Бёккер_Хроматография [2009]
.pdf
280
Глава 5. Тонкослойная хроматография
ТСХ пластинка
Рис. 5.6. Нанесение пробы с помощью дозирующего микрометра
5.6.3. Контактное нанесение
Для больших объемов до 100 мкл подходит процедура контактного нанесения. При этом полимерная пленка из фторированного углеводорода накладывается на уг& лубления трафарета для нанесения пробы и вакуумируется, что обеспечивает точ& ное прилегание пленки к углублениям. В углубления наносится раствор исследу& емой пробы и затем осторожно, почти досуха, выпаривается. Сконцентрирован& ный до небольшого объема раствор приводится в контакт со адсорбционным сло&
Пленка
фторполимера
Прибор для нанесения пробы
Втягивание
полимерной
пленки
Нанесение
пробы
Испарение
(концентрирование)
пробы
ТСХ>пластинка
Перенос пробы на слой ТСХ пластинки
Рис. 5.7. Перенос пробы в методе контактного нанесения
5.6. Нанесение проб 281
ем пластинки. После этого полимерную пленку поддавливают с обратной сторо& ны с помощью газа и пробу переносят на пластинку, как показано на рис. 5.7.
5.6.4. Автоматические устройства для нанесения пробы
Преимущество ТСХ в высокой производительности можно только тогда исполь& зовать полностью, когда будет автоматизировано нанесение проб. Примерно одна треть времени сложных анализов расходуется при нанесении пробы. Вместе с тем, этап нанесения проб не только требует больше всего времени, но и больше всего подвержен ошибкам, а также предъявляет самые высокие требования к умению и надежности лаборанта. Автоматизация этого шага делает инструментальную ТСХ более привлекательной для рутинной аналитики. Нанесение пробы с помощью автоматического устройства происходит правильно и с желательным для автома& тической обработки результатов точностью дозирования пробы и ее позициони& рования [5.61].
Функция автодозатора показана на рис. 5.8. В специальных закрытых емкос& тях находятся растворы пробы и стандартные растворы. Головная часть с капил&
Рис. 5.8. ТСХ автодозатор: 1 – блок нанесения пробы; 2– «черновая» ТСХ пластин& ка; 3– рабочая ТСХ пластинка; 4 – капилляр для нанесения пробы; 5 – до& зирующий шприц; 6 – емкости с образцами; 7 – головка устройства нанесе& ния пробы; 8 – крышка с прокладкой
282
Глава 5. Тонкослойная хроматография
ляром, управляемая x&y&позиционером, направляется к емкости пробой и заби& рает пробу путем протыкания резиновой прокладки. Затем капилляр подходит к предварительно выбранной позиции на пластинке ТСХ и наносит пробу. Чтобы избежать загрязнений между отдельными нанесениями проб, небольшое коли& чество раствора пробы сначала наносится на вторую, «черновую» пластинку, чтобы освободить конец капилляра от жидкости, находящейся снаружи капилля& ра. После нанесения пробы капилляр направляется к сосуду для слива, в который сбрасывается остальная часть пробы и заранее заданный объем промывной жид& кости.
Вся программа полностью автоматизирована и управляется персональным компьютером. С помощью подходящих устройств, которые работают по методу распыления, возможно нанесение пробы в виде полоски. При этом пробу от иглы шприца на пластинку ТСХ переносит поток газа.
Этот давно известный принцип предотвращает повреждения слоя и делает возможным движение модуля, наносящего пробу во время подачи пробы. Таким образом, возможно бесконтактное нанесение пробы в виде штриха или в виде пятна.
5.7. Проявление хроматограммы
После того как раствор вещества нанесен на линию старта и высох, пластинку переносят в камеру разделения, которая, в большинстве случаев, наполнена элю& ентом на 0,5–1 см. Стартовые пятна находятся, таким образом, над поверхностью растворителя. Теперь происходит собственно получение хроматограммы. Под тер& мином «тонкослойная хроматография» понимают процесс, в ходе которого ра& створитель или смесь растворителей проникает, благодаря капиллярным силам и в некоторых случаях под действием давления, в слой сорбента и двигается вперед, перенося пробу. Проба разделяется на компоненты благодаря взаимодействиям с подвижной и стационарной фазами.
