10.Фармакогностический анализ сырья, его цели

Фармакогностический анализ – это комплекс методов анализа ЛРС, сырья животного происхождения и их продуктов, позволяющих определить их подлинность и доброкачественность.

Подлинность ЛРС – это соответствие сырья тому наименованию, под которым оно поступило на анализ. Подлинность ЛРС определяют с помощью макроскопического, микроскопического и химического методов анализа.

Для установления подлинности ЛРС Государственной фармакопеей предусмотрены следующие виды анализа:

1. Макроскопический.

2. Микроскопический.

3. Качественный фитохимический.

4. Хроматографический.

5. Люминесцентный.

 Листья — Folia .  Определяют форму листа, край, жилкование, черешок. Мелкие и кожистые листья не размачивают. Обращают внимание на поверхность листа с обеих сторон: голая или опушенная; жилки вдавлены или выступают (лучше рассматривать на сухом сырье).

Микроскопия.

При разных увеличениях, пользуясь макро- и микровинтом, исследуют верхний и нижний эпидермис, а также глубинные структуры листа, расположенные под эпидермисом (паренхима, включения, сосуды и т.д.).

    Цветки — Flores

Цвет, запах и размеры образца определяют на сухом сырье. Для определения строения цветка образец размачивают в горячей воде, помещают на предметное стекло и под лупой (препаровальная лупа со столиком) цветок расчленяют двумя иглами и рассматривают чашечку, венчик, тычинки, пестик.

Микроскопия

Эпидермис внутренней и наружной сторон венчика и чашечки, клетки цветоложа и листочков обвертки (корзинки сложноцветных), разнообразные волоски, кристаллы оксалата кальция, эфирномасличные железки и т.д. Важным диагностическим признаком является пыльца.

   Травы — Herbae .  В сухих травах определяют размеры, длину стебля, диаметр цветка или соцветия, опушенность, цвет, запах. В размоченных травах устанавливают форму листа, характер прикрепления листа к стеблю, форму стебля, тип соцветия, строение цветка и тип плода. Форму стебля определяют на поперечном разрезе. Листья, цветки и плоды обрывают и измеряют отдельно.

Микроскопия

1. Характер кутикулы (ровная, морщинистая, в том числе продольно-морщинистая, поперечно-морщинистая, лучисто-морщинистая; штриховатая, гребневидная и др.), степень выраженности изменения ровности кутикулы.

2. Форму клеток эпидермиса (изодиаметрическая округлая, квадратная, многоугольная; полигональная прямоугольная, овальная, ромбовидная, веретеновидная, комбинированная и др.).

3. Извилистость стенок клеток эпидермиса (прямые, извилистые, волнистые, зигзагообразные, зубчатые и др.), степень извилистости.

4. Утолщенность стенок клеток эпидермиса (наличие четковидной утолщенности).

5. Наличие устьиц и их форма (круглая, овальная), размеры.

6. Тип устьичного аппарата (см. ОФС «Листья»).

7. Погруженность устьиц в эпидермис (выступающие над эпидермисом, погруженные в эпидермис).

8. Наличие, характеристика и размеры волосков (простые и головчатые, одно- и многоклеточные, одно-, дву- и многорядные, пучковые, разветвленные и неразветвленные), особенности их мест присоединения (наличие розетки), утолщенность стенок (толстые, тонкие стенки), характер кутикулы (ровная, бородавчатая, штриховатая).

9. Наличие и структура железок, их размеры.

10. Наличие секреторных каналов, млечников, вместилищ.

11. Наличие кристаллов, их структура (одиночные кристаллы различной формы, друзы, рафиды, стиллоиды, цистолиты, кристаллический песок и др.), локализация (в паренхиме под эпидермисом, в паренхиме в виде

кристаллоносной обкладки вокруг проводящих пучков и групп волокон, редко в клетках эпидермиса), размеры.

12. Наличие включений: слизи, инулина, каротиноидов и др. (в паренхиме под эпидермисом, редко в клетках эпидермиса).

13. Наличие аэренхимы.

Плоды — Fructus. В сухом сырье невооруженным глазом или под лупой (ув. 10) определяют форму плодов и характер поверхности кожуры. Размер мелких плодов, как и семян, устанавливают, раскладывая их в ряд на миллиметровой бумаге. Определяют форму и особенности строения околоплодника; подсчитывают количество семян в плоде. Иногда разрезают поперек и считают количество гнезд и семян в каждом гнезде.

