуют ионизирующим излучением?

Самостоятельная работа на кафедре

1.Познакомиться с подготовкой посуды, перевязочного материала, инструментов к стерилизации (демонстрация). Подготовить к загрузке в паровой стерилизатор бикс со стерилизуемыми материалами.

2.Познакомиться с устройством и работой стерилизующей аппаратуры.

3. Познакомиться с результатами контроля работы парового и воздушного стерилизаторов. Дать оценку.

37

4.Приготовить для стерилизации посуду (пробирки, тампоны, флаконы, пипетки и др.) поместить в воздушный стерилизатор.

5.Учесть результаты опыта по изучению действия УФ-лучей на золотистый стафилококк. Отметить в протоколе занятия.

6.Учесть опыт по изучению действия 1% растворов хлорамина и натриевой соли 3-хлоризоциануровой кислоты на стафилококк, кишечную палочку и спорообразующую антракоидную палочку при экспозициях 5 и 30 минут. Результаты оформить в виде таблицы, записать выводы.

7.Получить набор дезинфицирующих веществ разных групп, определить их принадлежность (группу) и отметить в протоколе.

Дополнительный материал

Дезинфекция – это комплекс мероприятий, направленных на уничтожение в объектах конкретных патогенных микробов. В медицине применяют физические (механическое воздействие, действие высокой температуры, ультрафиолетовое облучение) и химические методы дезинфекции (использование химических веществ).

Таблица 3

Спектр эффективности различных групп активных веществ

38

Примечания: (++) — очень эффективно; (+) — эффективно; (+—) — эффективно в определенных случаях; (—) - неэффективно.

Обработка рук медицинского персонала.

Цель:

Профилактика внутрибольничной инфекции.

Личная безопасность и безопасность пациента.

Выделяют 3 уровня обеззараживания рук:

социальный;

гигиенический;

хирургический.

Рисунок 15.Количество микробных колоний в смыве рук: а) - немытых; б) - вымытых только водой; в) - вымытых водой с мылом.

I. Социальный уровень.

Показания:

1. Перед приемом пищи.

39

2.После посещения туалета.

3.Перед и после ухода за пациентом.

4.При загрязнении рук.

Оснащение.

Мыло (жидкое или кусковое).

Бумажные салфетки.

Бумажное полотенце или чистое сухое полотенце из хлопчатобумажной ткани.

Техника выполнения:

1.Снять с рук все кольца, часы.

2.Открыть водопроводный кран, используя бумажную салфетку, чтобы избежать контакта с имеющимися на кране микроорганизмами.

3.Намылить ладони.

4.Вымыть руки путем энергичного трения ладоней в течение 10 секунд.

5.Смыть мыло под проточной водой, держа руки так, чтобы запястья и кисти были выше уровня локтей: в этом положении вода течет от чистой зоны к грязной.

6.Закрыть водопроводный кран, используя бумажную салфетку.

7.Высушить руки приготовленным полотенцем.

Примечания.

При использовании кускового мыла - ополоснуть его и положить в мыльницу с решеткой.

При пользовании жидким мылом необходимо сохранять его в сухом виде, подвешивая или храня в специальной емкости.

При отсутствии проточной воды может быть использован таз с водой.

II. Гигиенический уровень.

Показания:

1. Перед выполнением инвазивных манипуляций.

40

2.Перед уходом за пациентами с ослабленным иммунитетом.

3.Перед одеванием и после снятия перчаток.

4.После контакта с биологическими жидкостями организма или после возможного микробного загрязнения.

Оснащение:

Мыло жидкое или кусковое.

Кожный антисептик (применяется один из указанных):

4% водный раствор хлоргексидинабиглюконата;

70° этиловый спирт;

сагросепт;

асептинол;

0,5% спиртовой раствор хлоргексидина;

другие современные кожные антисептики. Бумажные салфетки.

Полотенце бумажное или чистое сухое из хлопчатобумажной ткани.

Техника выполнения:

1.Снять с рук все кольца и часы.

2.Открыть водопроводный кран, используя бумажную салфетку, чтобы избежать контакта с имеющимися на кране микроорганизмами. 3.Намочить руки под струей воды.

4.Тщательно намылить мылом.

41

Рисунок 16.Последовательность мытья рук.

5. Вымыть руки последовательно:

а) энергичное механическое трение ладоней в течение 10 секунд

(5 раз);

б) правая ладонь растирающими движениями моет тыльную сторону левой кисти, затем левая ладонь также моет правую (повторить 5 раз);

в) левая ладонь находится на правой кисти, пальцы переплетены (повторить 5 раз);

г) пальцы одной руки согнуты и находятся на другой ладони (пальцы переплетены), повторить 5 раз;

д) чередующееся трение больших пальцев одной руки ладонью другой, ладонь сжата (повторить 5 раз);

е) переменное трение ладони одной руки сомкнутыми пальцами другой руки (повторить 5 раз).

42

Промыть руки под проточной водой, держа их так, чтобы запястья и кисти были выше уровня локтей.

