валид

Протокол № 4

ОЦЕНКА МЕТОДИКИ НА ЛИНЕЙНОСТЬ

Объект. Методика определения белка по методу Лоури в препарате Лапрот. Определения проводили с использованием СО Лактоферрин женского молока, Sigma, США.

Описание теста. Линейность – это способность методики в диапазоне применения давать величины сигнала D (оптической плотности) прямо пропорциональные концентрации (количеству) C определяемого вещества.

Критерии приемлемости.

1. Зависимость оптической плотности растворов СО Лактоферрина женского молока, Sigma, США от концентрации белка в области действия методики должна быть линейной.

2. Должно быть представлено регрессионное уравнение D = a + bС с коэффициентом корреляции не менее 0,9.

3. Линейность зависимости D от C должна быть также подтверждена визуально - графиком.

Процедура. Оценка методики.

Методом наименьших квадратов определяли зависимость оптической плотности растворов СО Лактоферрин от концентрации белка. Поскольку метод является фармакопейным, оценку линейности проводили на трех концентрациях, лежащих в диапазоне нормируемого количества белка в препарате: 0,020-0,100 мг/мл.

В мерные пробирки вместимостью 10 мл помещали навески СО Лактоферрин содержащего 0,02-0,100 мг белка, растворяли в 1 мл раствора. Рассчитывали содержание белка в модельных пробах (мг).

В каждую пробирку добавляли по 5 мл реактива Фолина. Тщательно перемешивали и оставляли на 10 мин в темноте при комнатной температуре. Затем добавляли 0,5 мл реактива Фолина и оставляли пробы на 30 мин в темноте при комнатной температуре.

Оптическую плотность растворов измеряли на спектрофотометре в максимуме поглощения при длине волны 750 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. Между измерениями кюветы промывали 50 % раствором этанола в воде.

В качестве раствора сравнения использовали дистиллированную воду.

Результаты. Полученные данные представлены в таблице 1 и на рис.1. (ОП от концентрации без БСА)

Протокол №4 (продолжение)

Таблица 1.

Зависимость оптической плотности растворов СО Лактоферин от расчетной концентрации белка

№ п/п	Кол-во СО в 1 мл модельной пробы, мг	Концентрация белка в пробе С, мкг/мл	Оптическая плотность, D, о.е.
1	0,104	101,0	0,186
2	0,107	104,0	0,192
3	0,103	99,0	0,185
4	0,057	55,0	0,115
5	0,053	51,0	0,110
6	0,058	56,0	0,118
7	0,025	24,0	0,067
8	0,027	26,0	0,070
9	0,029	28,0	0,074

Методом наименьших квадратов установлено, что зависимость D от С может быть представлена следующим регрессионным уравнением:

D = 0,001557*C+0,030024 мкг/мл

Коэффициент корреляции r =0,999899;

Стандартное отклонение S = 0,051438; n = 9

Рис. 1. Зависимость оптической плотности растворов СО Лактоферринот концентрации белка.

Выводы.

- Высокое значение коэффициента корреляции r = 0,999899 указывает на хорошую линейность зависимости оптической плотности растворов СО Лактоферрин от концентраций белка.

Этот же вывод подтверждается визуально графиком D – С, представленном на рис. 1.

Измеренные значения хорошо ложатся на линию регрессии.

- Точка пересечения графика с осью ОХ (- 20 мкг) является пределом чувствительности данной методики, что соответствует рабочему диапазону метода в соответствии с ГФ ХII, часть 1, стр 108 (25 – 100 мкг).

- Точка пересечения графика с осью OY (свободный член в регрессионном уравнении) не выходит за пределы стандартного отклонения: Y=0,031; S = 0,0517.

Отклонения/ примечания: нет

Заключение: подтверждена линейность зависимости оптической плотности растворов СО Лактоферрин от концентрации белка. Коэффициент линейной корреляции r = 0,999 соответствует критерию приемлемости r  0,9.

Выполнил _______ ____________ ________ ___________________

(дата) (должность) (подпись) (расшифровка подписи)

Проверил _______ ____________ ________ ___________________

(дата) (должность) (подпись) (расшифровка подписи)

ПРОТОКОЛ № 5

ОЦЕНКА МЕТОДИКИ НА ТОЧНОСТЬ

Точность – степень близости результата измерений к принятому опорному (стандартному) значению. Показатели точности методики – правильность, повторяемость и воспроизводимость.

Объект. Методика определения белка по методу Лоури в препарате Лапрот. Определения проводили с использованием СО Лактоферрин женского молока, Sigma, США с аттестованной характеристикой содержания белка 97 %.

Описание теста. Определяется точность методики – степень соответствия между взятым в модельную смесь (истинным) и найденным по тестируемой методике значением содержания белка.

