4047

Промытый препарат просушивают на воздухе. Для более быстрого высыхания нижнюю часть стекла и края, на которых нет препарата, можно промокнуть фильтровальной бумагой.

Окраска спор бактерий.

Для окраски спор готовят мазок бактерий так, как описано выше, но не фиксируют его. На сухой мазок наносят 1–2 капли 0,5%-ного раствора соляной кислоты и нагревают его в течение 1–2 мин над пламенем спиртовки(до выделения паров). Остатки кислоты сливают, мазок промывают водой, высушивают на воздухе и фиксируют в пламени спиртовки. На охлажденный фиксированный мазок наносят1– 2 капли фуксина Циля и нагревают над пламенем спиртовки до появления пара. При этом необходимо следить, чтобы раствор краски не подсох. Краситель смывают водой и погружают препарат в стаканчик с 5%-ным раствором серной кислоты на 20–40 с, после чего его сразу же промывают водой. При погружении в кислоту протоплазма клеток обесцвечивается, а споры остаются окрашенными. На промытый препарат наносят на 3–5 мин метиленовую синь Лефлера(2–3 капли), после чего препарат тщательно промывают водой и высушивают. При этом способе окраски споры окрашиваются в красный цвет, а клетки– в голубой.

Окрасить бактерии по методу Грама.

Сущность метода заключается в том, что бактерии последовательно Окрашиваются красителем генцианвиолетом и йодом, а затем

обрабатываются спиртом. При этом одни бактерии – грамположительные – остаются окрашенными, а другие – грамотрицательные – обесцвечиваются. Это связано с тем, что у грамположительных бактерий образовавшееся окрашенное соединение при обработке спиртом удерживается в протоплазме клетки, а у грамотрицательных оно вымывается из клетки. Приготовить мазок так, как указано выше. На фиксированный мазок кладут полоску фильтровальной бумаги, наносят на нее в том месте, под которым находится мазок, 3–4 капли раствора генцианвиолета, и при помощи пинцета разглаживая бумагу, плотно прижимают к стеклу. Через 2 мин бумагу снимают, а излишки краски смывают водой. На мазок наносят3–4 капли раствора Люголя(раствор йода в йодистом калии) и по истечении 2 мин сливают его. Препарат погружают в стаканчик с 96%-ным спиртом на30–40 с и сразу же после этого промывают водой. На препарат наносят на 2 мин разбавленный раствор фуксина. После этого промывают его водой и просушивают. При данном способе окраски грамположительные бактерии будут фиолетовыми, а грамотрицательные – красными, так как после обесцвечивания спиртом они окрашиваются фуксином.

Внимание!

При недостаточной обработке мазка спиртом все клетки сохраняют свою окраску, а при избыточной все обесцвечиваются.

Микроскопировать окрашенные препараты.

Все окрашенные препараты последовательно микроскопируют сначала с объективом 8х или 10х, а затем наносят на них каплю иммерсионного масла и микроскопируют с объективом 90х или 100х. Увиденное в микроскоп при большом увеличении(объектив 90х или 100х) зарисовывают в тетради. Делают выводы о наличии у разных микроорганизмов спор и об их отношении к окраске поГраму.

Вопросы для самоконтроля

1.Что входит в состав частей микроскопа: механической; оптической; осветительной?

2.Какие объективы называются сухими?

3.Какие объективы называются иммерсионными?

4.Для чего при микроскопировании на больших увеличениях фронтальную линзу объектива помещают в каплю иммерсионного масла?

5.Каковы правила работы с конденсором?

6.Каковы правила работы с макро- и микровинтами?

7.Как определить увеличение:

–монокулярного микроскопа;

–бинокулярного микроскопа?

8. Как приготовить препарат типа «раздавленная капля» и в каких случаях применяют эти препараты?

9. Как приготовить препарат типа «висячаякапля» и в каких случаях применяют эти препараты?

