Бёккер_Хроматография [2009]

190 Глава 4. Высокоэффективная жидкостная (колоночная) хроматография

таким образом, что полярные группы молекулы направлены преимущественно к полярной стационарной фазе и взаимодействуют с ней.

В качестве элюентов используют гексан, гептан, метиленхлорид, уксусный эфир или их смеси. Из этого сразу вытекает ограничение для анализируемых проб: они должны быть не только растворимы в этих неполярных элюентах, но и нахо& диться уже растворенными в этих неполярных растворителях. В неполярных ра& створителях разделяются преимущественно неполярные органические вещества. Полярные соединения, даже если они растворимы в элюентах, могут сильно вза& имодействовать с поверхностью силикагеля, что приводит к пикам плохой фор& мы или элюирование вообще не происходит. Поэтому нормальнофазовая хрома& тография применяется для умереннополярных проб, растворимых в органичес& ких растворителях.

Типичным недостатком адсорбционной хроматографии является сильное вли& яние следов воды в элюентах. Вода адсорбируется на поверхности силикагеля и дезактивирует силанольные группы, вследствие чего удерживание уменьшается. Поэтому используемые колонки нужно часто регенерировать (сушить).

4.5.2. Химически привитые полярные фазы

Под понятием «полярные или гидрофильные привитые стационарной фазы» по& нимают, в общем случае, силикагель, поверхность которого модифицирована по& лярными функциональными группами. Так же, как немодифицированный сили& кагель, эти сорбенты могут использоваться в нормальнофазовом режиме, причем они показывают обычно разную селективность. Они менее чувствительны к сле& дам воды в подвижной фазе.

Это свойство делает их интересной альтернативой силикагелю. Они могут успешно применяться в адсорбционной хроматографии, в обращеннофазовой хроматографии и в ионообменной хроматографии [4.8]. В качестве функциональных групп для по& лярные привитых фаз предлагаются группы, представленные в табл. 4.1.

Таблица 4.1. Различные полярные привитые фазы

Гидрофильные привитые стационарные фазы предлагают интересную альтер& нативу для решения проблем ВЭЖХ. При использовании подходящих элюентов на этих модифицированных сорбентах могут действовать различные механизмы удерживания и, вследствие этого, проявляться особые эффекты разделения. Преж& де всего, эти носители могут успешно применяться для разделения заряженных и среднеполярных соединений.

4.5. Колонки для ВЭЖХ 191

4.5.2.1. Диольная фаза

Наряду с широко распространенным применением в гельпроникающей хроматогра& фии диольная фаза, прежде всего, используется при решении проблем разделения в адсорбционной хроматографии. Благодаря модификации эта фаза ведет себя подоб& но немодифицированному силикагелю, однако с отчетливо сниженной активнос& тью. Диольные группы образуют в основном активные центры для адсорбционной хроматографии. Основной тип взаимодействий с хроматографируемыми соединени& ями – это образование водородных связей и индуцированные диполь&дипольные вза& имодействия. Удерживание молекул пробы может варьироваться благодаря направ& ленному изменению полярности органической подвижной фазы. Подобно немоди& фицированному силикагелю величины k′ уменьшаются с ростом полярности элюен& тов. Это может быть объяснено тем, что с ростом содержания полярного компонента в подвижной фазе активные полярные молекулы растворителя занимают все больше активных мест на поверхности сорбента, предназначенных для хроматографии, и, тем самым, уменьшают взаимодействие с ними молекул пробы.

Если рассматривают последовательность удерживания сорбатов на диольной фазе в адсорбционной хроматографии, то всегда вещество с наименьшей поляр& ностью удерживается слабее всего, а с наивысшей полярностью – сильнее всего.

