Бёккер_Хроматография [2009]

170 Глава 4. Высокоэффективная жидкостная (колоночная) хроматография

ваны в одном приборе и управляются одним процессором. С точки зрения об& служивания это является оптимальным решением, хотя, конечно, есть опасность, что, если сломается хотя бы один компонент, вся система полностью выйдет из строя. Для начинающих работать в области хроматографии такие приборы удоб& ны тем, что они не требуют никаких предварительных знаний и все компоненты уже оптимально собраны в едином приборе.

Благодаря ПК упростилась связь отдельных элементов прибора между собой. Поэтому модульный тип прибора получает все большее распространение. Из под& ходящих комплектующих можно собирать прибор индивидуальной оптимальной конфигурации, в котором могут сосуществовать компоненты различных произ& водителей. Можно предвидеть, что в ближайшем будущем на рынке появятся при& боры следующего поколения, которые смогут полностью автоматически оптими& зировать разделение, проанализировать пробы в различных условиях и на осно& вании хроматографических данных оптимизировать весь процесс.

Современная жидкостная хроматография предъявляет высокие требования к приборам. Быстрые анализы на коротких колонках, заполненных маленькими частицами, возможны, только если поток при высоком давлении подается без пульсаций. Стабильность потока необходима, чтобы понизить шумы детекторов. Только при постоянном потоке можно с обычными, чувствительными к концен& трациям детекторами проводить точные количественные анализы. Система в це& лом, особенно от устройства ввода пробы до выхода из детектора, должна быть оптимизирована так, чтобы повторное перемешивание разделенных зон вслед& ствие дисперсии было бы по возможности наименьшим. Новые разработки – осо& бенно микроколонок – ставят существенно более высокие требования к прибо& рам, даже с подгонкой ввода пробы или соединительных деталей (по возможнос& ти без мертвых объемов), чувствительная детекция с фотометрическими детекто& рами из&за слишком больших объемов ячейки кажется едва ли возможной.

Химические свойства используемых элюентов и необходимых для оптимиза& ции разделения добавок предъявляют высокие требования к коррозионной ус& тойчивости элементов, используемых в конструкции. В конечном итоге, четыре тенденции определяют дальнейшее развитие рынка приборов.

БОЛЕЕ ВЫСОКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ

Для достижения более высокой эффективности колонки заполняют более мел& кими частицами. Размер зерна составляет обычно 5 мкм, а в последнее время ис& пользуются также частицы размером 3 мкм. Это предполагает, что придется ми& риться с более высоким перепадом давлений, чтобы поддерживать соответствую& щую скорость потока элюента. Частицы меньшего размера позволяют достичь необходимого разрешения на более коротких колонках. Для эксплуатации с оп& тимальной скоростью потока колонки, заполненной частицами 3 мкм, следует поддерживать величину давления не ниже 10 бар на каждый сантиметр длины ко& лонки. Соответствующее мертвое время составляет 10 с на сантиметр колонки. При этих условиях на каждый сантиметр длины колонки приходится 1500 теорети& ческих тарелок. Для частиц 5 мкм соответствующие величины составляют около 2,5 бар на 1 см; 17 с на 1 см и 1000 теоретических тарелок на 1 см.

4.1. ВЭЖХ%оборудование 171

БЫСТРЫЕ АНАЛИЗЫ

Конечно, возникает желание сделать ЖХ анализы более быстрыми. Это означает работу с потоком, превышающим оптимальный предел для соответствующей ко& лонки. Следствием этого является более высокое давление, которое должно при& кладываться к колонке. Для элюирования неудерживаемого вещества за 10 с наибо& лее часто используемыми метанольно&водными смесями на колонке длиной 10 см, заполненной частицами 3 мкм, необходим перепад давлений в 1000 бар.

ЭКОНОМИЯ ЭЛЮЭНТОВ

Дорогие элюэнты, трудная и дорогостоящая утилизация отходов, малые количе& ства анализируемых веществ, а также желание совместить жидкостную хроматог& рафию и масс&спектрометрию вернули в практику тонкие колонки с внутренним диаметром от 0,5 до 2 мм вместо обычных 4,6 мм. Скорость потока в таких тонких колонках (1 мм) при той же эффективности разделения в 20 раз меньше. Это означает, что обычная для стандартной аналитической колонки скорость пото& ка 1 мл/мин уменьшается до 50 мкл/мин для колонки диаметром 1 мм.

ТРЕХ- И ЧЕТЫРЕХКОМПОНЕНТНЫЕ ГРАДИЕНТЫ РАСТВОРИТЕЛЕЙ

Трудные проблемы разделения, которые для обращеннофазовых систем не могут быть решены с обычными двухкомпоентными смесями, привели к применению трех& и даже четырехкомпонентных систем элюентов. Поэтому необходимо не толь& ко быстро менять элюенты от одного анализа к другому, но и для каждого подби& рать подходящую комбинацию, включая трех& или четырехкомпонентные смеси.