10. Как приготовить мазок?

11. Для чего проводят фиксацию мазка?

12. Какие методы окраски называются простыми, а какие – сложными? 13. Каким образом проводят окраску микроорганизмов простым способом?

14. На чем основана окраска спор бактерий и как ее проводят? 15. На чем основана окраска бактерий по методу Грама и как ее проводят?

16. Какой цвет имеют грамположительные и грамотрицательные бактерии?

Лабораторная работа №2

Обнаружение биологических молекул в субстратах качественными реакциями

Цель: приобрести навыки в определении функциональных групп биологических молекул в различных субстратах.

Задание

1.Провести реакцию на спиртовую группу (в составе глицерина).

2.Провести реакцию на альдегидную группу (в составе глюкозы).

3.Провести реакцию на карбоксильную группу (в составе щавелевой кислоты).

4.Провести реакцию на аминогруппу (в составе глицина). 5.Провести реакцию на карбонильную группу (в составе ацетона).

Практическая часть

1. Реакция на спиртовую группу (в составе глицерина)

Глицерин является трехатомным спиртом, т.е. содержит в своем составе три гидроксильных группы (-ОН). Образует при взаимодействии с гидроксидом меди соединение темно – синего цвета

– глицерат меди.

Порядок выполнения работы.

К 1 мл 1% раствора глицерина добавить 10 капель 10% раствора гидроксида натрия и 4 капли 1% раствора сернокислой меди. Появляется темно – синее окрашивание, обусловленное образованием глицерата меди. Записать уравнение реакции.

2. Реакция на альдегидную группу (в составе глюкозы)

Альдегиды легко окисляются оксидами и гидроксидами тяжелых металлов, превращаясь в кислоты (например, глюкоза окисляется до глюконовой кислоты). Окислитель при этом восстанавливается до закиси или до свободного металла.

Порядок выполнения работы.

Налить в пробирку 0,5 мл 10% раствора глюкозы и 0,5 мл 10% раствора едкого натра, затем добавить 2-3 капли 1% раствора сернокислой меди до образования легкой не исчезающей мути. Содержимое пробирки встряхнуть и нагреть на пламени спиртовки в верхней части раствора. Появление желтого окрашивания, переходящего в красное, свидетельствует об образовании оксида меди

(I).Записать уравнение реакции.

3. Реакция на карбоксильную группу (в составе щавелевой кислоты)

Функциональной группой всех органических кислот является карбоксильная (-СООН). Органические кислоты способны подобно неорганическим взаимодействовать с солями.

Порядок выполнения работы.

В пробирку налить 1 мл 1% раствора щавелевой кислоты, добавить 5-6 капель 2% раствора хлористого кальция. Выпадает осадок щавелевокислого кальция. Записать уравнение реакции.

4. Реакция на аминогруппу (в составе глицина)

Растворы аминокислот при нагревании с нингидрином дают синее или фиолетовое окрашивание. Реакция обусловлена наличием аминогруппы (-NH2 ) в α- положении.

Порядок выполнения работы.

В пробирку наливают 5-6 капель 1% раствора аминокислоты глицин, прибавляют 2 капли 1% раствора нингидрина и нагревают на пламени спиртовки. Появляется сине-фиолетовое окрашивание. Записать результаты опыта.

5. Реакция на карбонильную группу (в составе ацетона)

Ацетон с нитропруссидом натрия дает оранжево – красное окрашивание.

Порядок выполнения работы.

В пробирку поместить 0,3 мл ацетона, 0,3 мл 10% раствора едкого натра и 0,3 мл свежеприготовленного 10% раствора нитропруссида натрия. Развивается оранжево – красное окрашивание. Записать результат опыта. Результаты опытов оформить в виде таблицы.

Вопросы для самоконтроля

Лабораторная работа №3

Определение активности действия ферментов у прокариотических клеток

Цель: Выяснить роль ферментов в клетках прокариот. Сравнить активность фермента в зависимости от условий окружающей среды.