4.5.2.2.NH2 фаза

Уэтой стационарной фазы γ&аминопропильные группы ковалентно привязаны к поверхности силикагеля. Однако колонки с аминофазой на основе силикагеля лишь ограниченно устойчивы, так как, вероятно, происходит гидролиз частиц. Это проявляется в непрерывно уменьшающемся времени удерживания сорбатов в рутинной работе. В качестве носителей лучше подходят ПВА сополимеры, ко& торые очень устойчивы механически и химически. Благодаря химической моди& фикации эта стационарная фаза может взаимодействовать с молекулами пробы самыми разными способами. В нормальнофазовой хроматографии с гексаном, дихлорметаном и изопропанолом в качестве подвижной фазы разделяются по& лярные соединения, как, например, сложные эфиры, замещенные анилины и хло& рированные пестициды. Как на слабом анионообменнике, на аминофазе могут разделяться анионы и органические кислоты, для чего применяется обычно аце& татный или фосфатный буфер с добавлением органических растворителей.

Это означает, что при соответствующем выборе растворителей удерживание разделяемых соединений вызывается различными механизмами. Если применя& ются чисто органические элюенты, существует возможность адсорбционно&хро&

матографического разделения. В этом случае NH2 группа действует как незаря& женный, полярный, слабоосновный адсорбционный центр.

Намного чаще аминофазы используются в сочетании с водными элюентами. Примером тому являются разделение моно& и олигосахаридов с водно&ацетонит& рильными системами. Однако при использовании водных растворителей нужно учитывать, что аминогруппы существуют в протонированной форме. Это ведет к тому, что аминофаза действует в таких хроматографических условиях, как слабо& основный ионообменный сорбент. Поэтому ионообменная хроматография явля& ется основной областью применения аминофаз.

192 Глава 4. Высокоэффективная жидкостная (колоночная) хроматография

Сорбаты удерживаются в этом варианте хроматографии из&за различия в элек& тростатических взаимодействиях и очень во многих случаях в соответствии с ве& личиной их заряда. На NH2 фазе, как в обычной ионообменной хроматографии, можно очень просто целенаправленно изменять удерживание компонентов про& бы, варьируя содержание соли в подвижной фазе. С ростом содержания соли в элюентах удерживание веществ пробы уменьшается. Это объясняется тем, что добавленные в элюент ионы конкурируют с ионами пробы за ионогенные группы стационарной фазы.

С ростом концентрации соли в элюенте функциональные группы ионообмен& ного сорбента все в большей стпени экранируются и в меньшей мере взаимодей& ствовуют с ионами пробы. Незаряженные соединения, в общем случае, удержи& ваются на аминофазе довольно слабо. Содержание соли в элюентах мало или вов& се не влияет на их удерживание.

4.5.2.3. CN фаза

Цианофаза представляет особенно интересную стационарную фазу в ВЭЖХ в рам& ках гидрофильно модифицированных сорбентов. Среднеполярная стационарная фаза образуется химической прививкой γ&цианопропильных групп на поверхности силикагеля. В соответствии с выбором подвижной фазы этот сорбент может успешно применяться как для нормальнофазовой, так и для обращеннофазовой хроматог& рафии. В нормальнофазовой хроматографии с относительно неполярными раство& рителями CN фаза разделяет многие соединения, которые могут разделяться также и на немодифицированном силикагеле. Преимущество этого сорбента – быстрое установление равновесия при градиентном элюировании.

При использовании неполярных элюентов (например, изооктана) сильнее всего удерживаются самые полярные вещества. С увеличением полярного харак& тера элюента при добавлении диоксана соединения удерживаются все меньше до полного прекращения удерживания. Только добавлением воды к растворителю (дальнейшее повышение полярности) разделение становится снова возможным. Разумеется, теперь ряд последовательности элюции обратится, и самые поляр& ные соединения удерживаются слабее всего. Повышение содержания воды в под& вижной фазе вызывает дальнейший рост величины k′. Это – известный феномен в обращеннофазовой хроматографии. CN фаза особенно подходит для разделе& ния среднеполярных соединений.