Микроскопия

• строение слоев околоплодника (мезокарпия, эндокарпия, экзокарпия) и оболочки семени, форма клеток, особенности стенок;

• наличие элементов механической ткани (склереиды, стереиды) и порядок их размещения, особенности формы клеток и их стенок;

• наличие включений в паренхиме мезокарпия (кристаллов оксалата кальция), их тип, порядок размещения;

• наличие секреторных вместилищ, канальцев в мезокарпии, их форма, порядок размещения;

• особенности строения эндосперма (форма клеток, наличие включений, зерен крахмала, кристаллов оксалата кальция, алейроновых зерен, их форма).

     Семена — Semina. При определении подлинности семян рассматривают их форму, поверхность, которая может быть гладкой, бугорчатой или ячеистой, голой и опушенной. Семена состоят из кожуры и ядра, иногда диагностическое значение имеют рубчик и семяшов. Семенное ядро состоит только из зародыша (семядоли, корешок, почечка) или имеет еще питательную ткань эндосперм, реже перисперм. Цвет и запах устанавливают при соскабливании или растирании; размеры мелких семян определяют путем раскладывания их в ряд на миллиметровой бумаге, а шарообразных — путем просеивания через сито с округлыми отверстиями определенного диаметра.

Микроскопия

• строение слоев околоплодника (мезокарпия, эндокарпия, экзокарпия) и оболочки семени, форма клеток, особенности стенок;

• наличие элементов механической ткани (склереиды, стереиды) и порядок их размещения, особенности формы клеток и их стенок;

• наличие включений в паренхиме мезокарпия (кристаллов оксалата кальция), их тип, порядок размещения;

• наличие секреторных вместилищ, канальцев в мезокарпии, их форма, порядок размещения;

• особенности строения эндосперма (форма клеток, наличие включений, зерен крахмала, кристаллов оксалата кальция, алейроновых зерен, их форма).

      Кора — Cortices. Кора бывает различных размеров, имеет вид трубчатых, желобоватых и плоских кусков или неравномерных обрезков. Снаружи кора покрыта бурой или серой пробкой с округлыми или продолговатыми чечевичками, иногда имеются лишайники. Кора корней не имеет чечевичек и лишайников. Наружная поверхность коры может быть гладкая, с продольными или поперечными трещинами. Внутренняя сторона коры более светлая и ровная, поперечный излом неровный, занозистый, щетинистый или зернистый, зависящий от наличия числа и толщины волокон и каменистых клеток. Указывается максимальная толщина коры, так как молодая кора (за некоторым исключением) содержит больше действующих веществ. Длину и толщину коры измеряют миллиметровой линейкой (ширина не имеет значения). Цвет коры определяют с двух сторон, вкус — на сухом сырье. Запах коры усиливается при увлажнении или соскабливании внутренней поверхности.

Микроскопия

• общий характер анатомического строения (дифференциация на первичную и вторичную кору, характер строения покровной ткани);

• наличие элементов механической ткани (лубяные волокна и склереиды) и характер их размещения (по отдельности, группами, рассеянно, прерывистыми поясами, в первичной или вторичной коре);

• характер строения основной паренхимы (форма клеток, наличие межклетников);

• окраска пробки;

• наличие колленхимы и ее строение;

• наличие включений оксалата кальция, их тип и локализация;

• наличие секреторных образований (ходов, клеток).

На продольном срезе отмечают:

• морфологические особенности элементов механической ткани (длина волокон и склереид, толщина стенок);

• наличие кристаллоносной обкладки волокон;

• порядок размещения кристаллов оксалата кальция в клетках основной паренхимы.

 Корни, корневища, клубни — Radices , Rhizomata , Tubera. Подлинность цельных корней и корневищ устанавливают по внешним признакам невооруженным глазом или под лупой (ув. 10). Определяют форму, цвет (на свежем изломе), характер поверхности и излома. Корни однодольных и двудольных имеют различное строение (смотреть на поперечном срезе, окрашенном раствором флороглюцина и концентрированной соляной кислотой).

    Корни однодольных имеют первичное строение, не меняющееся с возрастом; эндодерма отделяет первичную кору от центрального цилиндра, в котором расположен радиальный проводящий пучок.

