Бёккер_Хроматография [2009]

260 Глава 4. Высокоэффективная жидкостная (колоночная) хроматография

вопроизводимое создание градиента. Другое препятствие для распространения колонок диаметром 2,1 мм состоит в очень ограниченном ассортименте этих ко& лонок на хроматографическом рынке.

Тем не менее, существует интерес к еще меньшим внутренним диаметрам, т.е. заполненным капиллярам с внутренним диаметром от 0,05 до 0,25 мм, которые в первую очередь должны использоваться в комбинации с масс&спектрометрами или похожими устройствами. Производители колонок должны разработать специаль& ные методы их заполнения, чтобы колонки обладали оптимальной разделяющей способностью. Как следствие внедрения таких колонок можно ожидать улучше& ния всего оборудования для ВЭЖХ.

Возможность комбинирования с масс&спектрометрами – это единственная значимая причина заниматься миниатюризацией колонок. Что касается загряз& нения окружающей среды при утилизации отходов смесей элюентов, то для коло& нок малого диаметра можно ожидать довольно широкий рынок, учитывая мень& шее количество растворителей, необходимых при проведении разделений в ВЭЖХ на этих колонках. В отношении точности создания градиента и достижимых пре& делов обнаружения колонки диаметром около 2 мм могли бы стать разумным ком& промиссом.

Аналогично тенденции к уменьшению диаметра колонок наблюдается мед& ленный тренд к заполнению колонок частицами меньшего размера, чем традици& онно используемые сорбенты с размером частиц 5 мкм. Известно, что колонки, заполненные частицами размером меньше 5 мкм, обладают более высоким разре& шением и требуют меньше времени при анализе. Однако на практике существуют определенные границы, до какого размера могут быть уменьшены размеры час& тиц. Наиболее существенное ограничение связано с приборами, которые имеют& ся сегодны на хроматографическом рынке. Они не пригодны для того, чтобы реа& лизовать разделяющую способность колонок, заполненных частицами размером 3 мкм. Для решения этой проблемы нужно создать приборы с чрезвычайно ма& лым мертвым объемом и очень малым экстраколоночным размыванием. Первые шаги в этом направлении уже сделаны. Но потребуется определенное время, пока станет ворзможно рутинное применение колонок, заполненных адсорбентами с размером частиц от 1 до 2 мкм.

4.11.7. Детекторы

Прогресс в области детекторов в значительной мере зависит от прогресса в обла& сти гибридной техники. К значительным успехам привело комбинирование ВЭЖХ с масс&спектрометрией. Сегодня системы ЖХ/МС применяются для разработки лекарственных препаратов. Гибридизация с другими спектроскопическими ме& тодами находится в стадии развития. Преимущество комбинирования детекторов состоит в том, что оно позволяет получить дополнительную информацию о хи& мической структуре разделяемых соединений.

Все чаще используются УФ детекторы с диодной линейкой. Непосредствен& ным сравнением спектров можно улучшить достоверность качественного анали& за и проверить чистоту наблюдаемых пиков. Обработка данных с помощью спе&

4.11. Выводы 261

циальных программ облегчает стандартизацию анализа и помогает выполнять требования GLP и различных нормативов. Возможно, вследствие этого повысит& ся достоверность анализа. Необходимость или стремление к универсальности раз& личных программ обуславливает высокую сложность и объем систем, которые требуют большой объем оперативной памяти для компьютера.

4.11.8. Системы обработки результатов

Значение использования систем обработки данных в ВЭЖХ анализе постоянно возрастает, особенно с точки зрения достверности результатов. Однозначно на& блюдается тенденция к автоматизации (лабораторные автоматы и роботы). Здесь главную роль, прежде всего, играет экономия финансов, но важно также и улуч& шение воспроизводимости результатов. Правда, издержки на разработку метода и его оптимизацию оправдывает только проведение большого количества одно& типных анализов в течение длительного периода времени.