4.5.3. Обращеннофазовая хроматография

Как видно уже из названия, здесь работают с противоположным соотношением полярностей, т.е. стационарная фаза – неполярная, а подвижная фаза – полярная. В этом случае силикагель модифицируется химически. Обращенные фазы получают, если поверхность силикагеля покрывают гидрофобными функциональными груп& пами. Стабильнее всего соединения, в которых функциональная группа связана че& рез ковалентную связь Si–C, которая химически стабильна в области pH от 1 до 9. Наибольшое количество разделений в аналитике проводится в ВЭЖХ с модифици& рованными стационарными фазами. В зависимости от вида функциональной груп& пы для обозначения колонок используют сокращения, указанные в табл. 4.2.

4.5. Колонки для ВЭЖХ 195

Хотя привитые на поверхность силикагеля фазы представляют собой моно& мерный органический слой, они отличаются высокой поверхностной концентра& цией функциональных групп. Она составляет от 3 до 4 функциональных групп на 100 A2. Так как привитой фазой невозможно закрыть абсолютно все силанольные группы, то различные производители пытаются осуществлять в дополнительной стадии модификации так называемое дозакрытие (англ. «endcapping»), чтобы мо& дифицировать оставшиеся после первой обработки силанольные группы. Цель состоит в уменьшении активных центров на поверхности путем перевода актив& ных силанольных групп в индифферентные группы. Пожалуй, наиболее широко используемым реагентом для дозакрытия является триметилхлорсилан.

Различные стадии модификации силикагеля представлены на рис. 4.18. Часть а) показывает поверхность немодифицированного силикагеля. Поверхностные си&

Рис. 4.18. Типы модификации силикагеля

196 Глава 4. Высокоэффективная жидкостная (колоночная) хроматография

ланольные группы «активны» и вступают во взаимодействие с ионными и поляр& ными соединениями. Часть б) показывает модифицированный, привитой сили& кагель. Однако преобразование поверхностей никогда не может быть полным. На поверхности остается много активных силанольных групп. Часть в) показывает процесс дозакрытия. Маленькие нейтральные группы прививаются к большин& ству из оставшихся силанольных групп, чтобы уменьшить активность поверхнос& ти силикагеля. Часть г) показывает процесс «старения» колонок с обращенной фазой. В принципе, силикагельная основа, к которой привиты все фазы, неста& бильна. Силикагель растворяется при повышенных величинах pH (до кремние& вой кислоты) и подвергается разрушению также при нейтральных pH в водной среде. Из&за медленного, но непрерывного растворения кремниевой подложки свободные силанольные группы снова становятся все более и более доступными. Активность поверхности снова повышается. Это выражается в уменьшении вре& мени удерживания до тех пор, пока колонку, наконец, нужно будет заменить.

Поэтому в последнее время как носитель для химически привязанных фаз стал использоваться сополимер поливинилового спирта. Все же первоначально разде& ляющая способность колонок на полимерной основе была значительно хуже, чем разделительная способность колонок на основе силикагеля. Но дальнейшее раз& витие принесло свои поды. На сферических частицах сополимера поливинило& вого спирта была достигнута высокая плотность ковалентно привитых углеводо& родных цепей. Сегодня хроматографическое поведение этих фаз практически срав& нимо с обычными ОФ колонками. Гидрофильные частицы не имеют проблем со свободными силанольными группами и микропорами. Ковалентная связь между полимерными частицами и алкильными группами делает возможным использо& вание сильнощелочных буферов до величины pH примерно 13. Напротив, приви& тые фазы на основе силикагеля становятся нестабильными выше pH 7.

Колонки с обращенной фазой лучше подходят для решения широкого круга задач, чем колонки какого%либо другого типа. Для анализа неизвестного вещества сначала проводят пробное разделение на обращеннофазовой колонке.