    Корни двудольных имеют вторичное строение, а молодые части придаточных корней — первичное или переходное. Вторичное строение беспучковое, древесина (ксилема) отделена от коры кольцом камбия; через вторичную кору и древесину радиально проходят сердцевинные лучи, покровная ткань — пробка.

Микроскопия

• определение типа строения (вторичное, первичное);

• общий характер строения (лучевой, неопределенно лучевой);

• характер строения покровной ткани (с многослойной пробкой, послойность пробки, форма клеток эпидермы, наличие эпидермальных выростов – корневых волосков);

• дифференциация корневой части (на первичную и вторичную кору), характер анатомической структуры (форма клеток, плотность структуры);

• наличие элементов механической ткани в коровой части (лубяные волокна, склереиды), форма клеток и особенности их стенок, порядок расположения (рассеянно, тангентальными, радиальными рядами и т. д.);

• наличие включений в клетках коровой части (кристаллы оксалата кальция, их форма, тип, крахмал, форма крахмальных зерен, жирные масла);

• наличие секреторных ходов, вместилищ (млечные ходы, эфиромасличные вместилища и т. п.), порядок их размещения;

• характер расположения проводящей системы – ситовидных трубок и сосудов (радиальными рядами, рассеянно и т. д.);

• наличие либриформа (волокон древесины), крепость групп;

• характер сердцевинных лучей (одно-, дву- или многорядные, прямые, изогнутые);

• наличие сердцевины и особенности ее строения.

На продольном срезе отмечают:

• тип сосудов (спиральные, пористые, сетчатые);

• характер элементов механической ткани (отдельные волокна или их пучки, с кристаллоносной обкладкой или без нее, тонкостенные либо толстостенные, одревесневшие, короткие, длинные, форма склереид);

• вид млечных ходов (членистые, разветвленные).

 Корневища

Корневища однодольных имеют разбросанно пучковый тип строения; центральный цилиндр отделен от первичной коры эндодермой; проводящие

пучки расположены без порядка в цилиндре и в меньшем числе в коре поверхность коры покрыта опробковевшей тканью.

    Корневища двудольных имеют кольцовое, пучковое или беспучковое строение. Проводящие пучки расположены в основной ткани, в центре находится широкая сердцевина, к периферии — первичная кора; в корневищам с беспучковым строением древесина располагается широким поясом отделенным от коры кольцом камбия, во вторичной коре и в древесине радиально расположены сердцевинные лучи, а в центре — сердцевина Покровная ткань - пробка.

Микроскопия

• изучение общего анатомического строения (пучковое, непучковое, дифференциация на коровую часть и осевой цилиндр);

• характер состава основной паренхимы коры и форма ее клеток (рыхлое с межклетниками, аэренхимный характер);

• тип проводящих пучков, форма и порядок их расположения (коллатеральные, концентрические, закрытые);

• наличие элементов механической ткани, сопровождающей проводящие пучки, тип ее строения;

• тип и характер строения покровной ткани (первичная, вторичная);

• наличие включений в клетках коры (кристаллы оксалата кальция, крахмальные зерна, тип и форма включений);

• особенности строения сердцевины;

• наличие в коровой части секреторных образований (вместилища, ходы, клетки).

Доброкачественность ЛРС — соответствие ЛPC, продуктов и лекарственных средств из него требованиям стандарта (числовым показателям качества и безопасности для применения).

Доброкачественность сырья определяется путем товароведческого и фитохимического анализов.

Товароведческий анализ производится для всестороннего определения качества сырья. Этот анализ комплексный и включает мак-, микроскопические, химические и др. исследования. Без данных товароведческого анализа сырье не может быть признано качественным и использоваться как лек. средство.

Товароведческий анализ в соответствии с ГФ проводится в 3 основных этапа:

1. Приемка лекарственного растительного сырья.

2. Отбор проб на анализ.

3. Анализ средней пробы в контрольно-аналитической лаборатории.

В ходе товароведческого анализа определяют числовые показатели:

- содержание влаги — ГФ Х1 (вып. 1, с. 285);

- золы — ГФ XI (вып. 2, с. 24);

- дубильных веществ — ГФ XI (вып. 1, с. 286);

- эфирного масла — ГФ XI (вып. 1, с. 290);

- экстрактивных веществ — ГФ XI (вып. 1, с. 295);

- степень зараженности сырья амбарными вредителями — ГФ XI (вып. 1, с. 276);

- измельченность, допустимые примеси (ГФ XI, вып. 1, с. 275).

