Биохимия.

Биохимических изменений, имеющих диагностическую ценность, ни при ПЛК, ни при парвовирозах собак не развивается. Как и при ряде других патологических состояний, увеличивается активность АЛТ, ЛДГ и АСТ, умеренно повышается уровень билирубина. Сывороточные протеины при не осложненных формах болезни остаются в норме. При осложненной дегидратацией форме, естественно, наступает гипопротеинемия, особенно при проведении симптоматического лечения регидратирующими препаратами и процедурами.

Единственный парвовироз, дающий совершенно характерные изменения – это Алеутская болезнь при которой патогномоническим признаком является гипергаммаглобулинимия, причем настолько резко выраженная, что концентрация гамма глобулина может превысить концентрацию альбумина.

Серология и вирусовыделение.

Серологическое диагностическое исследование можно провести в специально оборудованной лаборатории. Наиболее надежным тестом является реакция нейтрализации вируса в культуре клеток. Она проводится как в ходе ретроспективного серологического исследования, так и с предварительным вирусовыделением - для типирования выделенного агента. После вирусовыделения весьма ценно в диагностическом плане выявление телец включения в ядрах зараженных клеток или клеток биопсийных материалов. При использовании вирусовыделения различных парвовирусов плотоядных имеются некоторые особенности. Вирус ПЛК легко выделить используя, например, первично трипсинизированные культуры эмбриональной почки котенка. А вирус энтерита норок не обладает ярко выраженным цитопатическим действием в культуре клеток и не выделяется с использованием лабораторных животных.

Постановку конкретного диагноза существенно затрудняет наличие антигенных перекрестов между парвовирусами плотоядных, возможность инфицирования, например кошек собачьими вирусами или наоборот, а также то, что обычно животные подвергаются неоднократным инфицированиям, возможно различными штаммами разного происхождения. Однозначный ответ на вопрос, каким точно парвовирусом плотоядных произошло инфицирование, можно получить только с использованием нуклеотидных зондов, если удалось вирус выделить или получить вируссодержащий патматериал, либо с использованием моноклональных антител.

Получение моноклональных антител и их использование в диагностике.

Моноклональные антитела представляют собой иммуноглобулины, синтезируемые одним клоном В-лимфоцитов. Метод был предложен впервые в 1975 году G. Koller, C. Milstein (242)(81). Он состоит в слиянии сенсибилизированных иммунных лимфоцитов с клетками миеломы для получения клеточных гибридом. Для этого мышей иммунизируют антигеном, его чистота в данном случае несущественна. По окончании срока иммунизации из селезенок мышей выделяют спленоциты. Их слияние с клетками миеломы дефектными по гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазе (ГГФРТ) индуцируется полиэтиленгликолем.

Получение МАт обеспечило создание мощного и тонкого инструмента исследований практически во всех областях биологии. МАт используют для анализа сложных смесей антигенных молекул, картирования поверхности белка, определения клеточных поверхностных антигенов и локализации молекул внутри клеток или тканей. Капсид парвовируса собак имеет диаметр 25 нм, собран из 60 копий белков VP1 и VP2. С использованием набора из 28 МАТ, специфичных к капсидным антигенным детерминантам различных парвовирусов, показано, что основное влияние на активность нейтрализующих антител оказывают два участка на тройных шипах капсида. Один расположен на наконечнике шипа, второй ассоциирован с областью около аминокислотного остатка 300 белка VP2. Показано, что МАт к тому и другому антигенному участкам эффективно нейтрализуют инфекционность и гемагглютинирующую активность вируса.

Уникальная специфичность МАт дает возможность использовать их в различных областях диагностики, где ранее применяли поликлональные антисыворотки. МАт применяют при изучении иммунного ответа организма на инфекционные агенты, а также при разработке вакцин.

Благодаря высокой специфичности, гомогенности и стабильности МАт применяют в качестве диагностических средств в ветеринарной науке и практике. Используются моноклональные антитела и для диагностики парвовирусных инфекций собак. Д-ром Rimmelzwaan с коллегами был получен ряд мышиных МАт против собачьего парвовируса, которые использовали в иммуноферментном анализе для обнаружения вирусного антигена в фекалиях, тканях и органах собак и специфичных к нему антител в сыворотках крови. Определили, что эти методы более чувствительны и более специфичны, чем способы обнаружения вирусного антигена и антител с помощью РТГА. Это же преимущество доказали и Mildbrand M.M., Teramoto Y.A., Collins I.K..