Используя бумажную салфетку, закрыть водопроводный кран (лучше установить кран с локтевым вентилем)

Контроль качества дезинфекции. Пробы отбирают не позже 30—45

мин по окончании дезинфекции. В квартирных очагах берут не менее 10 контрольных смывов, в ЛПУ и детских учреждениях — не менее 30. Площадь смыва должна составлять 100 - 200 см2. У мелких предметов смывы берут со всей поверхности. Смывы берут стерильным ватным тампоном, вмонтированным в бактериологическую пробирку. В пробирке должен содержаться увлажнитель тампона (физиологический раствор или водопроводная вода) либо нейтрализатор дезинфектанта (1% раствор гипосульфита для хлорсодержащих препаратов). Смывы засевают на питательные среды с соблюдением правил асептики в условиях, исключающих возможность вторичной контаминации. Дезинфекционные мероприятия в ЛПУ считаются эффективными, если во всех смывах с объектов больничной среды не выявлены золотистый стафилококк и кишечные палочки.

Асептика – система профилактических мероприятий, направленных на предотвращение попадания микроорганизмов в рану, лекарственные препараты и другие объекты. Она включает: стерилизацию инструментов, соблюдение правил и приемов работы (стерильный халат, маска, перчатки и т.п.), осуществление санитарнопротивоэпидемических и гигиенических мероприятий.

Антисептика – комплекс мероприятий, направленных на уничтожение микробов, попавших в рану, лекарственный препарат или другой объект. Антисептика включает: удаление из раны инфицированных тканей; наложение гигроскопических повязок, использование сухого тепла, УФО; применение химических веществ вбактерицидным или бактериостатическим действием (хлоргексидин); применение антибиотиков, бактериофагов, средств, стимулирующих защитные силы организма.

Стерилизация - полное обеспложивание объектов, при котором уничтожаются все формы микроорганизмов (вегетативные и споры). Для стерилизации применяют физические и химические методы. Выбор метода определяется видом стерилизующего

43

материала, который после стерилизации должен сохранять свои основные свойства (форму, эластичность, активность и др.). Физические методы - действие высокой температуры, ионизирующего излучения, фильтрование через коллоидные фильтры. При тепловом методе стерилизации используют как однократные, так и многократные методики. К однократным методам относится воздействие сухого горячего воздуха или пар под давлением. Для стерилизации сухим жаром используют воздушные стерилизаторы, для стерилизации паром под давлением – паровой стерилизатор (автоклав) (рис. 17, 18). Многократные методы - это дробная стерилизация объектов, которые могут быть питательным субстратом для микробов (в промежутках между стерилизацией объект оставляют при комнатной температуре для прорастания спор). Образовавшиеся вегетативные формы микроорганизмов уничтожаются повторной стерилизацией. Ионизирующее излучение это наиболее перспективный метод, т.к. возможна полная автоматизация всех процессов. Стерилизацию проводят в товарной упаковке, что обеспечивает длительность сохранения материала стерильным.

Рисунок 17. Воздушный стерилизатор

44

стерилизуемых матери алов.

Установка пред ставляет собой бетонную камеру толщиной 2 метра, с надежной за щитой от радионуклидов. П осле обработки материал контролируе тся на остаточную радиоакт ивность. Этим способом стерилизуют хирургический инструментарий, изделия из пластмассы, вакцины, лечебные сыворотки, многие лекарства. Химические методы: 1) 6% раствор перекиси водорода с поверхностно-активными веществами (ПАВ), экспоззиция 1-3 часа. Стерилизуют хирургический инструментарий, пластмассы; 2) 1%

"искусственная почка". При газовой стерилизации используют окись этилена или смесь окиси этилена с бромистым метил ом, экспозиция 6-24 часа. Стерилизую т оптику, радиоэлектронное оборудование. В некоторых случаях используют совместное воздействи е физических и химических факторов.

Контроль стер илизации осуществляют несколькими методами:

45

1) по показаниям приборов (манометров, термометров, таймеров); 2) с использованием физико-химических тестов (вместе со

стерилизуемым материалом в аппарат закладывают ампулы с кристаллами веществ или специальные бумажные термохимические индикаторы, при нужной температуре вещества расплавляются, а индикаторы меняют цвет) (рис.19);

а) б) Рисунок 19. Термоиндикаторы воздушной (а) и паровой (б) стерилизации 3) биологические тесты (в аппарат помещают флакончики с

салфетками, пропитанными взвесью термостойкого спорообразующего микроба, и после стерилизации их инкубируют в питательной среде, которая не должна мутнеть).

Эффективность стерилизации в паровом стерилизаторе зависит от правильного выбора упаковки, соблюдения правил загрузки для свободного прохождения пара и плотности загрузки коробок (биксов).

