4047

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ

УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

Воронежский государственный лесотехнический университет им. Г.Ф. Морозова

Общая биология и микробиология

Методические указания к лабораторным работам для студентов по направлению подготовки 19.03.01 – Биотехнология

Воронеж 2017

Брындина Л. В. Общая биология и микробиология [Электронный ресурс]: методические указания к лабораторным работам для студентов по направлению подготовки 19.03.01 – Биотехнология [Текст] / Л.В. Брындина. М-во образования и науки РФ, ФГБОУ ВПО «ВГЛТУ им. Г.Ф. Морозова», – Воронеж, 2017. – 47 с. ЭБС ВГЛТУ.

Содержание

Предисловие……………………………………………………………...3 Общие указания к проведению лабораторных работ…………………3

Лабораторная работа № 1. Требования безопасности при работе в химических и микробиологических лабораториях. Микроскопы. Техника микроскопии……………………………………………………5

Лабораторная работа № 2. Обнаружение биологических молекул в субстратах качественными реакциями………………………………….12

Лабораторная работа № 3. Определение активности действия ферментов у прокариотических клеток…………………………………14

Лабораторная работа № 4. Определение активности действия ферментов у эукариотических клеток………………………………….18

Лабораторная работа № 5. Определение специфичности действия ферментов…………………………………………………………………20

Лабораторная работа № 6. Приготовление питательных сред для микроорганизмов, способы их стерилизации. Автоклавирование…..24 Лабораторная работа № 7. Выделение чистой культуры микроорганизмов…………………………………………………………30

Лабораторная работа № 8. Методы количественного учета микроорганизмов………………………………………………………..37 Литература………………………………………………………………..37

ПРЕДИСЛОВИЕ

Практикум по общей биологии и микробиологии разработан в соответствии с рабочей программой дисциплины «Общая биология и микробиология» для студентов, обучающихся по направлению подготовки 19.03.01 – Биотехнология (уровень бакалавриата), составленной на основе новых государственных стандартов. Он включает в себя лабораторные работы, которые охватывают основные разделы изучаемого теоретического курса. Практикум составлен таким образом, чтобы закрепить теоретические знания по основным разделам курса, получить представление о строении живых организмов, показать

их значение и развить у студентов навыки практической работы. Поэтому перед каждой работой дается краткая теоретическая часть, необходимая для понимания эксперимента.

Перед выполнением лабораторной работы студенты должны с ней ознакомиться. При выполнении лабораторных работ студенты получают экспериментальные навыки, необходимые им для самостоятельной работы.

Они осваивают методы биологического и микробиологического исследования, правила работы с биологическим материалом и культурами микроорганизмов.

Отдельные занятия включают несложные элементы научного исследования, доступные студентам(определение видовой и родовой принадлежности отдельных организмов, проведение простейших опытов с живыми объектами для выяснения функции их структур, органов и др.).

Особое внимание уделено работе с микроскопом и правилам работы в лаборатории.

На первом занятии студенты должны ознакомиться с правилами работы в лаборатории и выполнять лабораторные работы в соответствии с этими правилами.

Результаты каждой лабораторной работы оформляются в виде отчета.

Отчет выполняется рукописным методом в тетради или на отдельных листах с титульным листом.

ОБЩИЕ УКАЗАНИЯ К ПРОВЕДЕНИЮ ЛАБОРАТОРНЫХ РАБОТ

При выполнении лабораторных работ по общей биологии и микробиологии работают с различным биологическим материалом и культурами микроорганизмов. Изучают строение живых организмов и их основную структурную единицу – клетку. Клетки имеют небольшие размеры, поэтому невооруженным глазом их рассмотреть невозможно. Для их изучения готовят определенным образом препараты, которые рассматривают под микроскопом. Поэтому работы на уровне клеток и микроорганизмов проводят в особых лабораториях, которые должны отвечать определенным требованиям.

Влаборатории каждый работающий должен сидеть за отдельным столом, на котором должны находиться: спиртовка; штатив для пробирок и бактериальных петель и игл; набор красителей; кювета с шинами для окраски препаратов; фильтровальная бумага; карандаш для стекла; дезинфицирующий раствор.