Задание

1.Определить подъемную силу дрожжей ускоренным методом;

2.Определить кислотность дрожжей;

3.Определить фермент инвертазу в биомассе дрожжей.

Материал для исследования: биомасса брикетированных дрожжей различного срока хранения (свежие, 10-12 дней, свыше 12 дней хранения), сухие дрожжи и раствор фермента. Раствор фермента готовится перед занятием. Для этого сухие дрожжи растирают в ступке с трехкратным количеством кварцевого песка, прибавляют десятикратное количество воды и оставляют при 35ºС. После этого смесь фильтруют через бумажный фильтр. Прозрачный фильтрат употребляют в качестве раствора сахаразы.

Образ жизни прокариот состоит в постоянном воспроизводстве своей биомассы. Совокупность протекающих в клетке процессов, обеспечивающих воспроизводство биомассы, называется обменом веществ, или метаболизмом. Клеточный метаболизм складывается из двух потоков реакций, имеющих разную направленность: энергетического и конструктивного метаболизма. Энергетический метаболизм – это поток реакций, сопровождающихся мобилизацией энергии и преобразованием ее в электрохимическую или химическую (АТФ) форму, которая затем может использоваться во всех энергозависимых процессах. Конструктивный метаболизм (биосинтезы) – поток реакций, в результате которых за счет поступающих извне веществ строится вещество клеток; это процесс, связанный с потреблением свободной энергии, запасенной в химической форме в молекулах АТФ или других богатых энергией соединений.

Метаболические пути конструктивной и энергетической направленности состоят из множества последовательных ферментативных реакций и могут быть разделены на три этапа. На начальном — воздействию подвергаются молекулы, служащие исходными субстратами. Иногда эту часть метаболического пути называют периферическим метаболизмом, а ферменты,

катализирующие первые этапы превращения субстрата, — периферическими. Последующие превращения включают ряд ферментативных реакций и приводят к образованию промежуточных продуктов, или метаболитов, а сама цепь превращений объединяется под названием промежуточного метаболизма. Образующиеся на последних этапах конечные продукты конструктивных путей используются для построения вещества клеток, а энергетических — выделяются в окружающую среду.

Метаболическое разнообразие связано с наличием ферментов и ферментных систем. Известные ферменты Прокариот относят к 6 классам: Оксидоредуктазы (окислительно-восстановительные ферменты). Трансферазы ( перенос функциональных групп от одной молекулы к другой). Гидролазы (гидролиз). Лиазы (отщепление функциональной группы с образоваием двойной связи и присоединения радикала по месту двойной связи). Изомеразы (изомеризация). Лигазы (осуществляют реакции синтеза=синтетазы) В микробной клетке ферменты могут функционировать изолировано друг от друга или могут быть связаны в полиферментные цепи. Например: АТФазный комплекс, ферменты дыхательной цепи. Ферменты связаны как структурно, так и функционально. Максимальная активность проявляетс только в комплексе. Выделение фермента приводит к потере активности. В зависимости от места действия фермента различают экзо- (экспортируются клеткой во внешнюю среду) и эндоферменты (функционируют внутри клеток). Микроорганизмы имеют определѐнный набор ферментов, которые являются генетически закрепленными. Различают конститутивные ферметы – синтезируются клеткой постоянно с постоянной скоростью, без них клетка существовать не может. Это ферменты основных метаболических путей клетки. Кроме этого присутствуют индуцибельные ферменты – синтезируются и активируются только в присутствии индуктора, т.е. только когда есть необходимость, в отсутствии же индуктора гены, которые кодируют синтез данного фермента, неактивны, находятся в репрессированном состоянии, а индуктор снимает репрессор.

В таблице представлены некоторые нормы физико-химических показателей дрожжей.