Показатель точности методики – правильность будет определяться величиной открываемости R (%), а в случае, если открываемость содержания белка выходит за пределы (98,0 – 102,0) % – оценкой статистической значимости различия результатов с помощью t-критерия Стьюдента.

Критерий приемлемости. Открываемость – в пределах (98,0 – 102,0) %, в противном случае – доказательство отсутствия систематической ошибки.

Процедура. Оценка методики.

Оценку точности проводили на трех концентрациях, лежащих в диапазоне нормируемого количества белка в препарате: 0,020-0,100 мг/мл. .

В мерные пробирки вместимостью 10 мл помещали навески СО Лактоферрин содержащего 0,02-0,100 мг белка, растворяли в 1 мл раствора. Рассчитывали содержание белка в модельных пробах (мг).

В каждую пробирку добавляли по 5 мл реактива Фолина. Тщательно перемешивали и оставляли на 10 мин в темноте при комнатной температуре. Затем добавляли 0,5 мл реактива Фолина и оставляли пробы на 30 мин в темноте при комнатной температуре.

Оптическую плотность растворов измеряли на спектрофотометре в максимуме поглощения при длине волны 750 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. Между измерениями кюветы промывали 50 % раствором этанола в воде.

В качестве раствора сравнения использовали контрольный раствор, не содержащий препарата.

С помощью калибровочонго графика стандартного раствора БСА (400 мкг/мл) определяли содержание белка в каждой модельной пробе – (М_н), мкг.

Определяли открываемость R (%) содержания белка по формуле:

R= (Mн100)/Mв,

где Mв и Mн – истинное (взятое) и экспериментально найденное значения содержания белка в модельной пробе.

Результаты.

Полученные результаты представлены в таблице 2.

Зависимость между взятым Мв и найденным Mн количеством белка в модельных пробах в диапазоне нормируемого количества белка в препарате 0,020-0,100 мг/мл., определенная методом наименьших квадратов, представлена на рис. 2 и выражается следующим линейным регрессионным уравнением:

Мн = 0,9913*Мв + 0,46

r =0,9994; S = 32,7724; n = 9,

где r - коэффициент корреляции, S – стандартное отклонение.

Низкое значение свободного члена уравнения 0.46 мкг по сравнению с навеской СО Лактоферрин подтверждает высокую точность методики, а высокий коэффициент корреляции r = 0,9994 – хорошую линейность.

Протокол № 5 (продолжение)

Таблица .

Результаты определения открываемости содержания белка в модельных пробах СО Лактоферрин,

№	Количество СО в 1 мл модельной пробы, мг	Содержание белка в модельной смеси		Оптическая плотность D	Открываемость R= (Mн·100)/Mв, %
		Взято Mв, мкг	Найдено Mн, мкг (по калибровочой прямой)
	0,104	101,0	99,9	0,186	98,91
	0,107	104,0	102,0	0,192	98,1
	0,103	99,0	100,9	0,180	101,870
	0,057	55,0	55,7	0,115	101,30
	0,053	51,0	50,5	0,110	99,04
	0,058	56,0	55,9	0,118	99,88
	0,025	24,0	24,4	0,067	101,65
	0,027	26,0	26,6	0,070	102,12
	0,029	28,0	27,5	0,074	98,24
Средний результат						100,123
Стандартное отклонение						1,624
Критерий Стьюдента						2,31
Средневзвешенная дисперсия						2,637
Относительное стандартное отклонение RSD						1,624

Рис. 2. Зависимость между взятым и найденным количеством белка в модельных пробах

СО Лактоферрин.

Отклонения/ примечания: нет

Заключение: подтвержден показатель точности (правильность) методики определения содержания белка (количественное определение). Открываемость с доверительной вероятностью 95 % составляет 98,1  102,1 % то есть практически не выходит за пределы критерия приемлемости 98,0  102,0% (точка 8, для которой найденное значение открываемости составило 102,1 % находится на нижнем пределе диапазона чувствительности данной методики, поэтому полученное отклонение 102,1 % можно считать несущественным).

Выполнил _________ ____________ ________ ___________________

(дата) (должность) (подпись) (расшифровка подписи)

Проверил _________ ____________ ________ ___________________

(дата) (должность) (подпись) (расшифровка подписи)

ПРОТОКОЛ № 6

ОЦЕНКА МЕТОДИКИ НА ВНУТРИЛАБОРАТОРНУЮ ПОВТОРЯЕМОСТЬ (СХОДИМОСТЬ)

Повторяемость (один из показателей точности методики) – степень близости друг к другу независимых результатов, полученных в условиях повторяемости, а именно:

- одним и тем же методом

- на идентичных объектах испытаний (идентичных частях пробы)

- в одной и той же лаборатории, одним и тем же оператором

- с использованием одного и того же оборудования и средств измерений

- в короткий промежуток времени (в который не проводится перекалибровка оборудования) и сохраняются параметры окружающей среды.