Влаборатории должны быть созданы условия, обеспечивающие стерильность работы, при которых будет исключена возможность

попадания как посторонних микроорганизмов извне, так и микроорганизмов из лаборатории в окружающую среду.

Поэтому в микробиологической лаборатории необходимо строго соблюдать определенные правила работы и поведения, которые предотвращают возникновение заражения.

Лабораторная работа№1 Требования безопасности при работе в химических и

микробиологических лабораториях. Микроскопы. Техника микроскопии

Цель работы: Усвоить правила пользования микроскопом и научиться работать с ним.

3адание

1. Изучить устройство микроскопа и правила работы с ним.

2.Промикроскопировать готовые препараты сначала с объективом 8х или 10х, а затем 90х или 100х., зарисовать отдельные клетки.

3.Сделать выводы и оформить отчет.

Правила работы при выполнении микробиологического практикума. Требования безопасности в микробиологической лаборатории.

Влабораторию запрещается входить в верхней одежде и класть на столы личные вещи. В микробиологической лаборатории разрешается работать только в халатах, которые защищают одежду от контаминации микроорганизмами, а также препятствуют их распространению за пределы лаборатории. Волосы необходимо закалывать.

За каждым студентом закрепляется постоянное рабочее место, которое должно поддерживаться в постоянном порядке.

На всех пробирках, чашках Петри, колбах обязательно пишется название микроорганизма, дата его посева, фамилия студента, номер группы.

Входе работы бактериологические петли и иглы обеззараживаются прокаливанием в пламени горелки до и после отбора микроорганизмов.

Приготавливая препарат или производя пересев культур микроорганизмов, выросших на жидкой среде, пользуются не петлей, а пипеткой, в верхний конец которой должен быть вложен кусочек ваты, чтобы не допустить случайного соприкосновения микробного материала с полостью рта. Использованные шпатели, пипетки помещаются в фарфоровые стаканы с дезинфицирующими растворами, спички, фильтровальную бумагу, отработанные препараты помещают в кристаллизатор. Указанные предметы класть на стол категорически запрещается.

Вслучае попадания исследуемого материала или культуры микроорганизма на руки, стол, халат или обувь необходимо сообщить об этом преподавателю и под его руководством провести дезинфекцию.

Влаборатории категорически запрещается принимать пищу. После окончания занятия рабочее место дезинфицируется,

использованный материал и другие предметы обезвреживаются, руки моются с мылом, помещение проветривают и, по возможности, стерилизуют с помощью УФ-ламп.

1 Устройство микроскопа. Препараты для микроскопирования.

1.1 Микроскоп. Основные правила микроскопирования.

Изучение морфологии и строения клеток микроорганизмов, величины которых измеряются микрометрами, нанометрами, ангстремами, возможно только с помощью микроскопов. В лабораторных условиях чаще всего используется световая микроскопия.

Микроскоп имеет механическую и оптическую части (рис.1). Механическая часть включает штатив, предметный столик, тубус с револьверной головкой, макро- и микрометрические винты. Нижняя часть штатива является опорой микроскопа, верхняя – тубусодержателем, который может перемещаться с помощью механизма, приводимого в действие вращением макрометрического и микрометрического винтов, предназначенных для грубой и тонкой фокусировки препарата соответственно. При вращении винтов по часовой стрелке тубусодержатель микроскопа опускается, против – поднимается. В верхней части тубусодержателя находится вращающийся вокруг своей оси револьвер. В отверстия нижней пластины револьвера ввинчены объективы. В верхний конец тубуса вкладываются сменные окуляры. Предметный столик круглой или прямоугольной формы служит для размещения на нем препарата, имеет в центре отверстие для прохождения лучей, освещающих препарат. Подвижный столик можно передвигать в горизонтальной плоскости двумя винтами, находящимися справа и слева. Это позволяет поместить любую точку препарата в центр поля зрения. На поверхности столика находятся два зажима для закрепления препарата. В случае неподвижного предметного столика, имеется гнездо для препаратоводителя, в которое он укрепляется (рис 1).