Значение аналитических результатов в области экономики и общественной жизни привело к новому качественному уровню. Это значит, что формирование аналитических данных должно быть воспроизводимо и достверно. Это отражено в нормах GLP, стандарте ISO 9000 и других законодательных актах. Вместе с тем это означает дополнительные издержки, которые, тем не менее, окупаются оче& видным улучшеннием качества аналитических данных.

Для получения достоверных результатов разделяющую способность ВЭЖХ прибора необходимо регулярно проверять через четко определенные интервалы времени. Кроме того, следует проверять стабильность работы насоса, которая дол& жна давать величину потока с отклонением не более 2%, линейность и правиль& ность длины волн детектора и безупречную работу автодозирующего устройства. Для проведения тестовых процедур существует специальное программное обес& печение [4.51]. Наряду с этим нужно проводить проверку колонок, чтобы удосто& вериться в ее нормальном состоянии. Изменения в слое упакованного сорбента, которые зависят от количества введенных проб и типа матрицы, в которой они находились, сказываются на колебаниях времен удерживания.

4.11.9. Перспективы высокоэффективного анализа

На этот вопрос можно смотреть, естественно, с разных точек зрения. Капилляр& ный электрофорез в различных вариантах будет важным методическим дополне& нием к ВЭЖХ. Его преимущества заключаются в эффективном разделении сме& сей высокомолекулярных и ионных веществ. Различные версии и комбинации ВЭЖХ и КЭ находятся в стадии развития. Вопреки обширным проектно&конст& рукторским работам миниатюризация ВЭЖХ не привела к ожидаемому прорыву. Кажется, что лучшие перспективы здесь имеет КЭ. Если взглянуть в сторону боль& ших количеств, то медленно, но непрерывно все большее значение приобретает препаративная ВЭЖХ или, лучше сказать, промышленная ВЭЖХ. Отчасти раз& витие метода произошло, конечно, независимо от аналитической ВЭЖХ, но все же опыты аналитической ВЭЖХ в значительной мере влились и в промышлен& ную хроматографию.

262 Глава 4. Высокоэффективная жидкостная (колоночная) хроматография

В области селективного и чувствительного детектирования еще приходится констатировать значительное отставание. Приборы с диодной линейкой исполь& зуются в рутинном анализе, и основное напрвление дальнейшего развития лежит здесь в комбинации ВЭЖХ с спектроскопическими методами, в особенности с масс&спектрометрией. Успехов можно ожидать и в области электрохимического детектирования.

Развитие лабораторных автоматов и роботов, вероятно, ускорится. Нужно надеяться, что в области автоматизированной пробоподготовки также будут дос& тигнуты существенные успехи. Стремительное развитие ВЭЖХ как ключевого метода разделения и анализа в самых различных областях применения продол& жится в течение следующих лет и даже в еще более разнообразных формах, чем раньше.

ГЛАВА 5

ТОНКОСЛОЙНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Тонкослойная хроматография (ТСХ) стала известна в 1930 году в качестве так на& зываемой микрохроматографии. Измаилов и Шрайбер использовали ее в 1938 году для разделения экстрактов природных соединений на оксиде алюминия. Рас& цвет тонкослойной хроматографии связан с именем Е. Шталя, который стал ис& пользовать силикагель с определенной внутренней поверхностью. В начале се& мидесятых годов сложилось впечатление, будто быстрые успехи в колоночной жидкостной хроматографии, КЖХ (англ.: Column liquid chromatography, CLC), в частности, в ВЭЖХ, приведут к вытеснению тонкослойной хроматографии. Однако ее название не должно вводить в заблуждение: ТСХ – это такой же ме& тод жидкостной хроматографии, как и ЖКХ. Для нее справедливы те же самые хроматографические условия, что и в ВЭЖХ. С начала 1988 года выходит специ& альный журнал под названием «Планарная хроматография», посвященный ис& ключительно этому методу. С начала восьмидесятых годов, благодаря внедре& нию новых и улучшенных методов работы, популярность ТСХ неуклонно рас& тет [5.1].