В процессе хроматографии происходит распределение веществ между стаци& онарной и подвижной фазами. При этом слой сорбента и растворитель сами по себе не являются стационарной и подвижной фазами. Эти фазы возникают толь& ко после того, как пластинку поставили в камеру. Это процесс, который состоит из многих отдельных этапов. Один из них – это насыщение сорбента парами ра& створителя. Самый полярный компонент элюента адсорбируется на силикагеле и образует стационарную фазу вместе с уже адсорбированной во время нанесения водой из паров влажного воздуха.
На практике применяются различные, описанные ниже виды ТСХ. В прин& ципе, есть три способа реализовать ТСХ разделение:
•линейный (восходящий или горизонтальный),
•круговой с ходом от центра (циркулярный),
•круговой с ходом к центру (антициркулярный).
В линейной ТСХ пластинку погружают ее нижним краем в подходящий ра& створитель, который капиллярными силами поднимается по слою и компоненты
5.7. Проявление хроматограммы 283
пробы разделяются. Когда растворитель прошел нужное расстояние, хроматогра& фию останавливают. Обычно достаточно расстояния пробега в 10 см или меньше. Пластинки непосредственно после достижения желаемого расстояния достают из камеры, растворитель быстро испаряют с пластинки струей теплого воздуха с по& мощью фена, так как иначе в жидкой фазе может произойти повторное смешива& ние разделенных веществ за счет диффузии.
Результат разделения сильно зависит от того, была ли насыщена хроматогра& фическая камера или нет. Камеру насыщают так: часть стенок камеры с внутрен& ней стороны обкладывают фильтровальной бумагой, наливают растворитель, зак& рывают камеру крышкой и оставляют примерно на 15 мин. При этом давление паров в камере обеспечивает максимальную адсорбцию вещества пробы на плас& тинке. При этом, например, вода, которую адсорбировал слой, может частично вытесняться. Растворитель – подвижная фаза – мигрирует вверх по этому насы& щенному парами слою, который и представляет собой стационарную фазу.
При другом методе работы растворитель добавляют в пустую камеру, ставят в нее пластинку и закрывают камеру крышкой. В этом случае насыщение слоя, ко& торый находится до фронта растворителя (из которого и возникает стационарная фаза), – это сложный процесс. На фронте из&за теплоты адсорбции происходит испарение растворителя. Этот испаренный растворитель частично попадает в ка& меру, частично снова насыщает слой перед фронтом. Растворитель поднимается существенно медленнее, чем при насыщении камеры. Готовая хроматограмма похожа на ту, что образуется при многократном повторении разделения в насы& щенной камере. Соответственно вещества мигрируют значительно дальше, чем при однократном разделении в насыщенной камере. Этот способ используют, толь& ко если при насыщении камеры вещества мигрируют очень медленно.
5.7.1. Элюент
Для качественных исследований достаточно чистоты обычно используемых в хи& мических лабораториях растворителей; разделения для количественных оценок должны проводиться, напротив, со специальными высокоочищенными раство& рителями для хроматографии. Растворитель для насыщения камеры не должен использоваться слишком долго, как правило, только от 2 до 5 раз, так как компо& ненты смеси растворителей испаряются в зависимости от летучести при открыва& нии камеры неравномерно. Кроме того, может происходить обеднение раствори& теля, если он охотно адсорбируется на пластинке. Это особенно актуально тогда, когда двухкомпонентная смесь содержит один компонент лишь в незначитель& ном количестве. В этих случаях элюент используется однократно. В случае сили& кагеля это касается, например, полярных компонентов элюента. Кроме того, ком& поненты элюента могут взаимодействовать друг с другом.
5.7.2. Типы камер
Пластинку нужно опустить в растворитель по всей ее ширине примерно на 5 мм. При этом стартовые пятна должны лежать до уровня жидкости. Принципиально различают два вида камер, а именно: большие камеры (нормальные камеры) и
284
Глава 5. Тонкослойная хроматография
камеры с очень узким паровым пространством (камеры типа «сэндвич»). Самыми простыми являются стандартные камеры, а также двойные камеры для двух плас& тинок или камеры для одновременного разделения на пяти пластинках.
5.7.2.1. Нормальная камера
Чаще всего в ТСХ используется нормальная камера из стекла размерами 21 × 21 × 9 см. Она подходит для одновременного разделения максимум двух пластинок 20 × 20 см.