Таблица Нормы физико-химических показателей хлебопекарных дрожжей ( по ГОСТ 171-81)

Практическая часть

В наше время биомассу дрожжей выращивают на мелассе – отходе производства сахара из сахарной свеклы, содержащем сахарозу. Сахароза является дисахаридом, который не может транспортироваться через цитоплазматическую мембрану. Для вовлечения сахарозы в

метаболизм дрожжи вырабатывают фермент инвертазу (сахаразу), которая расщепляет этот дисахарид на глюкозу и фруктозу. Дрожжи Saccharоmyces cerevisiae, выпускаемые для хлебопечения, по органолептическим и физико-химическим качествам должны соответствовать определенным нормам, которые прописаны в ГОСТ

171-81.

Определение подъемной силы дрожжей ускоренным методом

Каждая пара студентов получает свое задание: разные дрожжи с различным сроком годности.

Методика эксперимента: на электронных весах взвесить 0,31 г дрожжей, перенести в фарфоровую чашку, прилить 4,8 мл 2,5% раствора хлорида натрия, нагретого до 35 °С, и тщательно перемешать шпателем или пестиком. К полученному раствору добавить 7 г муки, замешать тесто и придать ему форму шарика. Шарик опустить в стакан

с200 мл воды, нагретой до температуры 35 °С, и поместить в термостат

стой же температурой. Отметить время, прошедшее с момента погружения шарика на дно стакана, до момента его всплывания. Время подъема шарика в минутах умножить на коэффициент 3,5, полученный эмпирически для определения подъемной силы.

Определение кислотности дрожжей

Студенты проводят опыт с теми же дрожжами, которые были выданы ранее.

Методика эксперимента: Взвесить 10 г. дрожжей, поместить в колбу вместимостью 100 мл, залить 50 мл дистиллированной воды и перемешать. Титровать 0,1 н. раствором NaOH в присутствии фенолфталеина до розового окрашивания. При титровании колбу необходимо непрерывно встряхивать для поддерживания однородности суспензии.

Все результаты опытов записывают в тетради, сравнивают и делают соответствующие выводы о соответствии дрожжей различного срока годности стандартам, а также о влиянии условий хранения дрожжей на их физико-химические показатели.

Качественное определение фермента инвертазы

В пробирку налить 2 мл 6.5% раствора сахарозы, добавить 0,5 мл раствора фермента. Через 10 минут в пробирку добавить 3 мл раствора 8%-ного сульфата меди, 3 мл 3%-го раствора сегнетовой соли(двойной виннокислой соли калия-натрия)в 2 н. растворе гидроксида натрия, перемешать и поставить пробирку на 3 минуты в кипящую водяную баню. В качестве контроля взять пробирку, в которой вместо фермента добавлено 0,5 мл дистиллированной воды. Контрольную пробирку также поставить на 3 минуты в водяную баню. Отметить изменения, произошедшие в растворе, отметить цвет осадка, самостоятельно написать уравнение процесса, отметить отсутствие изменений в контрольном растворе, написать причину изменений в опытном и отсутствия изменений в контрольном растворе.

Вопросы для самоподготовки

1.Какие энергетические процессы протекают в клетках дрожжей в анаэробных и аэробных условиях?

2. Какова роль ферментов в прокариотических клетках?

Лабораторная работа №4

Определение активности действия ферментов у эукариотических клеток

Цель: на основе изучения клеток бактерий (прокариот), растений и животных (эукариот) показать основные отличия в строении клеток прокариот и эукариот, а также обнаружить основные черты сходства в строении клеток бактерий, животных и растений как показатель единства организации живых форм.

Задание

Обосновать значение фермента каталазы в клетках растений и животных.

Оборудование: микроскопы, предметные и покровные стекла, пипетки, настой иода, стаканы с водой, пинцеты, скальпели, водные растворы туши, готовые препараты бактерий, фуксина, метиленового синего, настой различных естественных материалов (мяса, рыбы, овощей и др.), пленка лука или лист элодеи, готовые препараты животных тканей, свежий 3% раствор пероксида водорода.