Втонкослойной хроматографии (ТСХ, или англ.: TLC = Thin layer chromato& graphy) смеси веществ разделяются путем распределения компонентов между под& вижной жидкой и стационарной фазами, причем процесс разделения в отличие от колоночной хроматографии происходит в открытой системе – плоском слое. Стационарная фаза толщиной примерно 200 мкм находится в большинстве слу& чаев на квадратной ровной пластинке, выполненной, например, из стекла. На нижний край пластинки микропипеткой наносят раствор разделяемой пробы. После испарения растворителя пластинку помещают в камеру для разделения, на дне которой находится подвижная фаза. Подвижная фаза поднимается вверх за счет капиллярных сил, проходит через стартовое пятно и захватывает при этом вещества, которые по&разному удерживаются на пластинке, поскольку они по& разному взаимодействуют со стационарной фазой.

Для подачи подвижной фазы не требуется никакого насоса, и подвижная фаза движется по сухой стационарной фазе просто за счет капиллярных сил. После того как фронт подвижной фазы прошел достаточное расстояние, пластинку дос& тают из камеры и сушат. Разделенные вещества не покидают хроматографичес& кую пластинку и определяются непосредственно на пластинке. Таким образом, речь идет о «внутренней» хроматограмме (т.е. разделенные компоненты остаются внутри стационарной фазы).

ВТСХ применяются те же стационарные фазы и соответствующие элюенты, что и в ВЭЖХ. Таким образом, существуют нормальные фазы с неполярными ра& створителями и обращенные фазы с полярными подвижными фазами. Здесь так& же применяются стационарные фазы с частицами различных размеров. При ис& пользовании частиц размером от 10 до 40 мкм речь идет о нормальной ТСХ, при

264 Глава 5. Тонкослойная хроматография

зернении от 3 до 10 мкм – о высокоэффективной ТСХ (ВЭТСХ) ввиду лучшей эффективности разделения.

ТСХ – это хроматографическая техника анализа, которую едва ли удастся пре& взойти в простоте, скорости и гибкости. Возможность исследовать много проб одновременно при незначительном расходе растворителя делает ее необходимым инструментом в ежедневной рутинной аналитике. Для количественных ТСХ се& годня в распоряжении имеются разнообразные приборы, которые, не в после& днюю очередь из&за возможности автоматизации, находят также широкое прило& жение и в промышленных лабораториях [5.2]. Однако основное использование (примерно на 70%) лежит в области исследований и разработки.

Наряду со многими сходными чертами ТСХ обладает определенными отли& чиями по сравнению с другими хроматографическими методами разделения. Пре& имуществами ТСХ являются:

•одновременное разделение нескольких проб в абсолютно идентичных ус& ловиях;

•подготовка проб часто достаточно проста и некритична;

•результат разделения можно оценить визуально;

•специфическое определение и реакции дериватизации повышают избира& тельность метода;

•низкая стоимость анализов;

•простое и быстрое проведение разделений;

•большая гибкость хроматографических систем;

•хорошая воспроизводимость, поскольку пластинка используется только один раз;

•хроматограмма сохраняется на пластинке, что упрощает оценку результа& тов и их документацию;

•исключение опасности загрязнения благодаря однократному применению пластинки;

•минимальное потребление растворителя.

Особое внимание в ТСХ нужно обращать на то, что разделение в отличие от всех других хроматографических методов протекает в открытой системе. В коло& ночной хроматографии стационарная фаза находится в закрытой системе, кото& рая постоянно омывается подвижной фазой. Обе фазы находятся при этом в рав& новесии: подвижная и стационарная фазы уравновешиваются. При ТСХ хрома& тографическая фаза находится сначала в атмосфере лаборатории. Уже здесь по& верхностный активный слой может адсорбировать вещества из окружающей среды. Только после нанесения пробы стационарную фазу приводят в контакт с элюен& том, и равновесие может не успеть установиться. Практически работают с «от& крытой колонкой», причем окружающая атмосфера влияет на хроматографичес& кое разделение. Величина удерживания может оказаться разной, если, например, атмосфера камеры насыщена парами жидкой фазой (насыщение камеры) или если этого не происходит.