Фитохимический анализ — вид анализа, используемый для качественного и количественного определения действующих веществ с помощью химических и физико-химических методов. Эти методы отчасти описаны в ГФ XI (вып. 1, с. 95 и 159), отчасти (конкретные методы определения) в статьях ГФ XI на виды лекарственного растительного сырья (ГФ XI, вып. 2) или в других НД (ФС, ВФС, ГОСТ, ГОСТР, ОСТ, ТУ).

Экстрактивные вещества

Показатель «экстрактивные вещества» характеризует содержание в лекарственном растительном сырье/препарате всей суммы биологически активных и балластных веществ, извлекаемых экстрагентом. Тип экстрагента приводится в фармакопейной статье или нормативной документации на лекарственное растительное сырье/препарат в зависимости от его последующего назначения.

Количественное определение экстрактивных веществ проводится методом экстракции определённым видом растворителя. Точную навеску измельчённого сырья экстрагируют при слабом кипении с обратным холодильником в течение 2 ч после предварительного настаивания в течение 1 ч с последующим упариванием и высушиванием сухого остатка аликвотной части экстракта при 100-105 °С до постоянной массы.

Содержание экстрактивных веществ рассчитывают в процентах в пересчете на абсолютно сухое сырье.

,

где m₁ –масса сухого остатка г; m₂ – масса сырья г; W – потеря в массе при высушивании %.

Влажность

Известны различные способы определения влажности. В частности, иногда в сырье определение влажности осуществляется методом отгонки, и в ряде фармакопей этот способ используется, для него разработаны специальные приборы (например, прибор Дина и Старка). Существуют химические методы, из которых наиболее известен метод Карла Фишера (Британская фармакопея). Кроме того, разработаны спектроскопические и электрометрические методы и соответствующие приборы, которые позволяют определять влажность с минимальными затратами времени. Для определения влажности в лекарственном растительном сырье принят метод высушивания до постоянной массы при температуре 100—105°С.

Зола общая – это несгораемый остаток неорганических веществ, получающихся после сжигания и прокаливания остатка до постоянной массы при температуре около 550-650C.

Кварцевый или платиновый тигель нагревают при красном калении (около 500 °С) в течение 30 мин, выдерживают до остывания в эксикаторе и взвешивают. Если нет других указаний в частной статье, 1.00 г испытуемого образца или измельченного в порошок ЛРС помещают в тигель и равномерно распределяют по дну тигля. Высушивают при температуре от 100 до 105 °С в течение 1 часа и затем сжигают до постоянной массы в муфельной печи при температуре (60025) °С, выдерживая тигель до остывания в эксикаторе после каждого сжигания. Во время проведения анализа в тигле не должно появляться пламя. Если после длительного сжигания зола все еще содержит темные частицы, содержимое тигля количественно переносят горячей водой на беззольный фильтр и сжигают остаток на фильтре вместе с фильтровальной бумагой. Фильтрат объединяют с золой, осторожно выпаривают до сухого остатка и сжигают до постоянной массы. Постоянная масса считается достигнутой, если разница между двумя последующими взвешиваниями не превышает 1 мг.

Зола, нерастворимая в хлористоводородной кислоте, - это остаток, полученный после обработки общей золы хлористоводородной кислотой и и состоит в основном из силикатов, являющихся для некоторых объектов естественной составной частью, но чаще результатом загрязнения сырья песком, землей и камешками.

В тигель, содержащий остаток после определения общей золы, прибавляют 15 мл воды и 10 мл кислоты хлористоводородной, раствор покрывают часовым стеклом, аккуратно кипятят в течение 10 мин и охлаждают. Фильтруют через обеззоленный фильтр, промывают фильтр горячей водой до тех пор, пока фильтрат не станет нейтральным, затем фильтр сушат и сжигают при температуре слабого красного каления, после чего охлаждают в эксикаторе и взвешивают. Процесс сжигания необходимо повторять до тех пор, пока разница между двумя последовательными взвешиваниями будет не более 1 мг.

Процентное содержание золы, нерастворимой в 10%-ной HCI, в абсолютно сухом сырье вычисляют по формуле:

,

где m1 –масса золы общей г; m2 – масса сырья г; m – масса золы фильтра (если масса золы фильтра выше 0,0002 г) г; W – потеря в массе при высушивании %.