Рисунок 1. Схема микроскопа "Биолам": 1 - окуляры; 2 – бинокулярная насадка; 3 - револьверное устройство; 4 – объектив; 5 - предметный столик; 6 – конденсор; 7 – корпус коллекторной линзы; 8 – патрон с лампой; 9 – шарнир; 10 – рукоятка перемещения кронштейна конденсора; 11 – микровинт; 12 – макровинт; 13 – тубусодержатель; 14

– винт для крепления насадки; 15 – световой индикатор; 16 – выключатель.

Оптическая часть микроскопа состоит из осветительного аппарата, объектива и окуляра. Осветительная часть микроскопа

состоит из расположенных под предметным столиком конденсора и встроенного осветителя с низковольтной лампой накаливания. Конденсор представляет собой оптическую систему из двух линз: плосковыпуклой (верхней) и двояковыпуклой (нижней). Конденсор концентрирует параллельные лучи, идущие от источника света, в одной точке, фокусе, который должен находиться в плоскости препарата. Конденсор специальным винтом, расположенным под предметным столиком, перемещается вверх и вниз. Под конденсором имеется ирисовая диафрагма и откидная оправа для светофильтра. Ирисовая диафрагма служит для задержания лишних лучей света и позволяет при необходимости уменьшить апертуру конденсора (охват линзы; характеризуется количеством лучей, попадающих в линзу). Линзы конденсора вместе с ирисовой диафрагмой вмонтированы в цилиндрическую оправу.

Объектив представляет собой наиболее важную часть микроскопа. Он состоит из системы линз, заключенных в металлическую оправу, которые дают действительное увеличенное обратное изображение. Наружная линза, обращенная к предмету, называется фронтальной, это основная и единственная в объективе линза, дающая увеличение. Выше фронтальной располагаются коррекционные линзы. Они имеют различную кривизну и изготавливаются из стекла разной оптической плотности. Коррекционные линзы предназначены для устранения погрешностей и получения более четкого изображения.

Микроскопы снабжают съѐмными объективами с собственным увеличение 8х, 40х и 90х (100х), обозначенными на металлической оправе. Увеличение объектива зависит от фокусного расстояния фронтальной линзы и от ее кривизны. Чем больше кривизна фронтальной линзы, тем короче фокусное расстояние и тем больше увеличение объектива. Поэтому чем больше увеличение дает объектив, тем ниже его следует опускать над плоскостью препарата.

Окуляр служит для рассмотрения изображения объекта, увеличенного с помощью объектива, и содержит две линзы: глазную (верхнюю) и собирательную (нижнюю). Микроскопы снабжают окулярами с увеличением в 5, 7, 10, 12, 15 и 20 раз, что указано на их оправе (5х, 7х, 10х, 12х, 15х и 20х). Различают моно- и бинокулярные микроскопы.

Общее увеличение, которое дает микроскоп, определяется произведением увеличения объектива на увеличение окуляра. Однако общее увеличение еще не характеризует всех возможностей микроскопа. Увеличенное изображение может оказаться как четким, так и нечетким. Отчетливость получаемого изображения определяется разрешающей способностью микроскопа – минимальным расстоянием между двумя точками, когда они еще не сливаются в одну. Чем больше

разрешающая способность микроскопа, тем меньшей величины объект можно увидеть.

Микроскопический объект можно рассматривать в трех типах системы: сухой – между линзой объектива и объектом находится воздух; водной

– между линзой объектива и объектом находится капля воды – водная иммерсия; масляной – линза объектива погружена в каплю иммерсионного масла – кедрового, касторового, вазелинового – масляная иммерсия.

При микроскопировании на предметный столик помещают препарат, закрепляют его боковыми зажимами и изучают сначала с объективом 8х. Нужный для исследования участок препарата устанавливают в центре поля зрения. Для детального изучения препарата пользуются объективами 40х, осуществляя фокусировку только микровинтом. При смене объективов следует регулировать интенсивность освещения рассматриваемого объекта с помощью ирисдиафрагмы или конденсора. После просмотра препарата переводят револьвер на увеличение 8х и только после этого снимают препарат с предметного столика.