В случае работы с насыщенной камерой полоску фильтровальной бумаги вы& резают таким образом, чтобы осталось узкое окно для наблюдения за ходом разделения. В камеру наливают примерно от 100 до 150 мл растворителя до высо& ты от 0,5 до 1 см и осторожно взбалтывают, чтобы увлажнить фильтрованную бу& магу и уравновесить камеру с растворителем. На крышку камеры нельзя наносить смазку, чтобы предотвратить ее попадание в растворитель или на слой сорбента.
Также нужно избегать бокового касания пластинки с фильтрованной бумаги, так как в этом случае растворитель попадает сбоку на разделяющий слой, фронт в этой области изгибается, и хроматограмма считается испорченной. По оконча& нии разделения пластинку вынимают и сушат.
5.7.2.2. Двойная камера
Двойная камера разделена перегородкой на две части. При нормальной линейной хроматографии расход растворителя (по 20 мл на каждую пластинку 20 × 20 см) становится заметно меньше по сравнению с нормальной камерой, вместе с тем со& кращаются и проблемы утилизации отходов. Двойная камера может использовать& ся также для полного предкондиционирования пластинок. При этом растворитель находится в одной части, а пластина – в другой. Примерно через 10 мин камеру наклоняют, растворитель перемещается в другую часть камеры и начинается раз& деление. Как вариант камеру можно уравновесить предварительно любым раство& рителем, в который не погружена пластинка. Различные возможности представ& лены на рис. 5.9.
НОРМАЛЬНОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ
В процессе разделения расходуется практически весь растворитель. Это дает не только экономию растворителя, но и уменьшает проблемы удаления отходов.
Рис. 5.9. Двойная камера
5.7. Проявление хроматограммы 285
Поддерживающие
пластинки
Покровное стекло
Точки старта
ТСХ пластинка
Рис. 5.10. Камера типа «сэндвич»
ПОЛНОЕ ПРЕДКОНДИЦИОНИРОВАНИЕ ПАРАМИ РАСТВОРИТЕЛЯ
Растворитель находится в одной части камеры, пластинка – в другой части, через некоторое время камеру наклоняют, растворитель перемещается в другую часть камеры и начинается разделение.
НАСЫЩЕНИЕ КАМЕРЫ ВЫБРАННЫМ РАСТВОРИТЕЛЕМ
Преднасыщение может происходить сколь угодно долго. Процесс начинается толь& ко тогда, когда растворителем наполняется вторая камера, в которой стоит плас& тинка.
5.7.2.3. Камера типа сэндвич (S%камера)
Хроматографическая пластинка покрывается стеклянной пластиной так, что толь& ко нижняя зона шириной примерно в 2 см остается свободной. При этом стекло не должно опускаться в растворитель. Этот «сэндвич» можно устанавливать в лю& бую камеру. Такое расположение представляет идеально ненасыщенную камеру, так как закрывающая стеклянная пластина значительно предотвращает газовый обмен с испаренным элюентом. Она может переоборудоваться, наоборот, также в идеально насыщенную камеру, когда в качестве покровного слоя используется пластинка, насыщенная растворителем.
Камера (рис. 5.10) используется, если сорбционный слой не должен быть на& сыщен элюентом или чтобы избежать испарения растворителя с пластинки.
5.7.3. Простая хроматография
Обычно растворителю дают подняться на 10 см над линией старта. Если же удов& летворительное разделение достигается при длине пробега растворителя, напри& мер, уже в 7 см, то это надо рассматривать как явное преимущество, так как в этом случае хроматография занимает лишь половину того времени, которое нужно для разделения при длине пробега 10 см. Если сорбционный слой насыщен раствори&
286
Глава 5. Тонкослойная хроматография
телем, то отношение времен пробега примерно пропорционально отношению квад& ратов длин пробега, то есть в данном случае составляет 49 : 100. Кроме того, зоны веществ из&за диффузии уширяются при увеличении времени анализа.
5.7.4. Одномерное многократное разделение
Смесь веществ можно элюировать несколько раз одним и тем же растворителем, если первое элюирование не дает достаточного разделения. Это полезно, прежде всего, для веществ с небольшой подвижностью, т.е. вещества, которые не разделя& ются при однократном элюировании, будут разделены при втором или третьем элю& ировании. Между отдельными циклами растворитель следует полностью удалять с ТСХ пластинки. Для этого пластинку сушат в токе теплого воздуха (феном). В слу& чае чувствительных летучих веществ нужно использовать вакуумный эксикатор.