Мерой рассеяния результатов в условиях повторяемости является относительное стандартное отклонение повторяемости (S_r).

Объект. Методика определения белка (количественное содержание) по методу Лоури в препарате Лапрот.

Описание теста. Определяется внутрилабораторная повторяемость (сходимость) результатов содержания белка в одной серии препарата Лапрот, выполненных одним аналитиком на одном спектрофототометре в течение одного дня.

Критерий приемлемости: Относительное стандартное отклонение повторяемости S_r ≤ 2,0 %

Процедура. Оценка методики.

Для оценки внутрилабораторной повторяемости результатов содержания белка в одной серии препарата анализировали 6 проб препарата Лапрот серии № 1. Определения проводили по процедуре, описанной в протоколе 5.

Содержание белка в одной пробе определяли по калибровочному графику стандартного раствора БСА (400 мкг/мл) спектрофотометрически, при длине волны 750 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм.

Результаты.

Полученные результаты представлены в таблицах 4 и 5.

Таблица 4.

Построение калибровочного графика (р-р БСА 400 мкг/мл)

Содержание белка в аликвоте основного р-ра, мкг	Дата	50	100	150	200	250	300	350	400
Результат измерений оптической плотности	16.05.11	0,110	0,230	0,340	0,445	0,540	0,655	0,760	0,870

Протокол № 6 (продолжение)

Таблица 5.

Оценка внутрилабораторной повторяемости результатов содержания белка

в 1 мг препарата Лапрот, серии № 1 (разведение в 40 раз).

№ п/п	Оптическая плотность пробы D, о.е.	Концентрация белка в препарате, мкг/мл	Содержание белка в 1 мг препарата, мкг
1	0,135	2480	124,0
2	0,140	2560	128,0
3	0,139	2520	125,0
4	0,138	2520	125,0
5	0,137	2496	124,8
6	0,137	2496	124,8
Средний результат				125,2667
Критерий Стьюдента				2,57
Средневзвешенная дисперсия				1,930667
Стандартное отклонение повторяемости Sr (%)				1,389484

Таким образом, относительное стандартное отклонение повторяемости S_r = 1,39 < 2,0 %.

Отклонения/ примечания: нет

Заключение: относительное стандартное отклонение повторяемости S_r результатов содержания белка в 6 пробах препарата Лапрот составляет 1,39 %, что не превышает критерия приемлемости 2,0 %. Методика обладает хорошей внутрилабораторной повторяемостью.

Выполнил _________ ____________ ________ _____________ (дата) (должность) (подпись) (расшифровка подписи)

Проверил _________ ____________ ________ _____________ (дата) (должность) (подпись) (расшифровка подписи)

Протокол № 7

ОЦЕНКА МЕТОДИКИ НА ВНУТРИЛАБОРАТОРНУЮ ВОСПРОИЗВОДИМОСТЬ

Воспроизводимость (один из показателей точности методики) – степень близости друг к другу независимых результатов, полученных в одной лаборатории:

- одним и тем же методом

- на идентичных объектах испытаний (идентичных частях пробы)

- разными операторами

- с использованием одного комплекта оборудования и средств измерений

Мерой рассеяния результатов в условиях воспроизводимости является стандартное (среднеквадратическое) отклонение воспроизводимости S_R.

Объект. Методика определения белка по методу Лоури в препарате Лапрот.

Описание теста. Определяется внутрилабораторная воспроизводимость результатов содержания белка в одной серии препарата Лапрот, выполненных двумя аналитиками на разных спектрофототометрах в разные дни.

Критерий приемлемости: Cтандартное (среднеквадратическое) отклонение воспроизводимости S_R ≤ 3,0 %.

Процедура. Оценка методики.

Для оценки внутрилабораторной воспроизводимости результатов содержания белка в одной серии препарата анализировали 6 проб препарата Лапрот. Двум аналитикам выдавалось по 3 идентичные пробы препарата Лапрот серии № 1.

Определения проводили по процедуре, описанной в протоколе 5.

Содержание белка в серии проб (химик 1, химик 2) определяли по калибровочным графикам стандартного раствора БСА (400 мкг/мл), воспроизводимым каждым химиком.

Результаты.

Полученные результаты представлены в таблицах 4 и 5..

Таблица 6.

Построение калибровочного графика (р-р БСА 400 мкг/мл)

Химик 1. Кузнецова С.Ю.

Содержание белка в аликвоте основного р-ра, мкг	Дата	50	100	150	200	250	300	350	400
Результат измерений оптической плотности	17.05.11	0,110	0,250	0,320	0,445	0,550	0,660	0,745	0,875

Химик 2. Скворцова Е.А.

Содержание белка в аликвоте основного р-ра, мкг	Дата	50	100	150	200	250	300	350	400
Результат измерений оптической плотности	18.05.11	0,140	0,220	0,370	0,450	0,575	0,710	0,775	0,89 0