1.2 Приготовление препаратов для микроскопирования.

Для рассматривания микроорганизмов в живом состоянии готовят препарат типа «раздавленная капля». На чистое предметное стекло наносится небольшая капля водопроводной воды, дистиллированную воду брать не рекомендуется, так как в ней отсутствует необходимая для микроорганизмов концентрация солей, что может вызвать изменение формы клеток, потерю ими подвижности и т.д. В каплю воды бактериологической петлей, прокаленной в пламени горелки и охлажденной, помещают исследуемый материал. Препарат накрывают покровным стеклом, помещают на предметный столик микроскопа и исследуют в сухой системе. Капля должна тончайшим слоем заполнить все пространство между покровным и предметным стеклом, но не выступать за края покровного стекла. Излишек выступившей жидкости удаляют фильтровальной бумагой. Препарат «раздавленная капля» быстро готовится, и позволяет установить форму клеток микроорганизмов, их размеры, способ спорообразования, а также наличие или отсутствие подвижности. В качестве недостатка препарата следует отметить его недолговечность.

При исследовании бактерий и дрожжей, выращенных на плотной среде, небольшая масса их берется бактериологической петлей, прокаленной в пламени горелки и охлажденной, и тщательно размешивается в капле воды, нанесенной на предметное стекло.

При исследовании грибов из культур берут небольшой «комочек» мицелия с помощью бактериологической петли в виде буквы «Г» (на конце) и помещают в каплю ПАВ (или воды) на предметном стекле. Затем мицелий осторожно расправляют препаровальной иглой,

стремясь как можно лучше разъединить нити и накрывают покровным стеклом.

Если исследуемые организмы (бактерии, дрожжи) находятся в жидкой среде, то на предметное стекло наносят каплю микробной суспензии без добавления при этом воды или другой жидкости. Суспензию берут бактериологической петлей.

Фиксированный препарат используют при окрашивании. Бактериологической петлей на поверхности предметного стекла делают мазок, подсушивают на воздухе и фиксируют в пламени горелки. В фиксированном препарате клетки мертвые, они значительно лучше воспринимают краситель по сравнению с живыми формами.

Препарат «висячая капля» используют для наблюдения за подвижностью микроорганизмов, их развитием, размножением, прорастанием спор. Для приготовления препарата небольшую каплю суспензии микроорганизма наносят на покровное стекло, переворачивают его каплей вниз и помещают на специальное предметное стекло с углублением в центре. Края лунки предварительно смазывают вазелином.

Препарат отпечаток используют для знакомства с формой спор и мицелия актиномицетов и грибов. Чистое покровное стекло накладывают на газон микроорганизма, слегка надавливают на него пинцетом и снимают, стараясь не сдвинуть в сторону. Полученный препарат помещают отпечатком вниз в каплю воды на предметное стекло и рассматривают под микроскопом в сухой системе. Этот препарат удобен для изучения естественного расположения клеток в колониях микроорганизмов.

Приготовить препараты. На середину чистого предметного стекла наносят каплю воды. В нее вводят немного бактерий, взятых с плотной питательной среды кончиком стерильной бактериологической иглы. Тщательно перемешивают петлей полученную суспензию (она должна быть слабо мутной) и равномерно распределяют(размазывают) ее тонким слоем по поверхности предметного стекла на площади2−3 см2. Полученный мазок высушивают при комнатной температуре на воздухе или(для ускорения) в потоке теплого воздуха пламенем спиртовки, не допуская перегрева стекла(стекло надо держать мазком вверх). После этого мазок фиксируют, для чего стекло с сухим мазком проводят 3−4 раза над пламенем спиртовки, прикасаясь к нему той стороной, где мазок отсутствует. Мазки бактерий можно фиксировать этиловым спиртом, смесью этилового спирта и эфира, а также другими веществами(фиксаторами).

Окрасить препараты. Окраска простым способом.

На охлажденный фиксированный мазок наносят на 20–40 с 2–3 капли карболового фуксина Циля, после чего краску смывают водой из промывалки. Промывание заканчивают, когда вода станет бесцветной.