4.5.4. Эксклюзионная хроматография

Эксклюзионная хроматография (англ.: Size exclusion chromatography, SEC) – это метод жидкостной хроматографии, который позволяет анализ молекул в области олигомеров и полимеров. При использовании органических элюентов метод ста& новится также гельфильтрационной хроматографией (ГФХ, англ.: GFC), а при вод& ных элюентах – упомянутой гельпроникающей хроматографией (англ. GPC). При этом большие молекулы пробы разделяются согласно эффективному размеру в ра& створе. Основное преимущество эксклюзионной хроматографии состоит в возмож& ности на основании предсказываемых времен удержания определять распределе& ние молекулярных масс в области примерно от 102 до 107 Da. Можно разделять сме& си компонентов, отличие молекулярных масс которых составляет около 10%.

Большинство полимеров представляет собой смесь из молекул с различными молекулярными массами и молекулярными размерами. Эта смесь характеризует&

4.5. Колонки для ВЭЖХ 199

У молекулы пробы, которые слишком велики, чтобы проникать в поры, есть только объем между отдельными шариками: они исключаются и должны искать себе путь между шариками в колонке. Так как шарики не входят с ними ни в какое взаимодействие, эти молекулы проходят колонку по наиболее короткому пути и элюируются из колонки вместе с подвижной фазой.

Напротив, если в пробе имеются молекулы, которые, благодаря своим малым размерам, могут проникать в поры, то в их распоряжении весь объем подвижной фазы. Так как подвижная фаза в порах неподвижна, то молекулы двигаются в по& рах только за счет диффузии и будут задерживаться по сравнению с исключенны& ми молекулами. Они последними появятся в детекторе, а именно с задержкой, точно равной мертвому времени системы, которое известно из других методов колоночной хроматографии. Сам растворитель не вступает во взаимодействие со стационарной фазой, но тем не менее проходит по всем порам. Поэтому в любом другом методе колоночной хроматографии молекулы растворителя первыми ока& жутся в детекторе. В эксклюзионной хроматографии такие маленькие молекулы как молекулы растворителя будут выходить последними. Они полностью прони& кают в стационарную фазу. Называют это «полным проникновением» (англ. totale penetration). Каждый компонент будет выходить из колонки самое позднее через мертвое время.

Молекулы средней величины не могут проникать в самые узкие поры. Они только частично проникают в стационарную фазу. Занимаемый ими объем нахо& дится между объемом «полного проникновения» и мертвым объемом. Они элюи& руются после «исключенных» молекул, но раньше «мертвого времени».

Если хотят знать, какому объему элюции следует отнести молекулы опреде& ленной величины, то колонку калибруют по тестовой смеси стандартных веществ с точно известными молекулярными массами. В результате получают примерно линейное соотношение между логарифмом молекулярной массы и объемом элю& ирования. Как стандарты при разделении полимеров, растворимых в органичес& ких растворителях, применяют преимущественно полистиролы, а для полимеров растворимых в воде – декстраны, которые имеют различные, но точно известные молекулярные массы. Рис. 4.21 показывает хроматограмму олигомеров стирола с n = от 1 до 14.

Крайний пик справа пренадлежит мономеру стирола. Это – самая маленькая молекула (наряду с молекулами подвижной фазы) и она будет элюироваться пос& ледней. Соответствующий объем элюирования – это мертвый объем V0, первый маленький пик слева принадлежит исключенным молекулам. Соответствующий объем – это межгранульный объем Vz, (жидкость, которая находится между от& дельными шариками стационарной фазы). Между Vz и V0 элюируются молекулы со степенью полимеризации n от 14 до 1. Объем V0–Vz соответствует объему пор стационарной фазы Vp (жидкость, которая находится в порах). Vp – это единствен& ный полезный для разделения объем и поэтому он должен быть как можно боль& ше, так как разрешение пиков зависит от Vp.

Если теперь хотят охарактеризовать неизвестную фракцию или определить молекулярно&массовое распределение полимера, то сравнивают хроматограмму пробы с калибровочной кривой. Так как объем элюирования соответствует раз&