Для изучения морфологии бактерий следует заранее приготовить настой из различных естественных материалов: мяса, рыбы, белка яйца, навоза, сена и др. небольшое количество материала измельчают, помещают в колбу, на кончик скальпеля добавляют немного мела и заливают водопроводной водой на 2/3 объема. Колбу с настоем выдерживают в термостате при 25-280С или в теплом помещении в темноте 3-5 дней. За это время в среде накапливается масса разнообразных бактерий.

На предметное стекло поместите каплю настоя, наиболее богатого микрофлорой (обычно это настой мяса или рыбы). Приготовьте временный препарат, рассмотрите при разных увеличениях.

Просматривая препараты, делайте зарисовки бактерий, обращая внимание на форму, взаимное расположение клеток и на соотношение размеров бактерий при разном увеличении микроскопа. Добавив в каплю настоя тушь, можно приготовить негативный тушевой препарат. В поле зрения микроскопа на общем темном фоне туши отчетливо видны неокрашенные клетки бактерий.

Настоящего ядра у бактерий нет, а имеется скопление хромосом, видны жировые включения, у некоторых бактерий видна капсула, представленная слизистым слоем, жгутики и т.д.

После рассмотрения и зарисовки клеток бактерий приготовьте временные препараты растительной и животной клеток. Используйте клетки кожицы лука. Рассмотрите препарат при малом увеличении. Будет видна на препарате группа вытянутых, почти прямоугольных клеток. Крупные округлые ядра в клетках окрашены йодом в желтый цвет.

Рассмотрите препарат при большом увеличении и найдите оболочку клетки. В ядре можно заметить 1-2 ядрышка, иногда видна зернистая структура цитоплазмы. Неокрашенные пустоты в цитоплазме клеток представляют собой вакуоли. Зарисуйте несколько клеток. Обозначьте оболочку, цитоплазму, ядро и вакуоли.

На препарате листа элодеи можно увидеть множество округлоовальных телец зеленого цвета. Это хлоропласты. Ядра в неокрашенных клетках не видны. Капнуть на микропрепарат пероксид водорода и снова рассмотреть под микроскопом. Объяснить наблюдаемое явление. Капнуть пероксида водорода на предметное стекло покрыть покровным стеклом и рассмотреть под микроскопом, описать наблюдаемую картину. Сравнить состояние пероксида водорода в листе элодеи и на стекле. Объяснить наблюдаемое явление. Нанести каплю пероксида водорода на мертвый лист (убитый кипячением) элодеи, опишите наблюдаемое явление.

Готовые микропрепараты животных тканей (эпителий) рассмотрите при малом и большом увеличении микроскопа. В поле зрения будут многоугольные клетки с тонкими оболочками. В центре клеток расположены ядра округлой формы. Зарисуйте несколько клеток. На рисунке должны быть обозначены: оболочка, цитоплазма, ядро.

Приготовьте пять чашек Петри и пронумеруйте их. Поместите: в первую – немного речного песка;

вторую – кусочек сырого картофеля и измельченного сырого картофеля; третью – кусочек вареного картофеля и измельченного вареного картофеля;

четвертую – кусочек сырого мяса и измельченного сырого мяса; пятую – кусочек вареного мяса и измельченного вареного мяса.

Капнуть на каждую пробу 1–2 капли пероксида водорода. Понаблюдать что происходит. Сравнить активность измельченной и целой растительной и животной тканей. Составить таблицу, показывающую активность каждой ткани при различной обработке.

Вопросы для самоконтроля

1.Какие положения клеточной теории можно подтвердить результатами проведенной работы?

2.Как проявляется активность фермента в живых и мертвых тканях? 3. Каково значение фермента каталаза в живых организмах?

Лабораторная работа №5

Определение специфичности действия ферментов