ТСХ в течение последних лет привлекла интерес, прежде всего, в Европе. Это связано с развитием приборостроения и автоматизации тех этапов ТСХ анализа,

Тонкослойная хроматография 265

которые в наибольшей степени подвержены появлению ошибок. Были развиты новые методы разделения, такие как градиентная система и система с принуди& тельным потоком, а также комбинированные приборы с масс&спектрометричес& кой детектированием, которые, конечно, применяются в онлайн&системах, управ& ляемых микропроцессорами. Тем самым удалось заметно уменьшить ручную рабо& ту и устранить основные источники ошибок, что привело к улучшению воспроиз& водимости анализов и повысило привлекательность использования ТСХ/ВЭТСХ на практике.

В семидесятые годы интерес исследователей был преимущественно сконцен& трирован в области совершенствования ВЭЖХ, вследствие чего ТСХ находилась как бы в тени. Новый взлет ТСХ начался из&за возросшей необходимости массо& вых анализов, которые полностью перегрузили бы ВЭЖХ. Массовые анализы встречаются, в частности, в экологическом анализе, в фармацевтической индуст& рии и в пищевой химии. Для большого количества проб ВЭЖХ абсолютно не под& ходит. ВЭЖХ работает последовательно, только одно разделение может прово& диться в данный период времени. Всегда нужно ждать, пока все вещества поки& нут колонку. При ТСХ, напротив, многочисленные пробы могут разделяться од& новременно в одинаковых условиях. Слой сорбента используется только однажды, вследствие этого отсутствует опасность старения или необратимой адсорбции ве& щества на стационарной фазе.

Условием полного использования преимуществ высокой производительнос& ти является автоматизация всех стадий разделения. Между тем техническое осна& щение и целенаправленная автоматизация всех тех рабочих шагов, которые рань& ше были особенно подвержены ошибкам, за последнее время были существенно улучшены. Вместе с тем современная высокоэффективная тонкослойная хрома& тография (ВЭТСХ) не уступает по чувствительности остальным хроматографи& ческим методам.

Из&за небольшой длины слоя, на котором происходит разделение (всего не& сколько сантиметров), ТСХ, в целом, следует считать техникой низкого разреше& ния. Но высокая специфичность детектирования компенсирует этот очевидный недостаток. Кроме того, ассортимент сорбентов был заметно расширен в после& днее время, что позволяет лучше адаптировать хроматографическую систему к по& ставленной задаче, тем более что часто интерес представляет только ограничен& ная область полной хроматограммы. Это, естественно, требует увеличения селек& тивности метода. Для экономии времени и растворителя могут использоваться ВЭТСХ пластинки меньших форматов. При этом, естественно, возникает жела& ние использовать также сорбенты с меньшим размером зерна, тем более что уже коммерчески доступны готовые пластинки с тонкими слоями (100 мкм и 50 мкм). Они успешно применяются в области экологического анализа преимущественно для определения следовых количеств.

Селективность ВЭТСХ связана, с одной стороны, с развитием техники разде& ления, а с другой стороны, с возможностью комбинирования in situ с физически& ми методами измерения и определения. Часто для последующих исследований в распоряжении имеются только частично разделенные пробы. Тонкослойная пла& стинка – это двухмерный накопитель вещества. Следовательно, ТСХ особенно

266 Глава 5. Тонкослойная хроматография

хорошо подходит для идентификации и проверки чистоты, а также для количе& ственного определения выделенных хроматографических пиков. Эти исследова& ния поддерживаются развитием пред& и постколоночных микрохимических ме& тодов идентификации. Они служат, в частности, исследованию физиологическо& го воздействия в нано& и пикограммовой области и приобретают поэтому все бо& лее широкое применение при исследовании метаболитов и в анализе окружающей среды.