4.1. ВЭЖХ оборудование

Основными составляющими оборудования для ВЭЖХ являются система ввода пробы, насос высокого давления для прокачивания подвижной фазы, хроматог& рафическая колонка, которая соединена капилляром с проточным детектором, а также необходимый для качественного и количествнного анализа самописец или электронный интегратор. Соответвенно этим частям прибора автоматически про& текают отдельные этапы хроматографического анализа:

•ввод пробы,

•разделение,

•детектирование,

•количественная обработка данных.

Конструкция и составные части любого ВЭЖХ прибора не зависят от того, какой используется принцип разделения. Обычные приборы, в принципе, осна& щены для аналитических задач, но позволяют проводить также и микропрепара& тивные работы. Путем замены головки насос можно просто перестроить на пре& паративную хроматографию. Но больший диаметр поршня означает меньшее пре& дельное давление насоса. Преимуществом модульного оборудования является то, что из отдельных комплектующих можно собрать оптимальный прибор, удовлет& воряющий конкретным потребностям [4.1].

172 Глава 4. Высокоэффективная жидкостная (колоночная) хроматография

Очень хорошая воспроизводимость разделения для качественного анализа (по временам удерживания) и для количественного анализа (расчет по площади или высоте пиков) предъявляет высокие требования к производительности и корро& зионной устойчивости отдельных комплектующих [4.2]. Высокая разделяющая способность колонки стоит немного, если после колонки происходит значитель& ное размывание пика. Комплектующие с малыми мертвыми объемами и соответ& ствующие используемому потоку отвечают за то, чтобы разделение, достигнутое в колонке, не было сведено на нет уширением пиков.

Так как физическое разделение веществ в ВЭЖХ колонке определяется изо& термой сорбции, то разделяющая способность колонки прямо зависит от темпе& ратуры. Практически все физические феномены хроматографии, такие как сорб& ционное равновесие, диссоциация, растворимость и вязкость зависят от темпе& ратуры, и их действие следует рассматривать как аддитивную величину. Поэтому для достижения хорошей воспроизводимости результатов необходима очень ста& бильная температура колонки. Для этого используются колоночные термостаты, постоянная температура в которых поддерживается либо с помощью водяной бани, либо за счет электрически нагреваемого алюминиевого блока, либо за счет цир& куляции воздуха. С помощью микропроцессорных технологий можно достичь постоянства температуры < 0,1 °C [4.3].

4.2. Насосы для ВЭЖХ

Применяемая сегодня ВЭЖХ предъявляет высокие требования к системе насосов, особенно в отношении отсутствия пульсаций при подаче растворителя. Высокое давление около 150 бар необходимо для того, чтобы подвижную фазу можно было прокачивать с необходимой скоростью через хроматографическую колонку, по& скольку мелкие частицы, которыми заполнена колонка, создают высокое сопро& тивление потоку. Насос высокого давления должен обеспечивать с высокой точно& стью постоянный и равномерный поток, с тем чтобы сделать возможным достовер& ный качественный анализ по объемам (или времени) удерживания и чувствитель& ный количественный анализ без влияния пульсации на свойства детектора [4.4]. Пульсации проявляются в дрейфе базовой линии и в шумах детектора.

Для аналитической работы со стандартными колонками (с диаметром внут& реннего сечения 4,6 мм) используемая скорость потока находится в пределах от 0,1 до 10 мл/мин. Часто выбирают стандартную скорость потока 2 мл/мин. Для препаративных работ необходимы более высокие скорости потока.

Насосы для ВЭЖХ являются той частью ВЭЖХ системы, которая подвергает& ся наиболее высоким нагрузкам. Они должны работать стабильно продолжитель& ное время и зачастую в трудных условиях, как, например, при контроле процес& сов, давать надежный, постоянный и воспроизводимый поток. Насос должен быть прост в обращении, это означает, например, что желаемая скорость потока уста& навливается просто и воспроизводимо. Система подачи растворителя существен& но влияет на количественный и качественный результаты ВЭЖХ анализа [4.5]. Регулируемое давление сверху и снизу предоставляет возможность оставлять ра& ботающий насос без наблюдения также и на ночь.

174 Глава 4. Высокоэффективная жидкостная (колоночная) хроматография

тельно продолжительной паузы начинает подавать свободный от пульсаций поток подвижной фазы. В последнее время этот принцип снова находит больше примене& ния при подаче элюэнта на узкие разделительные колонки (микроколонки) или в системах подачи элюента в сверхкритической флюидной хроматографии (СКФХ).