1. ПРИЛОЖЕНИЕ.

2. 1.Сведения по антигенной гетерогенности штаммов парвовирусов плотоядных, циркулирующих в России в настоящее время.

Общеизвестным фактом является то, что с использованием поликлональных антител не удается качественно различить различные штаммы парвовирусов плотоядных. Данные по этому вопросу возможно получить только в серологических реакциях с применением моноклональных антител.

Далее в этом разделе приведены данные по изучению антигенной гетерогенности парвовирусов плотоядных, полученные в совместной работе сотрудников двух институтов: ВНИИВВиМ (Покров) и ВГНКИ (Москва).

В следующей таблице приведены результаты определения антигенных перекрестов между различными штаммами парвовирусов плотоядных животных, свиней и птиц.

Из представленных в таблице данных видно, что некоторые консервативные эпитопы присутствуют на поверхности вирионов всех парвовирусов плотоядных, например эпитоп, соответствующий моноклональным антителам 1D8 и 1D3. Установлено, что эти моноклональные антитела активны в РЗГА и обладают в данной реакции таким же спектром специфичности. Ни один из взятых в качестве контроля штаммов парвовирусов плотоядных такого эпитопа не имел.

Таблица 7.

Результаты определения наличия эпитопов к которым специфичны использованные моноклональные антитела в составе вирионов различных штаммов и изолятов парвовирусов.

Штамм (изолят) парвовируса	Название моноклонального антитела и определение наличия соответствующего эпитопа на вирионах парвовирусов в ТФ ИФА
	1F3	1E7	4H6	2D6	2D12	2B12	1D8	1D3
Штамм Родники вируса энтерита норок	+	+	+	+	+	+	+	+
Изолят вируса энтерита собак К3	+	+	+	+	+	+	+	+
Штамм вируса энтерита собак ИЗ-4	+	+	+	+	+	+	+	+
Изолят вируса энтерита собак К1	+	+	+	+	-	+	+	+
Штамм Береговой вируса энтерита норок	+	+	+	+	+	_	+	+
Изолят вируса энтерита собак К2	_	_	_	_	+	+	+	+
Изолят вируса энтерита собак МВ	_	_	_	_	+	+	+	+
Изолят вируса энтерита собак КВ	_	+	+	_	+	+	+	+
Вирус панлейкопении кошек штамм ПВ	_	_	_	+	_	_	+	+
Парвовирус энтерита гусей штамм "Клон 6"	_	_	_	_	_	_	_	_
Парвовирус энтерита гусей Лив-22	_	_	_	_	_	_	_	_
Парвовирус свиней	_	_	_	_	_	_	_	_

Эпитопы, соответствующие другим моноклональным антителам имелись не у всех штаммов парвовирусов плотоядных, но ни один из них так же не был обнаружен у парвовирусов других животных и птиц. В таблице вирусные штаммы и изоляты выстроены в ряд "иммунологического родства": вверху – штаммы, которые имеют все эпитопы, внизу – те которые имеют минимум из этих эпитопов. Из представленных в таблице данных видно, что Штамм Родники вируса энтерита норок, Изолят вируса энтерита собак К3 и Штамм вируса энтерита собак ИЗ-4 составляют одну антигенную подгруппу, Изолят вируса энтерита собак К2, Изолят вируса энтерита собак МВ, Изолят вируса энтерита собак КВ и Вирус панлейкопении кошек штамм ПВ составляют другую антигенную подгруппу, а Изолят вируса энтерита собак К1 и Штамм Береговой вируса энтерита норок занимают промежуточное положение между этими подгруппами.

В то же самое время все эти штаммы имеют общие антигенные эпитопы. Следовательно, актуальные, циркулирующие на территории России штаммы парвовирусов плотоядных в некоторой степени антигенно родственны, но в то же время имеют и различия в антигенной структуре, позволяющие разбить их на две антигенные подгруппы. С этой точки зрения очевидно, что и "идеальная" вакцина против парвовирозов плотоядных должна включать в себя минимум два вирусных штамма, относящихся к разным подгруппам, а вакцины из иных штаммов будут не одинаково эффективны в случае заражения вакцинированных животных разными вирулентными вирусными штаммами

.