Вопрос о том, лучше ли ТСХ, чем другие хроматографические методы, есте& ственно, не возникает. Планарная и колоночная хроматографии дополняют друг друга. Простая методика ТСХ хорошо подходит для новичка в лабораториях, для быстрого контроля хода синтеза и для контроля лекарств в аптеке. Для повышен& ных требований к эффективности и воспроизводимости разделений есть коммер& чески доступные высокопроизводительные системы, устройства нанесения проб, камеры разделения и детекторы, которые сравненимы по своим возможностям с другими методами. Тем не менее, это не секрет, что хотя для успешной практики ТСХ нужен минимум фундаментальных знаний и практического опыта, все же имеется много факторов, которые влияют на разделение в этой «открытой хрома& тографической системе».

5.1. ТСХ анализ

Проведение разделения в тонкослойной хроматографии можно разделить, по су& ществу, на основной этап, факультативный этап и дополнительные мероприятия. Воспроизводимость результатов ТСХ – это существенный аспект, принимая во внимание растущие требования ко всем методам анализов достижения возможно меньшего разброса получаемых значений и правильности результатов. Собствен& но ТСХ анализ всегда состоит из трех шагов:

•нанесение пробы,

•хроматографическое разделение и

•количественная оценка.

К факультативным мероприятиям относят предварительную промывку слоя сорбента, пред& и постхроматографическую дериватзацию и предкондициониро& вание. Во многих случаях эти операции благоприятно сказываются на возможно& стях обнаружения, избирательности, а также и воспроизводимость анализа. До& полнительные мероприятия включают прежде всего оптимизированную для дан& ной задачи пробоподготовку, которая должна выполняться перед нанесением про& бы, а также целенаправленный выбором типа пластинки и растворителя. Составными частями этой процедуры часто являются также проверка разделения в УФ свете и документация хроматограммы.

Очень экономичный по сравнению с ВЭЖХ из&за отсутствия насоса и про& стого нанесения пробы капилляром процесс тонкослойной хроматографии, тем не менее, больше не удовлетворяет высоким требованиям современной инстру& ментальной аналитики. Приобретение эффективного устройства для обработки и количественной оценки данных ТСХ, денситометра и периферии, соответству&

268 Глава 5. Тонкослойная хроматография

ственно полученного активного силикагеля (называемого также кизульгуром) величины до 850 м2/г [5.4]. Его получают из жидкого стекла осаждением серной кислотой, причем условия осаждения и обработки придают силикагелю его спе& цифические свойства. Тщательное соблюдение условий изготовления и последу& ющего дробления и просеивания силикагеля исключительно важны для единооб& разия отдельных партий кизельгура. Изменение гранулометрического состава иногда ведет к сильным колебаниям результатов разделений.

Преобладающая часть всех разделений проводится на силикагеле. При этом речь идет о пористом, аморфном порошке с диаметром пор от 50 до 100 Е. Его поверхность содержит Si–OH группы, которые способны образовывать водород& ные мостики друг с другом или с полярными веществами. Наибольшее количе& ство доступных Si–OH групп и, вместе с тем, наивысшей активностью обладает силикагель, активированный при 150 °C. При такой обработке он теряет адсорби& рованную воду и имеет от 4 до 6 Si–OH групп на 10 нм2.

Адсорбционная хроматография использует немодифицированный силикагель. Удерживание аналитов происходит преимущественно при взаимодействии их по& лярных групп с силанольными группами на поверхности кремния. Полярные ана& литы могут вступать в сильные взаимодействии с поверхностью силикагеля, из& за чего могут возникать плохо разделенные зоны. Поэтому адсорбционная хрома& тография применяется для умеренно полярных растворимых в органических ра& створителях веществ. Типичным недостатком адсорбционной хроматографии является сильное влияние на разделение следов воды в растворителе. Вода адсор& бируется на поверхности силикагеля и деактивирует силанольные группы.