Чаще всего применяется восходящая (линейная) техника элюирования. В слу& чае горизонтального метода элюент непрерывно подается на горизонтально рас& положенную пластинку с помощью фитиля или капиллярной щели, причем элю& ировать можно как с одной стороны пластинки, так с двух сторон к ее середине.
5.7.5. Двумерное разделение
Если компоненты смеси не разделяются полностью в одном направлении движе& ния, то их пытаются разделить с помощью двухмерной техники. Для этого смесь веществ наносят с левого конца линии старта квадратной ТСХ пластинки. При первом элюировании получается одномерная хроматограмма. После высушива& ния первого элюента пластинку поворачивают на 90° налево для разделения во втором направлении. Если для обоих направлений используют один и тот же элю& ент, то вещества будут расположены на диагонали пластинки. Если во втором на& правлении используют элюент, в котором некоторые вещества имеют другую ско& рость миграции, то пятна вещества распределяются по поверхности пластинки, как показано на рис. 5.11. Для данной пары элюентов и данной смеси веществ
Элюент I
Элюент II
Рис. 5.11. Двумерная тонкослойная хроматография
5.7. Проявление хроматограммы 287
получается характеристичное распределение. Этим методом можно разделять ве& щества, которые нельзя разделить при использовании только одного элюента.
5.7.6. Камера для автоматического разделения
Как правило, получение тонкослойной хроматографии требует контроля со сто& роны пользователя. Предкондиционирование, достижение фронтом элюента же& лательного пробега, извлечение и высушивание пластинки требуют высоких тру& дозатрат, которые не позволяют достичь высокой производительности. Благодаря автоматической ТСХ камере повышается воспроизводимость получения хроматог& раммы, а вместе с тем исключаются ошибки обслуживающего персонала. Пользо& ватель освобождается от необходимости контроля. Рис. 5.12 показывает автомати& ческую ТСХ камеру с предкондиционированием и возможностью предварительно& го выбора как направления движения элюента, так и условий высушивания.
Хроматография происходит автоматически в контролируемых условиях. За движением фронта элюирования наблюдают при помощи сенсора CCD, так как мокрый слой отражает свет по&другому, чем сухой слой. Пройденное элюентом расстояние и затраченное на это время постоянно сообщаются монитором. Если элюент прошел предварительно заданное расстояние, то процесс разделения пре& кращается и пластинка высушивается в камере с отфильтрованным теплым или холодным воздухом. После этого она остается в этой камере под защитой до тех пор, пока пользователь не достанет ее.
Рис. 5.12. Схематическое изображение автоматической ТСХ камеры: 1 – фильтр на основе активированного угля; 2 – вентилятор; 3 – воздушный кла& пан; 4 – стеклянное окошко; 5 – покровная пластинка; 6 – ТСХ плас& тинка; 7 – крышка камеры; 8 – нагревающий элемент; 9 – воздушный клапан; 10 – емкость с растворителем
288
Глава 5. Тонкослойная хроматография
5.7.7. Камера для линейной высокоэффективной тонкослойной хроматографии
Если высокоэффективную тонкослойную хроматограмму получают в камерах боль& шого объема, то часто приходится мириться с недостатками, которые присущи так& же обычным ТСХ: неконтролируемое и изменяющееся в процессе разделения вли& яние газовой фазы и незаметное изменение состава подвижной фазы. В линейной камере для ВЭТСХ подвижная фаза подается в правильных, необходимых для хро& матографии объемах. Разделение происходит в S&камерах либо без воздействия под& вижной фазы на еще сухой слой сорбента либо с насыщением сухого слоя парами растворителя.
Разделение можно проводить с обоих краев пластинки по направлению к цен& тру, что позволяет удваивать число проб по сравнению с обычными методами ТСХ (рис. 5.13). Несмотря на удвоенное число в распоряжении имеется достаточное пространство для разделения проб. В особых случаях, если желательна большая длина пробега, то разделение проводят только с одной стороны пластинки.