4.2.2. Насосы непрерывного действия

Преобладающее большинство современных насосов работает с постоянным по& током и непрерывно. Это значит, что фаза работы и подачи элюента постоянно сменяется фазой всасывания и наоборот. Насосы этого типа являются или порш& невыми, или мембранными насосами. В обоих насосах подача элюэнта достига& ется периодическим движением поршня в прямом и обратном направлениях. Для предотвращения обратной подачи элюента чаще всего используется клапан с сап& фировым шариком.

Скорость потока в случае мембранного насоса в отличие от поршневого насо& са регулируется не по частоте, а по высоте подъема поршня. Недостаток такой системы в том, что скорость потока также зависит от противодействия системы. Мембранные насосы устойчивы по отношению к агрессивным подвижным сре& дам, так как поршень и поршневая прокладка не контактируют с элюентом, что упрощает проблему уплотнения поршня и повышает надежность работы насоса. Дополнительная зависимость скорости потока от давления в системе требует вы& соких дополнительных затрат на измерение и регулировку потока. Поэтому эти насосы в настоящее время почти не используются.

Сегодня для подачи элюента используются исключительно насосы с корот& ким ходом поршня, у которых элюент вытесняется непосредственно поршнями. Этот метод предъявляет очень высокие требования к уплотнению поршня, и со& ответсвующая прокладка должна рассматриваться как изнашиваемая деталь и время от времени подлежит замене. Поток в системах с насосами с коротким хо& дом поршня регулируют, изменяя частоту хода поршня сохраняя постоянной ве& личину самого хода.

Преимущество однопоршневых насосов непрерывного действия заключается в легкости их промывки и меньшей стоимости по сравнению с много поршневы& ми насосами той же производительности. Это особенно заметно, если принять во внимание, что клапаны надежны в работе только при надлежащем уходе. При циклическом движении одного&единственного поршня получается синусообраз& ный профиль потока, причем половину времени элюент может и не прокачивать& ся, так как в это время поршень должен заполняться элюентом.

Так как такой пульсирующий поток для хроматографической работы совер& шенно не подходит, то устанавливают ассиметричные трансмиссионные шайбы, так называемые кулачки, применяемые для более быстрого заполнения головки насоса элюентом. В положении, показанном на рис. 4.2, поршень подает элюент. Он движется направо и вытесняет растворитель.

В положении P поршень, следуя за вогнутой формой эксцентрика, вернется обратно. Но уже через 200 мс поршень находится в положении P ′ и снова подает элюент.

4.2. Насосы для ВЭЖХ 175

Поршень

Центр вращения

200 мс

Рис. 4.2. Кулачковый механизм

Поток

Время

200 мс

Рис. 4.3. Профиль потока однопоршневого насоса с коротким ходом поршня

Если при этом кулачок имеет форму архимедовой спирали, у которой радиус возрастает линейно с угловой фазой, пройденной кулачком, то во время подачи движение поршня создает постоянный поток элюента. Эксцентрик устроен так, что всасывающая фаза поршня, при которой поток прерывается, составляет только малую долю от фазы подачи элюента. Возникающий при этом профиль потока подвижной фазы представлен на рис. 4.3. Пульсации, возникающие при всасыва& нии элюента, сглаживаются демпферами, устанавливаемыми за поршнем в на& гнетательной линии насоса.

Лучше, но также и дороже применение насосов с двумя головками, которые соединены со смещением по фазе. При этом, в то время как одна головка насоса подает элюент, другая его всасывает (рис. 4.4). В таких двухпоршневых насосах также используют несимметричные эксцентрики, которые поволяют, при пере& ходе подачи от одной головки к другой, избежать прерывания потока, которое возникает вследствие сжатия элюентов. Такая конструкция обеспечивает посто& янную скорость движения поршня в рабочем цикле и тем самым постоянную ско& рость потока элюента без каких&либо максимумов, как это имеет место при сину& соидной форме подачи элюента. Таким образом минимальные пульсации в двух& поршневой системе обеспечиваются использованием двух архимедовых спира& лей, которые антипараллельно ориентированы и прецезионно отъюстированы

176 Глава 4. Высокоэффективная жидкостная (колоночная) хроматография

Подача

Сторона высокого давления

Кулачковый механизм

Двухшариковый клапан

Сторона низкого давления

Забор растворителя

Рис. 4.4. Принцип работы двухпоршневого насоса с коротким ходом поршня

Ход поршня

Угол вращения эксцентрического кулачка

Рис. 4.5. Профиль движения поршней двухпоршневого насоса: А – ускорение; B – постоянное движение; C – задержка; D – заполнение цилиндра

цифровым методом. Рис. 4.5 показывает движения поршней двухпоршневого на& соса. Механическая стабильность насосной системы обеспечивается сокращени& ем числа подвижных частей, поскольку управляемый процессором шаговый мо& тор непосредственно связан с поршнями через кулачковый механизм.