То, что силикагели разных производителей имеют различную разделяющую способность, связано с разным зернением, разной величиной поверхности, раз& ным типом силанольных групп, а также формой частиц и размером пор. Коммер& чески доступные силикагели имеют частицы либо сферической, либо нерегуляр& ной формы. Силикагель нерегулярной формы получают из крупнозернистого ма& териала дроблением, рассеиванием на ситах и в воздушном классификаторе, что существенно удешевляет получение. Сферический силикагель получают в резуль& тате специальных дорогостоящих процессов. Сферические частицы позволяют лучше сформировать разделяющий слой, однако это преимущество можно реа& лизовать, только если распределение частиц по размерам находится в возможно более узком диапазоне.

5.2.1.2. Оксид алюминия

Наряду с силикагелем предлагаются пластинки с Al2O3. Следует обратить вни& мание, что в продаже есть кислый, нейтральный, а также основный оксид алю& миния. Производство таких оксидов алюминия происходит путем дегидратации гидроксида алюминия. После обезвоживания оксид нужно как можно быстрее герметично расфасовывать. Оксиды алюминия являются высокоактивными сор& бентами. Тем не менее, они очень быстро теряют активность, если контактиру& ют с влагой из воздуха. Для разделения в основном используются неполярные растворители, так что преимущественно речь идет об адсорбционной хромато& графии.

5.2. Стационарные фазы (сорбенты) 269

5.2.1.3. Целлюлоза

ТСХ на целлюлозе как продолжение бумажной хроматографии особенно подхо& дит для полярных веществ (углеводов, карбоновых кислот). В качестве сорбентов служат естественная или микрокристаллическая целлюлоза в форме волокна. Не& модифицированный порошок целлюлозы применяется только для качественных разделений и очистки. В большинстве случаев используются ацетилпроизводные целлюлозы с разной степенью ацетилирования. С ростом степени этерификации гидрофобные качества возрастают. Тем не менее, выбор растворителя сильно су& жен из&за растворимости ацетилцеллюлозы. Целлюлоза может применяться так& же в виде диэтиламиноацетилцеллюлоза или полиэтилениминцеллюлоза как ани& онообменный сорбент для ТСХ разделения, например, нуклеиновых кислот [5.5].

5.2.1.4. Полиамид

Полиамид как стационарная фаза применяется преимущественно для разделе& ния производных фенола, но на нем могут быть успешно разделены также амино& кислоты и полициклические ароматические углеводороды. Между фенольными гидроксильными и амидными группами образуются водородные связи. Также водородными мостиками связываются с полиамдной фазой и карбоновые кисло& ты. Сродство к полиамиду у монокарбоновых кислот выражено достаточно сла& бо, но у дикарбоновых кислот и ароматических кислот оно выражено значитель& но сильнее.

В качестве стандартных носителей предлагаются полиамиды типа перлона и нейлона. Перлон – это поликапролактам (полиамид 6), нейлон – полигексаме& тилендиаминадипинат (полиамид 66). Вследствие сшивок, образующихся за счет водородных мостиков, они довольно трудно растворимы в гидрофильных раство& рителях, однако еще способны к набуханию. Полиамид применяется для выделе& ния и структурного анализа различных фенольных природных соединений. На& ряду с количеством и положением гидроксильных групп в ароматическом соеди& нении на сродство фенола к полиамиду значительно влияет использованный ра& створитель. В зависимости от способности растворителя конкурировать с фенолом за образование водородных связей и от его сродства к веществу, адсорбированно& му полиамидом, может происходить быстрая десорбция вещества.

На полиамиде можно разделять также многочисленные нитроароматические производные. Взаимодействие нитропроизводных с полиамидом соответствует реакции льюисовых кислоты и основания, поэтому разделение нитроаромати& ческих веществ может рассматриваться как ионный обмен. Однако узкие зоны вещества получаются только при использовании в качестве элюента буферных растворов.

5.2.1.5. Обращеннофазовая ТСХ

Алкилирование силанольных групп силикагеля приводит к так называемым об& ращенным фазам. В то время как в нормальной ТСХ стационарная фаза всегда является более полярной, чем подвижная фаза, у обращенных фаз это соотноше& ние обращается. При этом гидрофобность растет с ростом длины углеводородных