Правила загрузки бикса:

Открыть бикс, отодвинув бандаж, открыть боковые отверстия бикса, протереть поверхность бикса изнутри и снаружи ветошью, смоченной в 1-0,5% раствором аммиака или 0,5% раствором хлорамина, затем ветошью, смоченной дистиллированной водой. Застелить дно и стенки бикса большой пеленкой. Уложить необходимый материал в определенной последовательности в вертикальном положении, положить химические индикаторы для контроля режима стерилизации в 3-х точках. Закрыть содержимое бикса пеленкой, сверху положить химический индикатор. Закрыть крышку бикса и привязать к его ручке бирку написать № отделения, сколько и каких предметов находится, дату стерилизации, боковые отверстия бикса закрыть бандажом.

Основные положения работы централизованных стерилизационных отделений (ЦСО) в лечебнопрофилактических учреждениях.

46

Эти отделения созданы для предупреждения парентеральных заражений вирусным гепатитом, ВИЧ-инфекцией и другими заболеваниями, а также постинфекционных осложнений. ЦСО осуществляет:

-приём использованного и предварительно очищенного инструментария;

-мойку инструментов с целью очистки от остатков лекарственных веществ и крови (с последующей проверкой на наличие следов крови и моющих средств по амидопириновой и фенолфталеиновой пробе);

-упаковку инструментов, перчаток, перевязочного материала ведут в специальную бумагу, двойной слой мягкой упаковки, биксы; -стерилизацию, которая проводится в паровых стерилизаторах или воздушных стерилизаторах. Стерильный материал в биксах или

двойной мягкой упаковке хранят не более 3 суток, в пергаменте - не более 3 недель.

Тема практического занятия 8. Антибиотики.

ЦЕЛИ: знать источники и методы получения антибиотиков; основные механизмы, активность и спектр их действия; варианты побочного действия; принципы определения чувствительности микробов к антибиотикам; причины возникновения и пути преодоления лекарственной устойчивости микроорганизмов.

Порядок проведения занятия:

1.Вступительное слово преподавателя (цели и задачи) – мин.

2.Объяснение нового материала, методические и организационные указания преподавателя по проведению занятия - мин.

3.Самостоятельная практическая работа студентов под руководством преподавателя, оформление и проверка протоколов – мин.

4.Обсуждение полученных результатов, проверка протоколов, подведение итогов практического занятия, заключительное слово преподавателя - мин.

47

Вопросы для самоконтроля

1.Что такое химиотерапия и ХТП? Назовите основные группы ХТП.

2.Какими свойствами должны обладать ХТП? Что такое спектр, цидное- и статическое действие ХТП?

3.Какое явление называют микробным антагонизмом? Назовите основные механизмы антагонистического воздействия.

4.Кратко изложите историю открытия антибиотиков.

5.Назовите источники и методы получения антибиотиков. Примеры.

6.Какие Вы знаете механизмы действия (точки приложения) антибиотиков?

7.В чем и как измеряют биологическую активность антибиотиков?

8.Как классифицируют виды побочного действия антибиотиков?

9.Назовите причины возникновения лекарственной устойчивости микробов и ее возможные механизмы.

10.Как определяют чувствительность микробов к антибиотикам?

11.Что такое МИК? Методы определения МИК.

12.Что является критерием чувствительности микроба-возбудителя

кантибиотику? Как его определить? От чего зависит выбор антибиотика для лечения?

Самостоятельная работа на кафедре

1.Познакомиться с постановкой опыта по определению чувствительности стафилококка к антибиотикам методом диффузии в агар (бумажных дисков) на специальной среде (демонстрация).

2.Учесть результаты опыта по определению чувствительности штаммов стафилококка, выделенных от больного, к антибиотикам (демонстрационный посев). Определить величину зон задержки роста в мм. Результаты оформить в протоколе.

3.Дать оценку чувствительности этих штаммов к антибиотикам, используя специальную таблицу. Записать результаты исследования.

4.Определить МИК пенициллина в отношении штамма стафилококка методом серийных разведений в жидкой питательной среде по демонстрационному посеву.

48

5.Пользуясь специальной таблицей, определить величину терапевтического индекса пенициллина. Дать заключение о возможности использования данного антибиотика для лечения больного.

6.Познакомиться с лекарственными формами антибиотиков, широко применяемых в медицинской практике.

Дополнительный материал

Методы определения чувствительности бактерий к антибиотикам делятся на 2 группы: диффузионные (с использованием дисков с антибиотиками, с помощью Е-тестов) и методы разведения (разведение в жидкой питательной среде). При определении чувствительности диско-диффузионным методом на поверхность агара в чашке Петри наносят бактериальную суспензию определенной плотности и затем помещают диски, содержащие определенное количество антибиотика. Диффузия антибиотика в агар приводит к формированию зоны задержки роста микроорганизмоввокруг дисков. После инкубации чашек в термостате при температуре 37оС в течение 24 часов учитывают результат путем измерения диаметра зоны вокруг диска в миллиметрах (рис.20).

Диски с антибиотиками

Зоны задержки роста

Рисунок 20. Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам диско-диффузионным методом

Определение чувствительности микроорганизма с помощью Е- теста проводится аналогично тестированию диско-диффузионным методом. Отличие состоит в том, что вместо диска с антибиотиком

49