Другой способом добиться постоянства потока заключается в использова& нии насоса, в котором два поршня, также работающих со смещением фаз, под&

4.2. Насосы для ВЭЖХ 177

Сторона высокого давления

Сторона низкого давления

Рис. 4.6. Принцип действия последовательно подключенных насосов

ключаются один за другим. При этом клапанами входа и выхода снабжен только первый поршень. Объем элюента, вытесняеиого вторым поршнем, составляет от половины до четверти объема, вытесняемого первым поршнем. Когда пер& вый поршень всасывает элюент, второй, при закрытом выпускном клапане пер& вого поршня, подает элюент в систему. Когда первая головка начинает подавать элюент, вторая работает на всасывание, так что только разностная потоков пер& вого и второго поршней поступает в систему (рис. 4.6). Преимущество этого типа насосов заключается в экономии на клапанах входа и выхода для второго порш& ня, вследствие чего, наряду с ценой, должна уменьшаться также и вероятность поломок.

Эффективная дегазация подвижной фазы необходима для безупречного фун& кционирования насосов высокого давления. Пузырьки газа в головках насосов или клапанных системах мешают равномерному потоку элюентов и даже могут его прервать. Пузырьки газа в ячейке детектора вызывают шум и ложные сигна& лы. При подаче подвижной фазы из емкости через насос/колонку к детектору может измениться степень насыщения подвижной фазы растворенными газами, и образуются газовые пузырьки. Обычные методы дегазации элюентов – это на& гревание под вакуумом, обработка ультразвуком или вытеснение растворенных газов с помощью малорастворимого инертного газа гелия путем пропускания его

4.3. Градиентное элюирование 179

ные компоненты. Это – основная проблема разделения (рис. 4.7). Для ее решения есть возможность провести хроматографию с градиентом растворителя. Этот ме& тод позволяет растягивать на хроматограмме первые пики и сжимать последние за счет их более быстрого элюирования. Градиент растворителя должен выбираться таким образом, чтобы начальная подвижная фаза была способна элюировать са& мые быстрые пики. Позже состав должен измениться таким образом, чтобы хоро& шо элюировались сильноудерживаемые компоненты. Сила элюирования подвиж& ной фазы должна возрастать во время анализа.

Использование градиентного элюирования в жидкостной хроматографии со& ответствует программированию температуры колонки в газовой хроматографии. В то время как в ГХ изменение подвижной фазы, т.е. газа&носителя, не оказывает никакого влияния на разделение, но на удерживание сорбатов отчетливо влияет температура колонки, в жидкостной хроматографии для этих факторов наблюда& ется противоположный эффект.

Примерно 90% всех систем ВЭЖХ, которые применяются для разработки ме& тодов и сложных разделений, – это градиентные системы. Принципиально их можно разделить на градиенты низкого и высокого давления. Все градиентные систы имеют целью либо смешивать растворители изократически – при этом мож& но легко подобрать соотношение растворителей, соответствущее данной анали& тической проблеме, либо во время анализа изменять состав смеси растворителей для увеличения силы элюирования таким образом, чтобы добиться наилучшего разделения веществ.

Несмотря на то, что в первых приборах для ВЭЖХ градиентные системы были реализованы в виде сообщающихся сосудов, сегодня применяются только про& граммируемые градиентные системы. Микропроцессор обеспечивает управление сложными задачами с незначительными финансовыми издержками и является поэтому неотъемлемой частью системы. По существу есть пять основных требо& ваний, которым должна удовлетворять современная градиентная система:

•приготовление смесей с точно заданным соотношением компонентов,

•незначительные колебания в соотношении компонентов смеси,

•короткое время отклика при задании изменения соотношения компонен& тов смеси,

•постоянная скорость потока и

•легкое обслуживание.

Часто упомянаемый термин «воспроизводимость» здесь сознательно не при& водится. Воспроизводимость обеспечивается автоматически выполнением пер& вых четырех основных требований. Для количественной оценки воспроизводи& мый состав смеси растворителей имеет большее значение, так как он существен& но влияет на времена удержания. При количественном определении по высоте пиков эти величины могут значительно изменяться при одинаковых величинах площади пиков.

Изменение состава растворителей может происходить линейно, линейно с изменением наклона, с отклонением от линейности в положительную или отри& цательную сторону. Несколько примеров формирования градиентов представлены