Рис. 5.13. Камера для линейной высокоэффективной тонкослойной хромато& графии
Пластинку для ВЭТСХ (1) кладут слоем вниз на линейную камеру. На неболь& шом расстоянии не более 0,5 мм помещают стеклянную пластинку (2). Таким об& разом, предотвращают влияние паров подвижной фазы на сухой слой. Если раз& делению благоприятствует предкондиционирование слоя или предварительное насыщение камеры парами подвижной фазы, то перед разделением пластинку уравновешивают с растворителем в специальном сосуде.
Подвижную фазу подают шприцом от 1 до 1,5 мл в каждую из двух ванн. Про& цесс разделения начинается при опрокидывании в ваннах по направлению к пла& стинке двух стеклянных полосок (3). Одновременно с этим ванны с подвижной фазой закрываются маленькими защитными крышками (4). Между стеклянной полоской (3) и стенкой ванны образуется капиллярная щель, по которой подвиж& ная фаза мгновенно поднимается и подается равномерно к краю слоя. Чтобы ис& ключить внешнее влияние во время разделения, камеру закрывают защитным колпаком (5).
Это метод разделения в горизонтальной камере принят ВОЗ для контроля ле& карственных растений, а также вошел в немецкий лекарственный кодекс и в Ев& ропейскую рецептурную книгу.
5.7. Проявление хроматограммы 289
5.7.8.Инструментальное многократное разделение
Вслучае реальных проб речь идет в основном о сложных смесях проб, компонен& ты которых могут сильно отличаться своей полярностью. Поэтому преобладаю& щее число разделений ВЭЖХ проводится с помощью градиентного элюирования, при котором во время разделения изменяется полярность подвижной фазы. По& этому для тонкослойной хроматографии также было необходимо разработать ав& томатизированной прибор для градиентного элюирования. При этом основная идея состоит в том, что хроматографическое разделение расчленяют на несколько этапов, причем после каждого отдельного этапа подвижную фазу полностью уда& ляют с пластинки. Тем самым реализуется второе преимущество этого метода, которое состоит в том, что зоны веществ будут сфокусированы.
В1973 году была предложена новая техника разделения для ТСХ [5.7], назван& ная программируемым многократным элюированием, ПМЭ (англ.: Programmed multiple development, PMD). В данном методе пластинка неоднократно обрабаты& вается одной и той же подвижной фазой в одном и том же направлении. Длина пробега веществ несколько увеличивается на каждом следующем этапе по срав& нению с предыдущим. Между разделениями слой просушивают с помощью теп& лового излучения, которое может сопровождаться потоком воздуха (фен). Нижний край слоя остается постоянно погруженным в подвижную фазу, причем резервуар для подвижной фазы изолирован от теплового воздействия. Длина пробега под& вижной фазы на каждом этапе регулируется по времени, т.е. продолжительностью интервалов между циклами высушивания.
Более новым методом является предложенное в 1984 году «автоматизирован& ное многократное элюирование», АМЭ (Automatted multiple development, AMD), которое делает возможным воспроизводимое градиентное разделение с помощью инструментальной ТСХ и, в принципе, является дальнейшим совершенствова& нием метода ПМЭ [5.8]. Техника АМЭ следует тому же принципу получения хро& матограмм в несколько этапов в одном и том же направлении, причем каждое отдельное разделение происходит при большей длине пробега подвижной фазы, чем на предшествующем этапе. Различие с ПМЭ состоит в том, что для каждого этапа можно использовать другую подвижную фазу. Для этого подвижная фаза после каждого прогона полностью удаляется из камеры. Чтобы избежать возник& новения артефактов при сушке пластинки, высушивание проводят при понижен& ном давлении.
Для разделения веществ, обладающих широким диапазоном полярностей, так же, как для разделения веществ с неизвестным хроматографическим поведением, подходит универсальный градиент. Иначе, чем в колоночной хроматографии, для силикагеля в качестве стационарной фазы градиент начинается с наиболее по& лярного растворителя с наименьшей длиной пробега и заканчивается наименее полярным растворителем, который проходит наибольшее расстояние. Рис. 5.14 показывает типичный градиент элюента, который формируется тремя раствори& телями: метанолом, дихлорметаном и н&гексаном. Такой градиент дополнитель& но может содержать диэтиловый эфир и/или ацетонитрил, если окажется, что разделение происходит в полярной области. Длительность разделения возрастает